白脂素對高濃度葡萄糖誘導心肌細胞損傷的保護作用及機制

張雅楠，李浩東，章芯怡，韓 杰，黃起壬

(1.江西省基礎藥理學重點實驗室；2.南昌大學藥學院a.藥理學教研室；b.2018級，南昌 330006)

糖尿病是一種發病率和病死率僅次于癌癥和心血管病的第三大疾病[1]。糖尿病的晚期伴有糖尿病神經病變、糖尿病腎病、糖尿病心肌病(DCM)等多種并發癥。DCM是最終造成糖尿病患者嚴重死亡的主要原因[2]。1972年RUBLER等[3]首次發現DCM是心臟疾病的一種特殊形式，在患有缺血性或高血壓性心臟病的糖尿病患者中較為常見，主要表現為心臟結構和功能異常[4]。

白脂素(ASP)是由FBN1(Fibrillin-1)的最末端2個外顯子編碼的一種新型糖原蛋白激素，主要存在于人體的白色脂肪組織中，由白色脂肪細胞分泌而來[5]，肌原纖維蛋白前體C端剪切位點是該激素起作用的主要部位。有研究[6-7]表明ASP可以有效調節人體血糖，具有增強食欲和消炎等作用。ASP一方面能夠和人體肝臟細胞外周表面的受體相互結合，刺激人體肝臟細胞內的葡萄糖分泌，直接導致血糖值上升；另一方面，ASP可以穿過血腦屏障，直接激活與下丘腦中樞攝食功能相關的AgRP+神經元，并進一步地抑制與厭食功能相關的神經元的活性，促進攝食活動，間接地發揮了升高血糖的作用[8]。GROENER等[9]發現，1型糖尿病患者出現低血糖時，血漿ASP水平明顯升高，其與1型糖尿病的胰島素抵抗作用有關。LEE等[10]也發現，ASP可通過TLR4/JNK介導的炎癥反應影響胰島素對葡萄糖的作用效果。既往研究[11]表明ASP可作為預測急性冠脈綜合征(ACS)伴不穩定型心絞痛嚴重程度的新型生化標志物。ASP在無氧運動的情況下分泌增多[12]，因此推測ASP可能對DCM也有影響。目前ASP與DCM之間關系的研究較少，有研究[13-14]表明體內攝入過多的葡萄糖，血糖濃度增高會使心肌細胞受到嚴重的損傷。因此，本文通過高濃度葡萄糖(HG)誘導心肌細胞損傷并予ASP干預，探討ASP在HG誘導的心肌細胞損傷中的作用，期望為臨床診治DCM提供實驗依據。

1 材料

1.1 細胞株及血清培養基

H9C2細胞株購自美國ATCC(Catalog No:CRL1730)；胎牛血清購自天津海碩源科技有限公司；DMEM/f12培養基購自美國Hyclone公司。

1.2 藥品及試劑

ASP購自上海強耀生物科技有限公司，葡萄糖購自美國SIGMA公司，乳酸脫氫酶(LDH)及丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，SOD兔多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，GSH-PX兔多克隆抗體購自杭州華安生物技術有限公司，GAPDH鼠多克隆抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司。

2 實驗分組及方法

2.1 HG誘導心肌損傷模型的建立

將H9C2細胞均勻接種于100 mm的細胞培養板上，隨機分為Ctrl組和HG組，HG組設立不同的葡萄糖濃度組，每組細胞培養基的葡萄糖終濃度分別為20、30、40、50和60 mmol·L-1，處理24 h后，通過MTS檢測H9C2的存活率，收集細胞上清液檢測LDH活力，確定最適合的葡萄糖濃度，建立HG誘導損傷模型，以進行后續實驗。

2.2 ASP對細胞活力的影響觀察

將H9C2細胞均勻接種于96孔板上，當細胞鋪滿培養板80%后將細胞隨機分為Ctrl組、HG組(50 mmol·L-1)、Ctrl+ASP(20 nmol·L-1)組和HG+ASP組，用葡萄糖濃度為50 mmol·L-1的完全培養基對HG組和HG+ASP組進行處理36 h，Ctrl組和Ctrl+ASP組則用葡萄糖濃度為5.5 mmol·L-1完全培養基同步處理36 h；36 h后將各組培養基均換成正常葡萄糖濃度的完全培養基；除Ctrl組和HG組外，其余2組分別加入20 nmol·L-1的ASP繼續培養24 h，處理結束后通過CCK8檢測細胞存活率，觀察細胞活性變化。

2.3 ASP對LDH活性、MDA含量、SOD和GSH-PX活性的影響觀察

2.3.1 LDH活性檢測

將細胞均勻接種于100 mm培養皿中，同上分組處理后，取各組上清液進行檢測，LDH活性檢測采用微板法，首先實驗設置空白孔、標準孔、測定孔和對照孔，在空白孔里面加入25 μL的雙蒸水、標準孔里面加入25 μL濃度為0.2 μmol·mL-1的丙酮酸標準液，測定孔和對照孔里面則先分別加入5 μL的雙蒸水后，再根據實驗分組的不同分別加入20 μL樣本，隨后在所有孔內加入25 μL的基質緩沖液，最后單獨在測定孔中加入5 μL輔酶，混勻，置于37 ℃的水浴鍋中溫浴15 min；隨后在所有孔里面分別加入25 μL 2,4-二硝基苯肼，混勻，放在37 ℃的水浴鍋中反應15 min；結束后在各孔中加入250 μL 0.4 mmol·L-1的NaOH溶液，混勻，室溫放置5 min，將各孔溶液轉移100 μL至96孔板中并將96孔板置于酶標儀上，設置檢測波長為450 nm，得到吸光度值后，根據吸光度值計算出各組活性。

2.3.2 MDA含量測定

收集各組上清液后采用TBA法進行檢測，實驗設置空白管、標準管、測定管和對照管，按照實驗及分組要求，取離心管標記好后，首先在空白管中加100 μL的無水乙醇，標準管中加入與空白管等量的濃度為10 nmol·L-1的標準品，測定管和對照管根據細胞實驗分組的不同分別加入與空白管等量的樣本，然后在所有管中加入100 μL蛋白澄清劑，顛倒混勻后，在所有管中加入酸緩沖液3 mL，在對照管中加50%的冰醋酸1 mL，空白管、標準管和測定管則分別加入1 mL的TBA顯色劑。最后將離心管蓋上蓋，用針在蓋上扎一小孔，混合并搖勻后，放在95 ℃的水浴鍋中反應40 min，取出用凈水沖洗冷卻降溫，然后放在離心機中離心，條件為3500 r·min-1，時間10 min，離心結束后取上層，設置條件于532 nm處、1 cm光徑，用二蒸水調零后，檢測各管吸光度值。根據吸光度值計算各組MDA含量。

2.3.3 SOD活性測定

收集各分組上清后進行SOD活性測定，實驗設置對照孔、對照空白孔、測定孔、測定空白孔，取96孔板。首先對照空白孔與對照孔同步處理加入20 μL蒸餾水，測定孔和測定空白孔也是同步處理，按細胞分組的不同加入20 μL待測樣本；隨后對照孔和測定孔同步處理各自加入20 μL酶工作液，對應的對照空白孔和測定空白孔也是同步處理加入20 μL酶稀釋液。所有孔顛倒混勻后，分別各自加入200 μL的底物應用液，混勻后，放在37 ℃的烘箱里孵育20 min，取出96孔板置于酶標儀中450 nm處檢測吸光度值。根據所檢測出的各組吸光度值計算出各組SOD活性。

2.3.4 GSH-PX活性測定

實驗分為酶促反應和顯色反應兩部分。首先酶促反應部分，各分組準備酶管和非酶管，先在所有管中加入0.2 mL 1 mmol·L-1的GSH溶液，并在酶管中加入0.1 mL待測樣本，重懸混勻后，將所有管放在37 ℃的水浴鍋中反應5 min，反應結束后在所有管中加入0.1 mL稀釋了100倍后的貯備液，充分混勻后，37 ℃水浴鍋反應5 min后在所有管中加入2 mL沉淀劑，并單獨在非酶管中加入0.1 mL待測樣本，充分混勻后，設置離心機條件為3500 r·min-1，離心10 min，收取各管上層清液1 mL做顯色反應；根據試劑盒實驗說明書顯色反應部分設置空白管、標準管、非酶管、酶管，先在空白管里加入1 mL GSH標準品的溶劑應用液，標準管中則加入1 mL濃度為20 μmol·L-1的GSH標準液，非酶管和酶管加入酶促反應的上層清液1 mL，隨后在所有的管中依次分別加入緩沖液1 mL和顯色劑250 μL還有穩定劑50 μL。最后充分重懸混勻，常溫靜置15 min后，置于412 nm、1 cm光徑比色杯，用蒸餾水調零后，檢測各管OD值，根據OD度值計算各個分組的GSH-PX活性。

2.4 Western blotting檢測細胞內SOD和GSH-PX表達

按上述處理方法處理好細胞后，棄去培養基后用PBS清洗細胞表面2次，用現配的裂解液(RIPA裂解液：PMSF=100∶1)裂解細胞15 min，每隔5 min 搖一下細胞培養皿，確保裂解液充分接觸細胞表面，最后收集培養皿表面混合物并于4 ℃離心收集上清液得到細胞總蛋白，提取蛋白后通過BCA蛋白定量法檢測各分組的蛋白濃度，將提取到的總蛋白溶于上樣緩沖溶液中煮沸10 min，用9%的SDS-PAGE進行電泳分離，隨后進行轉膜，將目的條帶濕轉到適宜的PVDF膜上，濕轉結束后將PVDF膜放入濃度為8%的脫脂牛奶中并在室溫條件下搖床封閉2 h，封閉結束后用TBST清洗PVDF膜表面牛奶，最后把PVDF膜依次放入稀釋好的對應的一抗中(稀釋倍數為1∶1000)，并置于4 ℃冰箱孵育過夜。次日將膜取出用TBST清洗，將PVDF膜放入相應的二抗(稀釋倍數為 1∶2000)中，室溫置于搖床上2 h，TBST洗膜6次，每次7 min，最后用ECL化學發光法進行檢測，將PVDF膜放置于Bio-Rad化學發光成像系統儀中進行顯影。最終圖片在Image-J軟件上進行灰度值分析，將所得SOD和GSH-PX蛋白帶的灰度值分別除以對應組β-actin的灰度值后，在Excel表中進行數據分析。

2.5 qRT-PCR檢測細胞內SOD和GSH-PX mRNA的水平

將細胞均勻接種于60 mm培養板中，經前期細胞分組處理后，棄去上清液，用PBS清洗細胞表面2次，采用Trizol法提取各組細胞的RNA，隨后將提取到的RNA逆轉錄成cDNA。1)殘留gDNA的去除體系為16 μL，4×2-Step gDNA Erase-Out Mix 4 μL，模板RNA 1 μg，42 ℃反應2 min；2)逆轉錄反應體系為20 μL，5×ToloScript qRT EasyMix 4 μL，gDNA去除反應液16 μL，37 ℃反應15 min，85 ℃反應5 s。通過qRT-PCR檢測SOD、GSH-PX mRNA的水平，PCR擴增體系為20 μL，其中cDNA為2 μL，上下游引物各0.4 μL，2×SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL，PCR循環數為40，95 ℃預變性15 min，95 ℃變性15 s，65 ℃退火15 s,72 ℃延伸30 s。

2.6 熒光法檢測細胞內活性氧(ROS)水平

將細胞均勻接種于六孔板上，經前期處理后，采用活性氧檢測試劑盒，先將DCFH-DA和無血清細胞培養基按1∶1000的比例稀釋好后，從孵箱中取出處理好的細胞培養板，棄去細胞培養基，用PBS沖洗細胞表面后加入稀釋好的DCFH-DA，然后將細胞培養板放回孵箱孵育30 min，取出PBS清洗，吸凈PBS加入抗熒光淬滅劑，置于熒光倒置顯微鏡下觀察并計算出各組相對熒光強度(倍數)。

2.7 統計學方法

3 結果

3.1 HG誘導心肌細胞的損傷模型

MTS檢測結果顯示：HG組葡萄糖處理濃度為20和30 mmol·L-1時細胞活力分別為(95.74±3.2)%和(89.7±5.3)%，與Ctrl組(5.5 mmol·L-1)相比差異無統計學意義(P>0.05)；當HG組葡萄糖濃度為40 mmol·L-1時細胞活力為(84.07±3.5)%，下降了15%，差異具有統計學意義(P<0.05)；HG組葡萄糖濃度分別為50和60 mmol·L-1時，細胞活力分別為(66.77±5)%和(59.33±5)%(P<0.001)。LDH活性觀察結果顯示：當葡萄糖處理濃度為5.5 mmol·L-1時，LDH為(83.33±10)U·L-1；當葡萄糖處理濃度為50 mmol·L-1時，LDH為(108±4.5)U·L-1，LDH上升明顯(P<0.05)。提示，當葡萄糖處理濃度為50 mmol·L-1時，細胞活力下降(P<0.001)和LDH活性升高(P<0.05)，表明HG誘導心肌細胞損傷模型建立成功，可采用該模型進行后續實驗。見圖1。

***P<0.001、*P<0.05與5.5 mmol·L-1比較，ns：P>0.05。圖1 不同葡萄糖濃度對細胞活力和LDH活性的影響(n=3)

3.2 ASP對HG誘導細胞活力的影響

CCK8檢測結果顯示：HG組和HG+ASP組細胞活力分別為(55.45±3.4)%和(61.61±4.8)%。與HG組相比，HG+ASP組細胞活力顯著升高，升高了6.5%(P<0.05)。見圖2。

#P<0.05，***P<0.001,ns：P>0.05。圖2 ASP對HG誘導的細胞活力影響(n=3)

3.3 ASP對LDH、SOD和GSH-PX活性以及MDA含量的影響

HG組的LDH活性為(114±7.5)U·L-1、MDA含量為(1.52±1.0)nmol·L-1、SOD活性為(11.13±0.75)U·mL-1、GSH-PX活性為(4.36±1.36)nmol·min-1·mL-1，HG+ASP組的LDH活性為(96±5.5)U·L-1、MDA含量為(1.12±0.21)nmol·L-1、SOD活性為(12.98±0.3)U·mL-1、GSH-PX活性為(27.78±1.08)nmol·min-1·mL-1。與HG組相比，HG+ASP組的SOD(P<0.05)、GSH-PX(P<0.05)的活性明顯上升，LDH活性(P<0.001)、MDA含量(P<0.001)顯著下降。見圖3。

###P<0.001,#P<0.05，***P<0.001,*P<0.05,ns：P>0.05。圖3 ASP對LDH、SOD和GSH-PX活性以及MDA含量的影響(n=3)

3.4 ASP對心肌細胞內SOD和GSH-PX表達的影響

與Ctrl組比較，Ctrl+ASP組SOD和GSH-PX蛋白的表達量差異無統計學意義(P>0.05)，而HG組的SOD蛋白表達量比Ctrl組降低了10%，GSH-PX降低了20%(P<0.01)；與HG組相比，HG+ASP組的SOD蛋白表達量上升43%，GSH-PX蛋白表達量上升86%(P<0.01)。見圖4。

3.5 ASP對心肌細胞內SOD和GSH-PX mRNA水平的影響

qRT-PCR實驗結果顯示：與Ctrl相比，HG組的SOD mRNA水平表達量降低10%，GXH-PX mRNA水平表達量降低25.7%(P<0.05，P<0.001)，Ctrl+ASP組差異無統計學意義(P>0.05)；與HG組比較，HG+ASP組的SOD mRNA水平增加11.8%，GSH-PX mRNA水平增加9%(P<0.05)。見圖5。

3.6 ASP對HG誘導的細胞內ROS水平的影響

從熒光圖片和熒光強度分析結果可知，與Ctrl組相比，Ctrl+ASP組ROS水平差異無統計學意義(P>0.05)，而HG組ROS水平增加546%(P<0.001)；與HG組相比，HG+ASP組ROS含量下降62.8%(P<0.05)。表明，HG可顯著增加細胞內ROS水平，而ASP可以顯著降低ROS水平。見圖6。

A—D為各組的熒光圖片(×100)，A：Ctrl組；B：Ctrl+ASP組；C：HG組；D：HG+ASP組。E為各組的相對熒光強度分析圖，###P<0.001，***P<0.001，ns：P>0.05。

4 討論

糖尿病是一種很常見的代謝性疾病，其主要特征為慢性高血糖，可導致細胞運輸和利用葡萄糖的功能障礙[15]。慢性高血糖癥，會引發一系列長期的并發癥，最終導致心力功能障礙/衰竭或心肌病[16]。DCM很容易導致糖尿病患者發生心力衰竭[4]。而氧化應激和細胞凋亡是DCM發生和進展的最重要因素[16]。氧化應激是指機體遭受到刺激之后，機體內會產生與沉積過多的氧化中間產物，這會導致機體的氧化功能失衡(伴或不伴抗氧化能力下降)。有研究[17-18]表明，機體內的血糖含量增高可直接誘導心肌細胞凋亡，它通過增加機體內游離脂肪酸和生長因子的水平，進一步導致底物的供應和利用以及鈣穩態和脂質代謝異常；除此以外，它還會進一步促進ROS的大量產生和釋放，從而誘導氧化應激，造成基因表達異常，信號轉導錯誤和心肌細胞凋亡。本研究主要通過HG(50 mmol·L-1)作用H9C2細胞來模擬機體HG環境下的心肌，CCK8檢測細胞活力和檢測細胞LDH活性結果顯示，高濃度葡萄糖可以造成H9C2細胞損傷。

ASP可以調節哺乳動物體內的血糖平衡，其在禁食狀態下產生后轉移到肝臟，進一步激活G蛋白-cAMP-PKA信號通路以促進肝臟釋放葡萄糖進入血液，從而調節血糖[7]。有研究[18]發現大多數2型糖尿病患者分泌ASP的時候沒有節律性，這有可能是導致糖尿病發生的原因。有研究[19]表明ASP可通過上調Spartin通路抑制HG或高血糖誘導糖尿病小鼠心肌微血管內皮細胞(CMECs)的氧化應激反應，從而改善糖尿病小鼠心肌微血管內皮損傷。本研究發現用濃度為20 nmol·L-1的ASP處理細胞后，可以逆轉HG誘導的H9C2細胞活力下降和LDH活性升高，說明ASP對HG造成的H9C2細胞損傷具有改善作用；進一步研究發現，ASP處理組細胞上清液中的MDA含量降低、SOD和GSH-PX活性升高，并且細胞中SOD和GSH-PX的蛋白和mRNA的表達均出現顯著性升高，ASP處理組細胞中ROS的生成也減少。因此推斷ASP是通過增加細胞活性，促進氧自由基的清除來保護心肌細胞免受葡萄糖的損害。

綜上，本研究主要通過HG誘導建立心肌細胞體外損傷模型，模擬糖尿病心肌損傷，心肌損傷時會引起一系列氧化應激和炎癥反應，導致細胞活力下降、ROS穩態失衡和部分炎癥因子釋放，通過ASP干預治療可以降低部分氧化應激從而達到減弱HG導致的心肌損傷。這也為DCM防治提供了一種新的可能。