TGFB1基因多態性對特發性矮小癥患兒重組人生長激素治療效果的影響

李 航，楊正祥

(1.成都市龍泉驛區婦幼保健院兒童保健科；2.成都市龍泉驛區第一人民醫院口腔科，四川 成都 610100)

兒童矮小癥是指兒童的身高低于同種族、同年齡、同性別健康兒童平均身高的2個標準差以上，或者低于正常兒童生長曲線第3百分位[1]。目前矮小癥的發病率為2%～3%，其中特發性矮小(ISS)約占矮小患兒發病率的60%～80%，形勢不容樂觀[2]。ISS的發病原因包括生長激素缺乏、甲狀腺功能減退、慢性器質性疾病、心理社會剝奪以及遺傳代謝疾病等[3-4]。目前，重組人生長激素(rhGH)對ISS治療效果較好，但是價格昂貴，且治療效果個體間差異較大，其療效可能與遺傳因素有關。轉化生長因子β1(TGFB1)編碼基因位于19q13，該基因激活性突變導致其編碼蛋白轉化生長因子β1(TGF-β1)活性增高，引起骨轉換加快、肌肉生成減少，出現骨骼病變和肌肉異常[5]。相關研究[6]表明TGFB1基因多態性與骨干發育不良有關。TGFB1基因多態性有可能會影響rhGH對ISS的療效，但是相關研究報道較少。因此，本研究選取成都市龍泉驛區婦幼保健院就診的ISS患兒，rhGH治療前后記錄患兒身高相關指標，觀察TGFB1基因多態性對ISS患兒rhGH治療效果的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2017年12月至2019年12月在本院以rhGH治療的ISS患兒67例，其中男37例，女30例，平均年齡(7.9±1.5)歲，平均身高(109.96±6.32)cm。納入標準：兒童的身高低于同種族、同年齡、同性別健康兒童平均身高的2個標準差以上，或者低于正常兒童生長曲線第3百分位；生長速率緩慢，但是出生身高和身長在正常范圍內；且在生長激素(GH)激發試驗中，血清GH峰值<10 ng·mL-1。排除標準：染色體異常、系統性疾病或綜合征等引起生長受限的疾??；肝腎功能異常。所有患兒家屬均知情并簽署知情同意書。

1.2 治療方案

ISS患兒均給予注射用國產rhGH(安徽安科生物工程股份有限公司生產)，0.1 U·kg-1·d-1睡前皮下注射，均治療1年。

1.3 指標監測

rhGH治療前后記錄所有ISS患兒的身高、體重、體重指數(BMI)以及身高均值標準差積分(SDS)，拍攝包括全部手骨、腕骨和撓尺干3～4 cm的左手正位X線片，采用Greulich-Pyle方法，由專業人士評定骨齡。采用酶聯免疫法(ELISA)檢測血清中的胰島素樣生長因子-1(IGF-1)和胰島素樣生長因子結合蛋白-3(IGFBP-3)。

1.4 引物的設計與合成

查閱相關文獻[7]，選擇TGF-β1對應目標位點SNP序列號分別為rs4803455和rs22417115。由生工生物工程(上海)股份有限公司設計特異性引物以及合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5 基因型檢測

抽取ISS患兒血液3 mL，抗凝，存儲、備用。使用10%氯化銨裂解血液中細胞，3500 r·min-1離心后去上清，洗滌白色沉淀后用去離子水溶解。使用ND5000超微量分光光度計(美國BioTek公司)檢測DNA濃度，最終使擴增DNA含量在100 ng左右。隨后加入緩沖液2.0 μL、1.6 μL dNTP以及Taq酶0.2 μL。再加入0.15 μmol·L-1上下游引物0.5 μL，最后使用去離子水將反應體系加至20 μL?；靹蛑蠓湃隩L998A型基因擴增熒光檢測儀(西安天隆科技有限公司)進行反應。PCR擴增反應的條件設置如下：預變性，94 ℃ 2 min；擴增(35個循環)，94 ℃變性25 s，58 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s；再延伸，70 ℃延伸5 min。PCR擴增后產物(10 μL)使用限制性內切酶TaqⅠ進行酶切(美國Biolab公司)。利用美國Beckman Coulter公司的CEQ 8000自動序列測序儀對PCR產物進行核苷酸序列測定，測序結果經Chromas 2.22軟件進行查看和分析。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 ISS患兒基因分型PCR測序圖譜

67例ISS患兒血漿中提取DNA測序，rs4803455位點AA、AC、TT型和rs22417115位點TT、TG、GG型檢測見圖1。根據此結果對基因型分類。

A：rs4803455；B：rs22417115。圖1 rs4803455位點與rs22417115位點基因型檢測圖

2.2 ISS患兒基因分型結果分析

rs4803455位點AA基因型占比11.94%，AC基因型占比64.18%，CC基因型占比23.88%；rs22417115位點TT基因型占比22.39%，TG基因型占比61.19%，GG突變占比16.42%。對研究對象rs4803455、rs22417115基因的基因型頻率進行χ2檢驗，發現P值均小于0.05，其分布符合Hardy-Weillberg遺傳平衡定律。見表2。

表2 ISS患兒基因型結果 n=67

2.3 ISS患兒不同基因型各項指標差異

rs4803455基因型患兒間治療前后身高差值(Δ身高)、BMI差值(ΔBMI)、身高SDS差值(Δ身高SDS)、骨齡的差值(Δ骨齡)、IGF-1差值(ΔIGF-1)以及IGFBP-3差值(ΔIGFBP-3)比較差異均無統計學意義(P>0.05)。rs22417115基因型中GG型患兒Δ身高顯著高于TT型患兒(P<0.05)，rs22417115基因型中TG、GG型患兒ΔBMI、Δ身高SDS和ΔIGFBP-3均顯著高于TT型患兒(P<0.05或P<0.01)。見表3。

表3 不同基因型患兒各項指標治療前后差值比較

3 討論

ISS是矮小癥中最常見的種類，其發病機制目前尚不清楚，有研究[8]認為基因、激素、營養、環境等共同作用，導致機體生理病理的改變。ISS患兒如果未及時治療，其身高將顯著低于同齡人群[9]。rhGH相對于促性腺激素釋放激素類似物、芳香化酶抑制等對ISS治療效果較好，但是價格昂貴，且治療效果個體間差異較大，其療效可能與遺傳因素有關。有研究[5-6]表明，TGFB1基因多態性與骨骼生長有關，該基因激活性突變使TGF-β1活性增高，引起骨轉換加快、肌肉生成減少，出現骨骼病變和肌肉異常。因此，TGFB1基因多態性有可能會影響rhGH對ISS的療效。本研究發現，使用rhGH治療ISS患兒后，各項監測指標均有效改善。其中rs4803455基因型患兒間各項指標比較差異無統計學意義。相對于正常rs22417115基因TT型，rhGH治療TG型和GG型患兒各項指標均顯著改善，提示rs22417115基因的基因多態性能顯著影響rhGH對ISS患兒的治療效果。

ISS患兒因為自身身高問題，更容易出現自卑、溝通能力差、社會活動能力差情況。有研究[10-11]表明，細胞的周期、調節因子、自身免疫機制可能與ISS的發病有關，其中生長激素-胰島素樣生長因子(GH-IGF)軸異常是特發性矮小癥發生的主要原因。因此，基于GH-IGF軸為靶點開發的藥物對ISS患兒具有良好的療效。ISS為機體對GH的敏感性下降所致而體內GH水平正?；蚵缘?rhGH為外源性的生長激素補充劑，緩解內源性生長激素分泌不足導致的矮小癥。美國食品藥品管理局于2003年批準rhGH治療ISS[12]。有研究[13]表明，rhGH治療ISS患兒可以提高最終身高約4～6 cm，其療效與年齡、骨齡、治療時間、遺傳因素等有關。本研究使用rhGH治療ISS患兒1年后發現，rhGH對ISS患兒身高的各項指標均有明顯的改善作用，療效明顯；進一步對患者進行基因分型后發現，TGFB1基因rs22417115位點的基因多態性對rhGH的療效具有顯著的影響，rs22417115位點的基因突變后，顯著增加了rhGH的治療效果，使身高、BMI、身高SDS評分、以及內源性IGFBP-3等指標顯著上調。本研究結果證明了遺傳因素(TGFB1基因的多態性)為rhGH潛在療效的影響因素之一。

ISS的發病與體內基因多態性有關，研究多集中在GH-IGF軸相關基因，如：胰島素樣生長因子受體(IGF-IR)基因單核苷酸多態性與ISS的發病有關，其rs1976667位點是ISS發病的危險因素[14]。另外生長激素受體(GHR)基因位點多態性與ISS的發生發展密切相關[15]。但在廣西瑤族兒童中，GHR基因3個位點rs4410646、rs12515480和rs2940913的多態性在ISS差異無統計學意義，這可能與不同地區種族有關[16]。因此，當給予外源性rhGH治療時，其療效受到IGF-IR以及GHR基因多態性的影響。有研究[17]表明，生長激素受體基因外顯子3(d3-GHR)對rhGH治療矮小癥的療效具有顯著影響。IGFBP-3上的rs2854744(A/C)、rs3110697(G/A)、rs2132570(A/C)和rs2854746(C/G)等4個多態性位點可能與rhGH促線性生長效應有關[18]。TGFB1基因編碼的下游TGF-β1通過TGF-β/Smad3信號通路或者PP2A-AMPK-FoxO1信號通路調整多種細胞的周期與生長[19-20]。研究表明，TGFB1基因多態性與多種疾病有關，包括高血壓[21]、類風濕性關節炎[5]、肝纖維化[22]等。TGFB1基因亦調控骨組織進而影響人體身高，TGFB1基因突變導致骨發育不良，引起人體的矮小[6]。但是TGFB1基因多態性與rhGH對ISS的療效尚不清楚。本研究發現，rs4803455基因型患兒間各項指標差異無統計學意義，相對于正常rs22417115基因TT型，rhGH治療TG型和GG型患兒各項指標顯著改善，提示TGFB1基因部分位點的多態性與rhGH療效相關，其機制可能與上調血清中IGF-1和IGFBP-3的表達水平有關。已有研究[23]表明，維生素D受體基因多態性以及瘦素受體基因(LEPR)單核苷酸多態性對rhGH治療ISS的療效具有顯著影響。TGFB1基因rs22417115位點對rhGH療效的影響研究豐富了當前研究內容。

綜上，本研究發現，TGFB1基因rs22417115位點對rhGH治療ISS患兒的療效產生了顯著影響。相對于正常rs22417115基因TT型，rhGH治療TG型和GG型患兒身高各項指標顯著改善，其機制可能與上調血清中IGF-1和IGFBP-3的表達水平有關。未來可通過基因檢測等手段達到對ISS患兒的精準治療作用。