飼用有機硒的制備及硒含量的動態變化規律

彭軼楠，季 彬，鞏曉芳，穆永松，葉 澤，杜津昊，席 鵬，王治業

（1.甘肅省科學院生物研究所，甘肅省微生物資源開發利用重點實驗室，甘肅蘭州 730000；2.甘肅華瑞農業股份有限公司，甘肅民樂 734502）

酵母是一種營養保健為一體的生物活性添加劑，廣泛應用于飼料中（付雙喜，2001），其可富集微量元素，具有穩定性，能與飼料中其他成分很好地協同配伍，可避免飼料中營養成分的流失（肖競等，2004)。酵母硒已被當作天然硒源添加到飼料中，研究證明，酵母硒對畜禽硒的補充效果比硒酸鈉鹽高3～6 倍（白曉婷，2005）。硒酵母中除富含硒外，還含有易被畜禽吸收的必需氨基酸、維生素和礦物元素等各種營養成分，能夠促進畜禽的生長發育，縮短飼養期，節約精飼料（Bronzetti 等，2001），有效提高反芻動物瘤胃發酵功能（Wei 等，2019；Genther 等，2015），促進反芻動物泌乳功能（Sun 等，2017；呼顯生等，2012），提高肉產品的品質和營養價值（郭璐等，2020；劉阿云，2019）。

酵母細胞可以將通過硫代謝途徑進入細胞的SeO32+轉化成硒代小分子有機化合物，包括硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸和硒甲基半胱氨酸（Kieliszek等，2016）。硒代蛋氨酸被認為是酵母硒中有機硒的主要形式（Kelly 等，1995），與無機硒相比，具有生物利用率高、毒副作用小等優點，在動物生產中，相同的添加水平可起到更為顯著的效果（張少濤等，2020；郭永清等，2019）。硒代蛋氨酸具有抗氧化作用，可提高畜禽硒的利用率（Kang 等，2015；袁施彬，2007），增加體內抗體水平，從而促進免疫功能（徐偉風等，2018；Carlson 等，2011），具有抗腫瘤和防治心血管疾?。╖hao 等，2007；Waters 等，2003）等功效。

本試驗通過研究不同時間添加不同濃度硒對酵母生長的影響，初步確定適宜的硒添加時間和添加濃度范圍，測定酵母細胞總硒和細胞內蛋白硒，進一步明確硒添加時間和添加量與酵母富集硒含量的關系。利用高效液相色譜串聯質譜法HPLCMS 法測定酵母細胞硒代氨基酸的含量，旨在探明硒濃度對酵母細胞硒代氨基酸含量的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），保存于本實驗室。

1.1.2 培養基 酵母浸出粉胨葡萄糖培養基（YEPD）：葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母浸粉10 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1000 mL，pH 自然，121 ℃高壓滅菌20 min。

裂解液：50 mmol/L 磷酸二氫鈉，1 mmol/L EDTA-2Na，5%甘油，pH 7.4。

磷酸緩沖鹽（PBS）緩沖液：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO41.44 g，KH2PO40.24 g，溶于900 mL 雙蒸水中，鹽酸調pH 至7.4，加水定容至1000 mL，常溫保存備用。

1.2 主要試劑和設備 亞硒酸鈉、硝酸、高氯酸、乙腈、3，3'-二氨基聯苯胺（DBA）均為優級純，購自上海國藥集團化學試劑有限公司；葡萄糖、蛋白胨、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）、甲酸、甲苯、硫酸銨、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀，購自北京奧博星生物技術有限責任公司。

1100 高效液相色譜系統（美國安捷倫公司）、6410 三重串聯四極桿質譜（美國安捷倫公司），恒溫培養箱（上海一恒），振蕩培養箱（上海博迅），紫外分光光度計（上海普析），超聲破碎儀（寧波新芝），水浴鍋（上海赫田），電熱恒溫干燥箱（廣州康恒），冷凍高速離心機（長沙湘儀）等。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種活化 將菌種接于固體斜面YEPD 培養基活化24 h 后，取一環于YEDP 液體培養基搖瓶中，在溫度30 ℃、轉速200 r/min 條件下培養24 h 作為活化的菌種。

1.3.2 硒添加濃度對酵母生長的影響 配制亞硒酸鈉溶液，經過濾除菌后添加至無菌YEPD 液體培養基中，使培養基中Se2+濃度分別為0、10、15、20、30、40 mg/L，酵母菌以1%接種量分別接種于含Se2+的YEPD 培養基中，溫度30 ℃、轉速200 r/min條件下培養48 h。培養期間，采用分光光度計法，每6 h 于波長600 nm 條件下測定不同Se2+濃度培養液的OD600nm值，繪制菌株的生長曲線。

1.3.3 硒添加時間對酵母生長的影響 酵母菌以1%接種量接種于YEPD 培養基中，分別在0、2、4、6、8、10 h 添加無菌亞硒酸鈉溶液，使培養基Se2+終濃度為20 mg/L，在溫度30 ℃、轉速200 r/min 條件下培養48 h。培養期間，采用上述方法測定培養液的OD600nm值，繪制菌株的生長曲線。

1.3.4 硒含量的測定 采用3，3'-二氨基聯苯胺分光光度法測定硒含量（婁興丹等，2017）。將含硒溶液添加于100 mL 燒杯中，加水補至40 mL。加入適量2 mol/L 甲酸，使溶液pH 為2.0～3.0，加入5% EDTA-2Na 溶液4 mL 掩蓋干擾離子。再加入0.5% 3，3'-二氨基聯苯胺（DBA）溶液2 mL，搖勻后放置65 ℃恒溫水浴鍋中避光反應30 min。取出后用濃氨水調節pH 為7.0～7.5，轉入分液漏斗中，加入10 mL 甲苯萃取，劇烈振蕩2 min，靜置3～4 min 待分層，棄水層，將甲苯層通過脫脂棉過濾到試管中待用。用分光光度計在波長420 nm 處測定吸光度，平行測定3 次，計算吸光度的平均值，采用甲苯做空白對照。

1.3.5 酵母總硒含量的測定 稱取烘干的含硒酵母0.1 g 于燒杯中，加入10 mL 混酸溶液（硝酸：高氯酸=4：1，V/V），在電熱板上加熱消解，直至溶液變為透明淡黃色為止，倒入25 mL 容量瓶，加去離子水補足，每次取10 mL 溶液作為待測樣品。測定方法同1.3.4，通過標準曲線計算樣品單位硒含量，計算公式為：

單位硒含量/（μg/g）=標準曲線查得樣液的硒濃度（μg/mL）×樣液體積（mL）/樣品質量（g）；

總硒含量/（μg/L）=菌體生物量（g/L）×單位硒含量（μg/g）。

1.3.6 酵母生物量的測定 將酵母發酵液于轉速為5000 r/min 條件下離心20 min，收集菌體沉淀，用無菌蒸餾水洗3 次，將菌體沉淀放置烘箱85 ℃烘干至恒重，稱重記錄。

1.3.7 酵母硒蛋白的提取 稱取烘干的含硒酵母1.0 g，加入15 mL 裂解液中，振蕩混勻后，在冰浴條件下超聲30 min（30 W，20 KHz）后，在4 ℃條件下10000 r/min 離心20 min 收集沉淀，加入硫酸銨溶液直至飽和，在4 ℃條件下10000 r/min 離心10 min，將沉淀溶解到PBS 緩沖液，置于透析袋中，于去離子水中透析去除殘余硫酸銨，收集透析后的蛋白液為待測樣液。

1.3.8 酵母細胞硒代氨基酸的測定 采用高效液相色譜串聯質譜（HPLC-MS）法對硒蛋白進行分析，色譜工作條件：ZORBAX 300A SB-C 18 色譜柱（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）；柱溫20 ℃；流動相為20%水＋80% 乙腈，流動相水和乙腈中各含0.1%甲酸；流速為200 μL/min；進樣量為10 μL。質譜工作條件：電噴霧離子電離源，正離子電離方式，電離電壓3850 V；霧化器為高純氮氣；離子源溫度300 ℃；霧化器壓力為300 psi；毛細管電壓為3800 V，掃描方式為多反應離子監測（MRM）。

2 結果與分析

2.1 硒的添加量對酵母生長的影響 不同硒濃度對酵母的生長有很大影響。從圖1 可以發現，隨著硒濃度增加，酵母菌OD600nm值逐漸減小，表明硒濃度對酵母生長具有抑制效果。當硒的濃度為10、15 mg/L 和20 mg/L 時，酵母OD600nm值接近，硒濃度為30 mg/L 和40 mg/L 時，OD600nm值明顯降低，表明培養基中硒濃度為10、15 mg/L和20 mg/L 時，對酵母的生長影響最小。

圖1 不同濃度硒含量對酵母生長的影響

2.2 硒添加時間對酵母生長的影響 在培養基中分別在不同時間添加硒濃度為20 mg/L，對酵母生長的影響見圖2，隨著加硒時間的增加，酵母生長具有正效應。0～4 h 為酵母生長適應期，在0、2 h 和4 h 加硒對酵母生長影響較大，其中0 h和2 h 加硒酵母OD600nm值最??；4～12 h 為酵母生長對數期，在6、8 h 和10 h 加硒酵母生長OD600nm值均較大，說明加硒時間在生長對數期時對酵母生長影響最小。

圖2 不同加硒時間對酵母生長的影響

2.3 不同時間添加不同濃度硒對酵母富集硒的影響 培養基中添加硒不僅對酵母生物量產生影響，對酵母富集硒也具有影響。表1 表明，隨著硒濃度的增加，酵母均表現出生物量降低，酵母總硒含量增加，酵母中蛋白硒含量增加的趨勢，說明雖然硒對酵母的生長有相對抑制作用，但酵母對硒的富集能力有所增強，表現為酵母細胞總硒和細胞內蛋白硒含量增加。當硒添加量為20 mg/L 時，酵母富集硒含量最高。

表1 不同時間添加不同濃度硒對酵母富集硒的影響

隨著加硒時間的增加，酵母也均表現出生物量增加，酵母總硒含量降低，酵母中蛋白硒含量降低的規律，說明較晚時間添加硒雖然有益于酵母生長，但酵母富集硒含量卻明顯降低，當在6 h 添加硒時，酵母總硒和細胞內蛋白硒含量最高。由于在6～12 h 為酵母生長對數期，因此選擇在6 h為最佳添加硒時間。

2.4 酵母細胞中硒代氨基酸的測定 提取酵母細胞蛋白質，蛋白質透析后采用HPLC-MS 聯用儀測定硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸和硒代甲基半胱氨酸。質譜掃描在m/z184、198 和337 分別出現硒代甲基半胱氨酸、硒代蛋氨酸和硒代胱氨酸的信號峰，經過計算得到各氨基酸含量（表2）。在培養基中添加不同濃度硒，酵母經過富集后細胞內三種硒代氨基酸的含量均有明顯升高，進一步說明酵母細胞具有富集硒的能力，并在細胞內將無機的亞硒酸鈉轉化為硒代氨基酸，外源無機硒含量增加，促進酵母細胞將無機硒轉化為硒代氨基酸。硒濃度為10、15 mg/L 和20 mg/L 時，均為硒代蛋氨酸含量最高，其次為硒代胱氨酸，硒代甲基半胱氨酸含量最低，外源硒的添加主要促進了酵母細胞內硒代蛋氨酸的形成，是酵母細胞內含量最高的硒代氨基酸。從表中可以看出，硒添加濃度為20 mg/L 時，三種硒代氨基酸含量均為最高，該濃度為最佳添加量。

表2 不同硒添加量對硒代氨基酸含量的影響 μg/g

3 討論

酵母菌具有來源廣泛、繁殖周期短、營養價值高的特點，是較好的微量元素富集載體菌種（白曉婷，2005）。酵母菌富集微量元素硒，是指將無機硒轉化為有機硒，便于動物機體吸受。酵母富集硒的能力受培養過程中硒的添加量、硒添加時間及發酵條件等的影響（丁嵐峰等，2009）。李勤等（2009）和孫海云等（2007）研究硒對酵菌生長的影響發現，微量的硒對酵母菌的生長有一定的促進作用，然而過量的硒會抑制酵母菌的生長并且隨著硒濃度的增加抑制作用不斷增強。Stabnikova 等（2008）研究酵母富集硒指出，在培養基中添加亞硒酸鈉5 mg/L 不會對酵母生長產生影響，10 mg/L時酵母生長受到抑制，酵母菌析出紅色的單質硒，稱為紅硒現象。石?。?013）研究表明，發酵液中硒濃度低于10 mg/L 時對酵母生長沒有影響，大于該濃度時酵母生長受到抑制。吳梅（2016）發現，硒添加濃度為15 μg/mL 時開始變紅，且富硒能力較強，當添加量到20 μg/mL 時，酵母的顏色變成磚紅色，說明亞硒酸鈉抑制酵母的生長。本試驗中結果與上述結論相似，硒濃度高于20 mg/L 時，酵母菌OD600nm值減小，說明菌株生長受到抑制，硒濃度為20 mg/L 時，酵母總硒含量和細胞內蛋白硒含量均高于10 mg/L 和15 mg/L 硒濃度。

在發酵初期添加亞硒酸鈉會抑制微生物生長，過晚添加會影響硒的富集量，微生物發酵的對數期和穩定期是酶活性和代謝水平旺盛的時期，該時期細胞吸收能力最強，隨著細胞增殖富硒能力也隨之增強。Wang 等（2010）研究酵母富硒能力時發現，添加硒的最佳時間是生長對數期。吳競等（2012）發現，在酵母生長對數期8 h 添加亞硒酸鈉，有機硒的轉化率高于其他添加時間。楊麗華等（2006）建議在對數期添加硒，有助于提高酵母生物量和富硒量。本試驗在0、2、4、6、8、10 h 添加相同濃度硒，在生長對數期6～10 h 酵母OD600nm值高于穩定期0～4 h，說明在對數期添加硒適宜酵母生長；通過測定酵母富集硒含量發現，在6 h添加硒時，酵母總硒含量和細胞內蛋白硒含量最高，結果與其他學者研究結果相同。

富硒酵母中硒沉積在細胞壁、細胞膜、氨基酸和蛋白質中，其中主要與氨基酸絡合成蛋白質，包括硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸和硒代甲基半胱氨酸。這些硒蛋白毒性小，生物利用率高，是動物獲得硒的主要來源，對富硒酵母含硒蛋白的研究主要集中在硒代蛋氨酸（謝小雪等，2020）。Whanger（2002）研究酵母富集硒發現，酵母硒中硒代蛋氨酸含量為23%～63%，硒代胱氨酸含量為13%～21%，硒代甲基半胱氨酸含量為6%～20%。朱昌雄（2007）對酵母菌誘變后進行富硒研究，結果為誘變株細胞內硒代蛋氨酸含量為1650 μg/g。高愈希等（2013）采用反相離子對高效液相色譜－電感耦合等離子體質譜法測定富硒酵母中硒代蛋氨酸含量為921.04 μg/g，硒代半胱氨酸含量為15.41 μg/g。本試驗通過HPLC-MS 聯用法，測定不同時間添加不同濃度硒條件下酵母細胞硒蛋白含量，其中酵母培養6 h 后添加20 mg/L 硒，最終酵母細胞內硒代蛋氨酸含量為1044.57 μg/g，硒代胱氨酸含量108.33 μg/g，硒代甲基半胱氨酸含量72.2.1 μg/g。硒代蛋氨酸含量最高，這與其他學者研究結果一致，但是各氨基酸含量差異較大，可能的原因是菌種和培養環境不同。

4 結論

試驗結果表明，加硒時間為6、8、10 h 和加硒濃度為10、15、20 mg/L 時，酵母生長較好。采用3，3'-二氨基聯苯胺分光光度法測定酵母總硒和細胞內蛋白硒含量，表現出隨加硒時間的增加，酵母生物量增加，總硒和蛋白硒含量降低，隨加硒濃度的增加，酵母生物量降低，總硒和蛋白硒含量增加的規律。最佳加硒時間6 h，最佳濃度20 mg/L時，酵母總硒含量為1566.30 μg/g，細胞內蛋白硒含量為1336.82 μg/g。通過高效液相色譜串聯質譜（HPLC-MS）法測定酵母細胞內硒代氨基酸含量進一步確定加硒濃度與硒代氨基酸的關系，隨著加硒濃度的增加，硒代氨基酸含量隨之增加，且均表現為硒代蛋氨酸含量最高，加硒濃度為20 mg/L 時，硒代蛋氨酸含量為1044.57 μg/g，硒代胱氨酸含量為108.33 μg/g，硒代甲基半胱氨酸含量為72.21 μg/g。