響應面優化超聲波法提取薄荷多糖的研究

郝曉華，曹麗蓉，羅淑政，宿 婧

（忻州師范學院生物系，山西忻州 034300）

薄荷，唇形科多年草本植物，臨床多用于風熱感冒、溫病初起、頭痛目赤、咽喉腫痛等癥。有利膽、鎮靜止痛、驅除害蟲等功效。薄荷水提液有比較顯著的抗氧化活性（李佩佩等，2014；郭曉恒等，2013；房海靈等，2010），對具有氧化性的自由基有較高的清除作用。多糖是一類由多個單糖通過糖苷鍵連接起來的大分子，廣泛存在于動植物體內。多糖對許多微生物的生長和繁殖有可能造成生長拮抗，但其機制還不太清楚（張唐偉等，2011），多糖還有抗腫瘤（Sun 和Zhou，2012）、抗氧化（Fan等，2012）、抗病毒（Navid 等，2012）和免疫調節（Yi等，2012；Li 等，2012）等功效。近年來多糖的藥理作用研究日益受到關注，但對于薄荷多糖的研究卻鮮見報道。本試驗用響應面優化超聲波法提取薄荷多糖，以期為薄荷多糖的產品開發奠定理論基礎，為薄荷的充分開發利用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 UV-2102C 型紫外可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；HC-2062 高速離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司；KQ3200DV 型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

干薄荷，購買于忻州市五臺山大藥房；95%乙醇（含量≥95%），天津市申泰化學試劑有限公司；苯酚、葡萄糖、濃硫酸、水楊酸。以上藥品及試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 超聲波法提取薄荷多糖 將干薄荷葉粉碎后過60 目篩。稱取1.00 g 薄荷粉末于100 mL 小燒杯中，以一定的料液比加入蒸餾水充分混勻，70°C 水浴加熱20 min 后，調節超聲波清洗儀的各項參數（功率、時間、溫度按照試驗設計的數值設置），超聲處理后離心（4200 r/min，15 min）、過濾，再將沉淀加入一定量的蒸餾水以相同的料液比和超聲條件提取，離心、過濾后合并兩次濾液，將濾液濃縮至10 mL，加入無水乙醇，冷藏放置（4 ℃）24 h，充分醇沉后離心（4200 r/min，15 min），將沉淀物置于干燥箱（50 ℃，60 min）烘干，得到多糖粗制品。

1.2.2 多糖標準曲線的制定 準確稱取葡萄糖0.01 g，倒入蒸餾水不停攪拌，待溶解之后定容到100 mL 即為葡萄糖母液。準確取量0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 母液于刻度試管中，每管加入一定量的蒸餾水使其體積為1 mL，滴加濃硫酸5 mL 和5%苯酚溶液1 mL，充分振蕩搖勻，待冷卻至室溫后測490 nm 下吸光度，繪制多糖濃度與吸光度標準曲線圖（戴喜末等，2011；王桃云等，2011）。

1.2.3 薄荷多糖提取率的測定 按照如下公式計算薄荷多糖的提取率（張保等，2016）：

提取率/%=（CV/1000 m）×100%；

式中：C 為多糖的質量濃度，mg/mL；V 為樣品溶液的總體積，mL；m 為薄荷粉末的質量，g。

1.2.4 單因素試驗 稱取1.00 g 薄荷粉末于燒杯中，以蒸餾水為提取劑，在料液比1∶10、1∶30、1∶50、1∶70、1∶90，超聲時間20、25、30、35、40 min，超聲溫度20、30、40、50、60 ℃，超聲功 率90、105、120、135、150 W 的條件下進行單因素試驗，每組做三個重復，考察各因素對薄荷多糖提取率的影響程度。

1.2.5 響應面優化分析超聲波法提取薄荷多糖最優條件 以單因素試驗結果為依據，以提取薄荷多糖影響顯著的三個因素以及每一個因素中提取率較高的三個參數設計三因素三水平響應面優化試驗（表1）。

表1 薄荷多糖提取試驗設計因素與水平

1.3 薄荷粗多糖抗氧化性研究

1.3.1 薄荷粗多糖清除DPPH 自由基能力的測定滴加0.005、0.015、0.025、0.035、0.045 mg/mL 多糖溶液1 mL 于各試管中，添加0.2 mmol/L DPPH·溶液3 mL，避光放置30 min 后測其在517 nm 的吸光度記作A1，取1 mL 薄荷多糖溶液加入3 mL 95%乙醇，避光放置30 min 后測其在517 nm 的吸光度記作A2，取1 mL 蒸餾水加入3 mL DPPH·溶液，避光放置30 min 后測其在517 nm 的吸光度記作A0，不同濃度的多糖溶液對DPPH 自由基的清除率公式為：清除率/%=A0-（A1-A2）/A0×100。將維生素C 作為標準品對照薄荷多糖的抗氧化性強弱（楊潤亞等，2012；劉然等，2012；陳麗嬌等，2012）。

1.3.2 薄荷粗多糖清除羥自由基能力的測定 滴加0.005、0.015、0.025、0.035、0.045 mg/mL 多糖溶液1 mL 于各試管中，加入6 mmol/L FeSO4溶液、6 mmol/L 乙醇水楊酸和6 mmol/L H2O2各1 mL，搖勻后5000 r/min 離心5 min，在510 nm 測其吸光度記作Ax，將多糖溶液換成1 mL 蒸餾水按上述方法測其吸光度記作Ax0，將H2O2換成1 mL 蒸餾水按上述方法測其吸光度記作Ax1，不同濃度的多糖溶液對羥自由基的清除率計算為：清除率/%=Ax0-（Ax-Ax1）/Ax0×100。將維生素C 作為標準品對照薄荷多糖的抗氧性強弱（許小向等，2015）。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線 葡萄糖標準曲線及回歸方程見圖1。各數值均采用Microsoft Excel 2010軟件進行處理，得出葡萄糖標準曲線及回歸方程：y=13.9248x+0.0064，并以該方程計算薄荷多糖的含量。

圖1 葡萄糖標準曲線

2.2 薄荷多糖的提取單因素試驗結果與分析

2.2.1 料液比對薄荷多糖提取率的影響 由圖2可知，在150 W、50 ℃、20 min 的條件下，料液比1∶50 時多糖得率最高。溶劑增加后，多糖的浸出率也隨之增加，當細胞內多糖浸出率達到最大值后，溶劑繼續增加只會使提取率下降，所以選用1∶50作為薄荷多糖提取的最佳料液比。

圖2 料液比與薄荷多糖提取率折線圖

2.2.2 超聲時間對薄荷多糖提取率的影響 由圖3 可知，在50 ℃、150 W、1∶50 的條件下，隨著提取時間的延長多糖提取率總體呈先升后降的趨勢。超聲波可破碎細胞，時間越長，細胞破碎越充分，多糖提取率上升。但超聲時間過長可能使多糖結構破壞導致提取率下降。35 min 時，薄荷多糖的提取率最高，故選用35 min 作為薄荷多糖最佳超聲時間。

圖3 超聲時間與薄荷多糖提取率折線圖

2.2.3 超聲溫度對薄荷多糖提取率的影響 由圖4 可知，在35 min、150 W、1∶50 的超聲條件下，隨著超聲波提取溫度升高，提取率先升高后降低。溫度高時分子運動快，有利于多糖溶出，在40 ℃時薄荷多糖的提取率達到最高，所以選用40 ℃作為薄荷多糖的最適提取溫度。

圖4 超聲溫度與薄荷多糖提取率折線圖

2.2.4 超聲功率對薄荷多糖提取率的影響 由圖5 可知，在1∶50、40 ℃、35 min 的條件下，隨著超聲功率的增大，提取率先升后降，可能是因為在相同時間及料液比的情況下，功率越大，細胞破碎越多，使多糖的提取率上升，但功率過大會使非糖物質大量浸出使多糖得率降低。本試驗中超聲功率為135 W 時薄荷多糖的提取率最高，選用135 W作為薄荷多糖的最佳提取功率。

圖5 超聲功率與薄荷多糖提率折線圖

2.3 超聲波法提取薄荷多糖工藝的響應面優化分析

2.3.1 響應面分析法試驗設計與結果 將表1 內容輸入Design—Expert8.0.5 軟件中，得到薄荷多糖的提取率為響應值的17 組試驗設計，得到的試驗結果見表2。

表2 薄荷多糖提取工藝響應面分析試驗設計及結果

2.3.2 二次項數學模型的可行性分析 由表3 可知P=0.0124＜0.05，說明該方程得到的工藝條件對實際操作影響顯著，這個方程得到的條件可用于提高薄荷多糖提取率；失擬項P=0.4406＞0.05，說明方程得到的理論值和真實值相差不大，可以用于現實的生產操作中。綜上所述，可使用該數學模型預測超聲波法提取薄荷多糖的最優提取工藝以及在該條件下的最高提取率。本研究得到的二次項方程為：Y=1.55 +0.051A -0.017B +0.10C +0.075AB-0.072AC+0.085BC -0.091A2-0.044B2-0.19C2（A 超聲功率、B 超聲時間、C 料液比、Y 提取率）。

依據表3 可知各要素改變提取率的能力從小到大依次為：超聲時間（F=0.35）＜超聲功率（F=2.99）＜料液比（F=12.23），在三個要素中，料液比（C）對薄荷多糖提取率的影響非常顯著（P ≤0.01），功率和時間（A、B）對提取率影響不顯著（P＞0.05），各交互項（AB、AC、BC）對薄荷多糖提取率的影響也不顯著（P ＞0.05），功率和時間的二次項（A2、B2）對薄荷多糖提取率的影響不顯著（P ＞0.05），料液比的二次項（C2）對薄荷多糖提取率的影響非常顯著（P ＜0.01）。

表3 方差分析表

2.3.3 交互項及等高線圖、三維曲線圖 響應曲面圖中曲面的陡峭程度越大，對提取率的影響程度越大。等高線圖可反映因素之間的交互作用，越偏圓形，表示交互不顯著。越偏橢圓，表示交互顯著。由圖6（a）可知功率一側的曲面比時間一側陡峭，說明功率對提取率的影響更大；由圖6（b）可以看出，等高線不夠密集，呈橢圓形，結合方差分析表，可知超聲功率和時間之間存在相互影響但是影響不大。由圖7（a）可以看出，在料液比一側的曲面比超聲功率一側更陡峭，故料液比對薄荷多糖提取率影響更大；由圖7（b）可看出，等高線不夠密集且接近圓形，說明超聲功率和料液比之間相互影響較??；由圖8（a）可看出在料液比一側的曲面比時間一側更陡峭，說明料液比對薄荷多糖提取率影響更大；由圖8（b）可以看出，等高線密集且為橢圓形，料液比和超聲時間之間有相互影響且影響較大。

圖6 超聲功率和時間的交互作用曲線圖（a）和等高線圖（b）

圖7 超聲功率和料液比的交互作用曲線圖（a）和等高線圖（b）

圖8 超聲時間與料液比的交互作用曲線圖（a）和等高線圖（b）

2.3.4 響應面分析優化薄荷多糖提取最優條件采用Design Expert8.0.5 分析數據，得出超聲波法提取薄荷多糖的最優條件：功率134.39 W、時間30.09 min、料液比1∶55.80，提取率約為1.57%。在實際操作中，為了增加試驗的可行性，可將預測的超聲波法提取薄荷多糖最優工藝修改為：超聲功率135 W、超聲時間30 min、料液比為1∶56，在此條件下重復三次，提取率平均值為1.57%，高于單因素試驗結果，證明響應面得到的方程是可靠的。

2.4 測定薄荷粗多糖的抗氧化性能力

2.4.1 薄荷粗多糖清除DPPH 自由基能力的測定結果 由圖9 可知，隨著維生素C 濃度的增大，其清除率增大，抗氧化性越強，樣品和維生素C 的抗氧化性不斷接近，最大清除率可達到維生素C 的86.3%，證明薄荷多糖具有較強的抗氧化性。

圖9 薄荷粗多糖對DPPH 自由基的清除作用

2.4.2 薄荷粗多糖清除羥自由基能力的測定結果由圖10 可知，隨著樣品（維生素C）濃度的增大，其對羥自由基的清除率增大，樣品和維生素C 的清除率不斷接近，當薄荷多糖濃度為0.045 mg/mL時，對羥自由基的清除率為71.50%，因此薄荷多糖對羥自由基具有明顯的清除作用。

圖10 薄荷粗多糖對羥自由基的清除作用

3 結論

本研究通過響應面法優化超聲波提取薄荷多糖的提取條件，首先進行單因素試驗，并依據試驗結果采用薄荷多糖得率較高的因素和水平設計響應面優化試驗。得出以下結論：超聲時間、超聲功率、料液比三個因素之間交互作用較??；響應面采用的三個因素對薄荷多糖提取率影響程度由小到大依次是：超聲時間＜超聲功率＜料液比；本研究最終得到薄荷多糖的最佳提取條件為：超聲時間30 min、超聲功率135 W、料液比1∶56，在此條件薄荷多糖的提取率為1.57%。得出最優工藝后，采用優化后的試驗條件提取薄荷粗多糖，用于進行抗氧化試驗。隨著薄荷多糖濃度不斷增大，抗氧化性增強。當濃度增加到一定值后其抗氧化性與維生素C相差無幾，說明薄荷多糖具有較強的抗氧化性。