正交試驗優選四時青總黃酮提取工藝

章燁雯，呂其壯，陳 榮，樊燕萍，臧青民

（玉林師范學院生物與制藥學院，廣西玉林 537000）

四時青又名云實葉，為豆科云實屬植物云實的干燥葉片（魏小華，2012），具有清熱解毒，祛瘀止痛等功效，也可在一定程度上維持動物體內的代謝平衡，防治疾病，目前已有研究將其作為飼料添加劑使用（王文輝等，2017；田志超等，2012）。四時青化學成分復雜多樣，主要含有萜類、黃酮類及生物堿等，其中高異黃酮和卡薩烷二萜類為特征性成分（Yuben 等，2018）。黃酮類化合物作為普遍存在于植物中的一類成分，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗菌和免疫調節等生物活性（吳兆華等，2007）；另外，其作為飼料添加劑能促進動物健康育肥，增強動物的免疫力，同時提高肉類品質（馮香安等，2011）。目前對于四時青的研究主要集中在化學成分和生物活性上（李昌勤等，2016；李茂星等，2002），但對其黃酮類成分提取工藝的研究鮮有報道。因此，本試驗在參考相關植物總黃酮提取工藝的基礎上（唐春偉等，2019），采用單因素結合正交試驗，研究四時青總黃酮的最佳提取工藝，以期為進一步開發四時青提供一定的依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 電子天平（JA2003，舜宇恒平）；新型密封式粉碎機（雷邁）；數碼超聲波清洗器（KQ-500DV，昆山）；數顯恒溫水浴鍋（HH-2，國華）；旋轉蒸發儀（RE-2000A，亞榮）；循環水式多用真空泵（SHB-III，長城科工貿）；紫外可見分光光度計（A360，翱藝）。

四時青采摘于廣西南寧上林縣的一丘陵地，經鑒別為豆科，云實屬植物云實的葉；蘆丁標準品購于上海源葉生物科技有限公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇等試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 蘆丁標準曲線的繪制 精密稱定蘆丁標準品20.0 mg，置于100 mL 量瓶中，用60%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得0.2 mg/mL 蘆丁標準溶液。分別精密量取蘆丁標準溶液0.00、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL 置100 mL 容量瓶，添加60%乙醇至25 mL；分別加入5%亞硝酸鈉溶液1.5 mL，搖勻，靜置6 min；再加入10% 硝酸鋁溶液1.5 mL，搖勻，靜置6 min；最后加入4% 氫氧化鈉溶液20 mL，用60%乙醇定容至刻度，搖勻，靜置12 min。用紫外分光光度計（λ=510 nm）測定不同濃度蘆丁標準品溶液的吸光度值，以濃度（C)為橫坐標、吸光度（A)為縱坐標繪制蘆丁標準曲線（黃明堦等，2009）。

1.2.2 四時青總黃酮提取率的測定 根據蘆丁標準曲線計算樣品中總黃酮的質量濃度，提取率按下式計算：

式中：C 為四時青總黃酮的質量濃度，mg/mL；N 為稀釋倍數；V 為樣品液體積，mL；M 為樣品質量，g；T 為四時青總黃酮的提取率，%。

1.2.3 單因素試驗 以四時青總黃酮的提取率為指標，分別設置乙醇濃度（40%、50%、60%、70%、80%）、提取時間（15、30、45、60、75min）和溶劑倍量（5、10、15、20、25）為考察因素和水平，篩選出影響四時青總黃酮提取的較優水平。

1.2.4 正交試驗 在單因素試驗的基礎上，以四時青總黃酮的提取率為考察指標，采用L9（34）正交表安排試驗，因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平

1.3 數據處理與分析 采用SPSS 20.0 軟件對正交試驗數據進行統計學分析。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制 以蘆丁的質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程y=11.864x-0.0019（R2=0.9994），結果見圖1。表明蘆丁在0.004～0.040 mg/mL 與吸光度呈良好的線性關系。

圖1 蘆丁標準曲線

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 乙醇濃度對四時青總黃酮提取率的影響乙醇作為一種常用的綠色溶劑，可以滿足不同類別成分的提取需要，滲透力強。如果乙醇的濃度過小容易導致水溶性雜質的溶出，如果過大容易導致色素、樹脂等脂溶性雜質的溶出。本單因素試驗固定溶劑倍量15、提取時間60 min，研究系列乙醇濃度對四時青總黃酮提取率的影響，結果見圖2。在一定濃度范圍內，隨著乙醇濃度的升高，四時青總黃酮的提取率增大，但當乙醇濃度大于60%時，由于四時青中葉綠素、苷元等雜質的溶出量增加，從而影響總黃酮的提取。

圖2 乙醇濃度對提取率的影響

2.2.2 提取時間對四時青總黃酮提取率的影響提取過程的完成需要一定的時間，即有效成分溶出、擴散達到平衡的時間。時間太短，有效成分浸出不完全，時間太長，造成浪費，導致無效成分和雜質溶出增加，甚至使有效成分降解失活。本單因素試驗固定溶劑倍量15，乙醇濃度60%，研究不同提取時間對四時青總黃酮提取率的影響，結果見圖3。隨著提取時間的增加，四時青總黃酮的提取率增大，但當提取時間超過60 min 時，由于四時青中其他化合物也會溶出，從而影響總黃酮的提取。

圖3 提取時間對提取率的影響

2.2.3 溶劑倍量對四時青總黃酮提取率的影響溶劑用量的加大，有效成分可以充分擴散，但用量過大也會給后續工藝操作帶來不便。本單因素試驗固定提取時間60 min，乙醇濃度60%，研究不同溶劑倍量對四時青總黃酮提取率的影響，結果見圖4。隨著溶劑倍量的增加四時青總黃酮的提取率增大，但當溶劑倍量大于10 時，總黃酮溶出不再增加。

圖4 溶劑倍量對提取率的影響

2.3 正交試驗結果

2.3.1 正交試驗設計 正交試驗設計及分析結果見表2。由極差分析可知，溶劑倍量和乙醇濃度對四時青總黃酮提取影響較大，各因素主次順序為：溶劑倍量＞乙醇濃度＞提取時間，較優提取工藝為A2B2C2。

表2 四時青總黃酮正交試驗設計及結果

2.3.2 方差分析 由表3 可知，B、C 對總黃酮提取率影響顯著（P ＜0.05），A 對總黃酮提取率影響不顯著（P ＞0.05），影響四時青總黃酮提取率的主次因素為C ＞B ＞A，與表2 中分析結果相同。因此四時青總黃酮的最佳提取工藝條件為：提取時間60 min，乙醇濃度60%，溶劑倍量10 倍。

表3 正交試驗方差分析

2.3.3 提取條件的驗證 為驗證工藝的的準確性和合理性，按上述最優工藝進行提取，平行操作3 份，分別測定吸光度值，計算總黃酮提取率。結果顯示，最優工藝下，四時青總黃酮平均提取率為23.82%，RSD 為1.64%，說明該提取工藝穩定、可行。

2.4 提取次數的確定 由于提取次數對正交試驗結果影響較大，因此在篩選出最佳條件后對其單獨考察。按正交試驗確定的工藝提取四時青，平行操作3 份，每份分別提取2 次，2 次的提取液分別單獨處理，測定總黃酮的提取率，結果見表4。提取2 次與提取1 次相比，總黃酮提取率僅增加了3.04%，結合工業生產成本，四時青總黃酮的提取次數確定為1 次。

表4 四時青總黃酮提取次數考察%

3 結論

由單因素試驗和正交試驗結果可知，各因素中溶劑倍量對四時青總黃酮提取率影響最大，其次是乙醇濃度，對提取率影響最小的是提取時間。得到四時青總黃酮最佳提取工藝條件為：提取時間60 min，乙醇濃度60%，溶劑倍量10 倍，此條件下總黃酮提取率為23.82%，RSD 為1.64%，表明該提取工藝條件穩定、可行。