外泌體在腫瘤轉移和耐藥相關研究中的進展

魏欣宇 王文銳 楊清玲 陳昌杰

外泌體（exosome）是一種具有脂質雙分子層的盤狀分泌膜泡，其直徑在30～100 nm 之間。外泌體來自各種類型的細胞，包括癌細胞，間充質干細胞和多泡小體的免疫細胞［1］，故外泌體可從各種體液中分離出來，包括血液，尿液，唾液，母乳，羊水，腹水，腦脊液，膽汁和精液等。外泌體通過內向膜出芽經歷三個過程產生：細胞膜內陷，形成內體（endosome）；內體膜內陷，形成多泡體（multivesicular bodies，MVB）；多泡體與質膜融合后分泌到胞外成為外泌體［2］。外泌體在受體細胞中的MVB 處進行反向融合，隨后釋放其攜帶的重要信號分子，在細胞間實現信息的傳遞［3］，形成一種新的細胞-外泌體-細胞的信息傳遞模式，介導體內不同類型細胞之間的細胞間通訊。這些信號分子包含外泌體同源母細胞代謝物、蛋白質、脂類和豐富的核酸分子（mRNA、tRNA、lncRNA、circRNA、microRNA 等）以及外泌體中特定細胞成分的功能性，靶向性，機制驅動性積累［4］。

1 外泌體在疾病進程中的作用

外泌體可參與細胞增殖、分化、血管生成和傷口愈合等許多生物學過程，也可通過癌基因或者腫瘤抑制因子在腫瘤細胞間的傳遞促進腫瘤的發生或抵消腫瘤的進展。已有許多研究證明在改善心功能和減輕心肌纖維化等方面，干細胞釋放的外泌體顯示出其潛在的細胞治療和心臟修復能力［5］。另外，外泌體促進血管生成，但在炎癥條件下，單核細胞衍生的外泌體可誘導血管平滑肌細胞的凋亡，這是人類血管疾病的重要發生過程。外泌體還可調節基因表達和驅動免疫抑制或免疫刺激反應等多種生物學過程，如腫瘤細胞來源的外泌體可通過同時誘導人腫瘤細胞和細胞毒性T淋巴細胞的凋亡來實現免疫逃避。在代謝性疾病中，腫瘤來源的外泌體作用于小鼠和人的脂肪細胞和肌肉細胞而加重機體惡病質，促進腫瘤及其他慢性疾病的進展［6］。

2 外泌體在腫瘤微環境中的作用和機制

腫瘤微環境（TME）是腫瘤的發生、生長及轉移與腫瘤細胞所處的內外環境，其組成成分包含腫瘤相關成纖維細胞（CAF）、內皮細胞、免疫和炎癥細胞、骨髓源性細胞以及與腫瘤建立復雜交叉關系的細胞外基質［7］。外泌體是腫瘤微環境中的重要組成部分。腫瘤來源外泌體包含的腫瘤抗原和熱休克蛋白刺激免疫反應，包含的抑制分子配體如Fas-L、轉化生長因子β（TGF-β）和前列腺素E2（PGE2）既可降低細胞毒性又能建立免疫抑制腫瘤微環境［8］。腫瘤來源的外泌體miRNA 在TME 中誘導基質重編程，創造有利于腫瘤生長、轉移、免疫逃逸和化療耐藥的微環境［9］。在前列腺癌中，外泌體中攜帶的物質促進前列腺癌相關細胞的結締組織增生，促進腫瘤轉移［10］。

2.1 外泌體在腫瘤轉移中所起的作用和相應機制

腫瘤轉移是癌癥相關死亡的主要原因，許多研究已經確定了外泌體在腫瘤轉移中的直接侵襲作用和通過促進轉移，轉化和建立轉移前利基的特定效應促進轉移的作用［11］。腫瘤細胞來源的外泌體具有將轉移潛能轉移至受體細胞的能力，可為特定器官的細胞提供腫瘤轉移前微環境［12］。Chen［13］等從唾液腺腺樣囊性癌（SACC）患者血漿中分離出的外泌體中高表達lncRNA MRPL23 反義RNA 1（MRPL23-AS1），其與肺轉移和總體生存相關。MRPL23-AS1 以“外泌體分泌”方式作用于肺微血管內皮細胞，增加了微血管的通透性，協助體內SACC 癌細胞的肺轉移。用腦轉移細胞分泌的外泌體預處理腦微環境可以增強癌細胞的生長。腦轉移患者的腫瘤組織和外泌體中CEMIP 升高，CEMIP+外泌體被腦內皮細胞和小神經膠質細胞攝取后上調Ptgs2，Tnf 和Ccl/Cxcl 編碼的促炎性細胞因子，誘導血管周圍小生境中的內皮細胞和炎癥，促進腦血管重塑和轉移［14］。在引發轉移的結腸癌亞型中，上調的circLONP2 調節miR-17 的細胞內成熟，上調的成熟miR-7 以外泌體的形式被鄰近細胞內化而引起轉移起始能力在原發部位擴散并加速異種器官腫瘤轉移的形成［15］。另外，最近的研究［16］表明，對放化療殺傷的垂死腫瘤細胞分泌的大量外泌體進行RNA-Seq 檢測發現明顯變化的miRNAs，其中miR-194-5p 通過調節細胞周期，阻止細胞從G1 期進入S 期并促進DNA 損傷反應，增強TRCs 的存活，進而調控E2F3 的表達，增強腫瘤細胞再增殖和重新聚集。

2.2 外泌體與耐藥誘導相關研究

Boelens 等［17］發現間質細胞和乳腺癌細胞可通過分泌信號驅動化療和放療耐藥，通過異型相互作用，外泌體從基質轉移到乳腺癌細胞。外泌體中的RNA（主要是非編碼轉錄本和轉座元件）刺激模式識別受體RIG-I 激活stat1 依賴的抗病毒信號，促進對NOTCH3 的轉錄反應，并擴大治療抵抗腫瘤起始細胞。研究［18］證明在胃癌中，外泌體miR-522 主要來自于腫瘤微環境中的CAFs。順鉑和紫杉醇激活USP7/hnRNPA1 軸促進CAFs 中miR-522的分泌，進而降低ALOX15 的表達，減少癌細胞中脂質ros 的積累，最終降低化療敏感性。在表皮生長因子受體2 陽性（HER-2+）乳腺癌患者中，增強的miR-567 可以被包裝成外泌體，整合到受體細胞中，通過靶向ATG5 抑制自噬和逆轉曲妥珠單抗耐藥［19］。異質腫瘤可從外泌體中獲得耐藥表型。實驗證明［20］，短暫暴露于化療藥物可以顯著增加Rab8 介導的耐藥細胞釋放含有ABCB1 的細胞外囊泡，并通過Rab5 的下調加速這些細胞外囊泡循環回到敏感腫瘤細胞的質膜上。細胞間ABCB1轉移顯著增強，敏感的癌細胞獲得迅速但不可穩定持續存在的抗性，以逃避化療藥物的細胞毒性。研究發現放射治療有助于改變外泌體的分泌動態，x 射線可以以劑量依賴的方式激活MCF-7 細胞外泌體的生成和分泌，細胞通過改變活性氧和外泌體活性實現治療反應［21-22］。結直腸癌中，CAFs 來源的外泌體可以激活轉化生長因子factorβ（TGF-β）信號通路，而TGF-inhibitor 1 中和抗體可抑制這一作用，降低干細胞基因的克隆性和表達水平，CAFs 分泌外泌體促進結直腸癌細胞的干性，從而增加輻射抗性［23］。癌細胞的照射促進了tet2介導的miR-378 啟動子的去甲基化，miR-378a-3p過表達及其在外泌體中的負載，誘導NK 細胞顆粒酶b（GZMB）分泌減少，GZMB 表達降低導致NK 細胞毒性降低。故外泌體miRNA-378a-3p 在癌細胞中的過表達限制了自然殺傷細胞的細胞毒性，促進腫瘤進展［24］。

2.3 外泌體誘導免疫作用

腫瘤來源的外泌體（TEX）參與腫瘤的免疫抑制過程。TEX 將基因組DNA、mRNA 和miRNAs等信息傳遞到免疫細胞，重新編碼應答細胞的功能，直接或間接影響免疫細胞的發育、成熟和抗腫瘤活性［25］?，F已證明腫瘤和免疫細胞來源的外泌體攜帶腫瘤抗原并促進免疫，導致CD8+T 細胞和CD4+T 細胞活化，直接抑制腫瘤生長和對惡性腫瘤發展的抵抗［26］。在TEM 中，過表達的VEGF 和激活的VEGFR 以及磷脂酰絲氨酸由細胞和外泌體內膜到外膜的活化均可觸發免疫抑制作用，如抑制免疫細胞Treg 對NK、NKT、CD4+、CD8+等抗原提呈細胞的抑制作用［27］。實驗［28］證明，乳腺腫瘤細胞中上調CD73 表達的lncRNA SNHG16 可由癌細胞分泌的外泌體傳遞到Vδ1 T 細胞，SNHG16 通過海綿化吸收miR-16-5p 通過ceRNA 作用，導致其靶基因SMAD5 的失調，增強TGF-inhibitor 1/SMAD5 通路，上調Vδ1 T 細胞中CD73 的表達，證實了乳腺癌細胞來源的外泌體SNHG16/miR-16-5p/SMAD5 調控軸增強了TGF-cada1/SMAD5 通路的激活，從而誘導了CD73 的表達，增強T 細胞功能。

3 外泌體修飾

關于外泌體在腫瘤發生和治療方面已有諸多研究，外泌體用作診斷工具主要涉及使用可控外泌體，而不是利用天然外泌體的特性。外泌體的來源細胞的特性常被改造以產生具有特定生物學特點修飾的外泌體。在腫瘤微環境中，外泌體是程序性死亡配體1（PD-L1）進入受體細胞的轉運載體，遠處的腫瘤細胞可以通過外泌體PD-L1 對激活的T 細胞進行遠程攻擊實現免疫逃逸［29］。對T 細胞進行修飾，效應CAR-T 細胞分泌的CAR 外泌體表面攜帶CAR，表達高水平的細胞毒性分子并抑制腫瘤生長，但不表達程序性細胞死亡蛋白1（PD1）并且重組PD-L1 治療不會降低CAR-T 細胞外泌體的抗腫瘤作用。CAR 外泌體比CAR-T 細胞的治療應用更安全［30］。另外，外泌體還可以通過添加腫瘤靶標配體進行修飾或功能化，有研究為了對外泌體進行基因修飾，使用兩種不同表面的單克隆抗體，開發了一個用于控制細胞免疫的外泌體平臺：SMART-Exo。Shi X［31］通過抗人CD3 和抗人HER2 抗體的基因展示工程化外泌體，將SMART-Exo 應用于表達人類表皮生長因子受體2（HER2）的乳腺癌，從而導致SMART-Exos 雙重靶向T 細胞CD3 和乳腺癌相關的HER2 受體，通過重定向和激活細胞毒性T 細胞使其攻擊HER2+的乳腺癌細胞。設計的SMARTExos 在體外和體內均表現出高度有效的特異性抗腫瘤活性。最近還有研究［32］提出用微流體超聲處理方法，直接生成包含成像劑的外泌體膜（EM）、癌細胞膜（CCM）和脂質涂層聚乳酸-糖基乙酸（PLGA NP），由內體和質膜蛋白組成的腫瘤細胞來源的EM 包被的PLGA NPs 在體外和體內模型中均比大小和核殼結構相近的CCM-PLGA NPs 具有精確的同型靶向性。這種方法明顯提高了抗腫瘤的特異性。實驗［33］證明基于工程外泌體的抗結腸癌藥物5-FU 和miR-21 共傳遞系統能有效的促進細胞攝取并顯著下調5-FU 耐藥細胞中miR-21 的表達。

4 前景與展望

外泌體的生物學作用在疾病中的研究仍在進行，并且針對其實用價值和各種病理的診斷和治療的研究數量已大幅增加。這種優勢在于對疾病進行檢測和監測時，外泌體攜帶物質的復雜性提供了一個多功能的診斷窗口。外泌體在向病變細胞運送功能性貨物時的特征特性使其成為較好的治療載體，無論是在基礎水平還是應用水平［34］。最近幾年，科研人員一直都致力于探究外泌體的臨床應用，包括外泌體作為生物標志物檢測疾病的高效性和特異性、改造外泌體以提高其運載能力和外泌體在藥物方面的應用。此外，外泌體作為細胞間的通訊媒介，其介導的核酸傳遞是一種很有前景的基因治療策略［35］?？傊?，外泌體有望在腫瘤研究中取得進一步的進展，實現其在腫瘤早期檢測，診斷及治療中的臨床應用。