基于網絡藥理學和分子對接研究芪金合劑治療腎結石的作用機制

賀瀟 蔣偉平 劉起立 黃麗玲 毛璟弢 蔡蔚

〔摘要〕 目的 利用網絡藥理學和分子對接技術預測芪金合劑（黃芪、金錢草）治療腎結石的作用機制及潛在靶點。方法 利用多個數據庫獲取藥物有效成分、疾病靶點，取兩者交集基因;使用Cytoscape 3.8.0軟件構建“中藥-成分-靶點”調控網絡，將交集靶基因導入STRING數據庫，構建蛋白質相互作用網絡;并對交集基因進行拓撲分析、GO和KEGG富集分析;將有效成分與核心基因分子對接，計算最低結合能，制作分子對接模型圖。結果 獲得黃芪有效成分21種，金錢草有效成分10種，黃芪作用靶點396個，金錢草作用靶點263個，交集基因109個;根據KEGG富集分析結果獲得作用通路9條;“中藥-成分-靶點”網絡圖中芪金合劑的有效成分為槲皮素、山柰酚、異鼠李素;槲皮素與核心基因分子對接結合穩定。結論 芪金合劑可通過多靶點、多通路、多成分治療腎結石，槲皮素、山柰酚、異鼠李素可能是其治療作用的主要有效成分，其潛在的作用機制與炎癥、氧化應激反應、代謝、激素及免疫等通路密切相關，其作用靶點可能與AKT1、MAPK1、MAPK14、TNF、ESR1、JUN、FOS、TP53、MYC等多個基因有關。

〔關鍵詞〕 芪金合劑;腎結石;網絡藥理學;分子對接;作用機制

〔中圖分類號〕R285.5 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.12.015

Mechanism of Qijin Mixture in the Treatment of Kidney Stones Based on Network

Pharmacology and Molecular Docking

HE Xiao1， JIANG Weiping1， LIU Qili1， HUANG Liling1， MAO Jingtao1， CAI Wei2*

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. The First Affiliated Hospital of

Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China）

〔Abstract〕 Objective The mechanism and potential targets of Qijin Mixture [Huangqi （Astragali Radix）， Jinqiancao （Lysimachiae Herba）] in the treatment of kidney stones were predicted by network pharmacology and molecular docking technology. Methods Multiple databases were used to obtain drug active ingredients and disease targets， their intersection genes were selected; Cytoscape 3.8.0 software was used to construct a “traditional Chinese medicine-component-target” regulatory network， and the intersection target genes were imported into the STRING database to construct a protein-protein interaction network; and topological analysis， GO and KEGG enrichment analysis were performed for the intersection genes; the active ingredients and the core gene molecules were docked， the lowest binding energy was calculated， and a molecular docking model diagram was made. Results 21 kinds of active ingredients of Huangqi （Astragali Radix） were obtained， 10 kinds of active ingredients of Jinqiancao （Lysimachiae Herba） were obtained， 396 targets of Huangqi （Astragali Radix） were obtained， 263 targets of Jinqiancao （Lysimachiae Herba） were obtained， and 109 intersection genes were obtained. According to the results of KEGG enrichment analysis， 9 action pathways were obtained; the effective ingredients of Qijin Mixture in the network diagram of “traditional Chinese medicine-component-target” were quercetin， kaempferol and isorhamnetin; quercetin was stable in docking and binding with core gene molecules. Conclusion Qijin Mixture can treat kidney stones through multiple targets， multiple pathways， and multiple components. Quercetin， kaempferol and isorhamnetin may be the main active components of its therapeutic effect， and its potential mechanism of action is closely related to inflammation， oxidative stress response， metabolism， hormone and immune pathways， and its targets may be related to multiple genes such as AKT1， MAPK1， MAPK14， TNF， ESR1， JUN， FOS， TP53， MYC.

〔Keywords〕 Qijin Mixture; kidney stones; network pharmacology; molecular docking; mechanism

腎結石是泌尿外科常見的疾病之一，其發病率已達到1%～20%，呈逐年上升趨勢，治療后其復發率超過50%[1]，且復發結石患者再發的可能性更大[2]?，F其手術治療多以微創為主，包括體外沖擊波碎石術、經皮腎鏡取石術、輸尿管軟鏡取石術等。隨著腔鏡微創技術的不斷成熟，腎結石的治療手段也在不斷增多，但如何減少術后殘石、結石復發率高的現狀依然是眾多學者研究的熱點。

腎結石屬于中醫學“石淋”范疇，《諸病源候論·諸淋病候》中認為“石淋者，淋出而石也。腎主水，水結則化為石，故腎客砂石”。中醫藥治療腎結石歷史悠久，且臨床療效顯著，芪金合劑是由三金排石湯化裁而來，組成成分為金錢草、黃芪兩味中藥，可有效改善上尿路結石術后癥狀，提高手術清石率，減少術后殘石及結石復發的可能性[3-4]。

現代研究發現，廣金錢草提取物可抑制腎組織草酸鈣結晶的形成與沉積，保護腎小管細胞，減輕擴張程度，減輕腎間質慢性炎癥，對腎功能起到保護作用[5]，黃芪具有調節免疫功能、改善炎癥反應和微循環障礙、改善多器官損傷等作用[6]。

目前，對于金錢草、黃芪單藥藥理藥效研究較多，但對于二者聯合用藥的藥效研究較少，基于芪金合劑聯合應用治療上尿路結石術后的臨床療效，故本研究利用網絡藥理學和分子對接技術探討芪金合劑治療腎結石的作用機制及潛在靶點，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 ?有效成分的獲取及靶點名稱規范化

以“金錢草”“黃芪”為檢索詞，通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）進行檢索，將口服生物利用度（oral bioa?

vailability， OB）≥30%、類藥性（drug-likeness， DL）≥0.18作為活性成分篩選條件，篩查出符合條件的活性成分和其相對應的靶點。將物種設置為人，使用UniProt（http：//www.uniprot.org/）數據庫將靶點基因名稱校正。

1.2 ?腎結石相關靶點的獲取

以“kidney stones”為檢索詞，通過GeneCards、OMIM、PHARMGKB、DrugBank等數據庫獲取腎結石相關靶點，利用R語言R-4.0.5軟件將腎結石的相關靶點取交集合并，將疾病靶點與藥物有效成分的作用靶點進行映射取交集，制作Venn圖。

1.3 ?中藥-成分-靶點交互網絡構建

利用Cytoscape 3.8.0軟件構建“中藥-成分-靶點”調控網絡，此網絡圖中，節點代表關鍵化合物和靶點，邊代表節點之間相互作用的關系。

1.4 ?蛋白質相互作用（PPI）網絡與拓撲分析

考慮到交集靶基因之間的相互作用，將其導入STRING數據庫（https：//string-db.org/cgi/input.pl），物種選擇“人類”，并以互動分數“>0.9”的評分篩選蛋白的相互作用關系，隱藏離散點，構建PPI網絡。利用Cytoscape 3.8.0軟件，下載插件Cyto-NCA，根據其網絡中心度進行拓撲分析。

1.5 ?GO和KEGG富集

利用R語言R-4.0.5軟件及DOSE、clusterProfiler、enrichplot、pathview等程序包對交集基因進行GO、KEGG富集分析，選擇顯著富集的的生物過程（biological process， BP）、細胞組分（cell component， CC）、分子功能（molecular function， MF）前10項繪制柱狀圖。選擇顯著富集的前30條通路繪制氣泡圖。

1.6 ?分子對接

選擇“中藥-成分-靶點”調控網絡中含有最多相關靶基因的有效成分，利用PubChem CID數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載有效成分的3D結構。選擇交集基因拓撲分析的核心基因，利用PDB數據庫（http：//www1.rcsb.org/）下載核心基因相關蛋白的3D結構。使用AutoDock Tools 1.5.6軟件為受體蛋白添加氫原子和設置對接參數，所有配體和受體文件均保存為pdbqt格式。使用Autodock Vina軟件進行分子對接，并計算最低結合能，使用PyMol軟件生成分子對接模型圖。

2 結果

2.1 ?活性成分和靶基因的篩選

在TCMSP數據庫中，以OB≥30%、DL≥0.18為條件進行篩選，得到活性成分共30種，黃芪甲苷雖不滿足上述OB值與DL值的篩選條件，經查閱文獻發現[6]，黃芪甲苷為黃芪的主要活性成分，予以補充，故黃芪的活性成分有21種，金錢草11種（見表1）。將有效成分對應的靶點利用UniProt數據庫預測，選擇人的已證實的數據進行基因名稱標準化，最終獲得659個靶點，其中黃芪396個、金錢草263個。

2.2 ?“中藥-成分-靶點”網絡構建

如圖1所示，藥物作用靶點與腎結石的靶點基因交集為109個。將中藥、有效成分、交集靶點基因導入Cytoscape 3.8.0軟件中，設置節點與邊線將其相互關系繪制成可視化“中藥-成分-靶點”網絡圖（圖2）。黃芪與金錢草均含有的有效成分為槲皮素（MOL000098）、山柰酚（MOL000422）、異鼠李素（MOL000354），他們分別與84、31、16個靶基因相關。其中關聯度較高的靶基因為PTGS2基因（16個節點），其次是NCOA2、HSP90AB1、PRSS1、ESR1、MAPK14、JUN、AKT1、TNF、TP53、MAPK1、FOS、MYC、RB1等。

2.3 ?PPI網絡和拓撲分析

通過STRING數據庫獲PPI網絡見圖3，共98個蛋白質節點和377條邊。利用Cytoscape插件CytoNCA進行拓撲分析，選擇相關指標：介度中心性 （betwee-nness centrality， BC）、接近中心性（closenesscentrality， CC）、借助度中心性（degree centrality， DC）、特征向量中心性（eigenvector centrality， EC）、局部邊連通性（localaverage connectivity， LAC）和網絡中心性（network centrality， NC），選擇大于所有指標中位數的基因進行篩選，經過2次篩選，最終獲得核心基因10個，分別是ESR1、AKT1、JUN、FOS、MAPK1、MAPK14、TNF、TP53、MYC、RB1。見圖4。

2.4 ?GO和KEGG富集

GO富集分析從生物過程（BP）、細胞成分（CC）和分子功能（MF）3個水平闡明基因功能。BP主要涉及類固醇激素反應、細胞化學應激反應、脂多糖反應、對細菌起源分子的反應、活性氧代謝過程、凋亡信號通路的調節、凋亡信號通路的負調控等;CC主要與膜筏、膜微區、膜區、質膜筏、囊泡內腔、細胞質囊泡腔、RNA聚合酶II轉錄調節復合物、分泌顆粒內腔、轉錄調節復合物等相關。MF主要涉及核受體活性、配體激活、轉錄因子活性、DNA結合轉錄因子、RNA聚合酶II特異的DNA結合轉錄因子、類固醇激素受體活性、細胞因子活性、細胞因子受體結合、血紅素結合、受體配體活性、整聯蛋白結合等（圖5）。查閱國內外相關文獻研究發現，黃芪-金錢草治療腎結石的作用機制主要與脂質和動脈粥樣硬化、PI3K（磷脂酰肌醇-3-激酶）/Akt（蛋白激酶B）信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、AGE-RAGE（晚期糖基化產物-晚期糖基化終末產物受體）信號通路、MAPK（絲裂原活化蛋白激酶）信號通路、IL-17（白介素-17）信號通路、HIF-1（缺氧誘導因子-1）信號通路、TNF信號通路、雌激素信號通路等相關（圖6）。

2.5 ?分子對接

選擇中藥-成分-靶點調控網絡中含最多相關靶基因的有效成分作為小分子配體：槲皮素。選擇交集基因拓撲分析的核心基因：AKTI、ESR1、TNF、MAPK1、MAPK14、FOS、JUN、TP53、MYC、RB1共10個，分別與小分子配體進行分子對接。使用Autodock Vina軟件進行分子對接，并計算各個蛋白與小分子配體的最低結合能（表2），結合能小于0表示兩個分子自發結合，結合能越小，構象越穩定，使用PyMol軟件進行可視化（圖7）。

3 討論

3.1 ?芪金合劑治療腎結石的關鍵靶點

本研究通過交集基因拓撲分析獲得AKT1、MAPK1、MAPK14、TNF、ESR1、JUN、FOS、TP53、MYC、RB1等核心基因。AKT1的缺失會加劇腎臟損害，其機制與AKT1參與腎缺血再灌注損傷中腎小管的凋亡和炎癥反應有關[7]。ESR1通過調節脂肪組織的VEGF-A，增強血管生成，減少炎癥和改善脂肪組織功能[8]。Jun和Fos這2個原癌基因是MAPK信號通路的下游成員。c-Jun調節與動脈粥樣硬化有關的各種載脂蛋白和促炎分子的轉錄[9]，在先天免疫中起重要作用[10]，c-Fos可激活先天免疫信號傳導級聯以清除細菌，同時還參與了宿主防御機制[11]。MAPK1可以減輕脂多糖誘導的腎小球上皮細胞細胞損傷[12]。MAPK14可被促炎細胞因子激活，參與炎癥介質細胞因子（TNF-α、IL-1、IL-6、IL-1b）的生物合成，誘導相關炎癥蛋白。MYC原癌基因可通過對先天性和適應性免疫效應細胞以及免疫調節細胞因子的影響來調節腫瘤微環境[13]。TNF是健康生物體和患病條件下免疫反應的關鍵介質，可增強巨噬細胞活化和抗原呈遞，通過不同機制調節免疫。TNF耐受性可能代表了一種涉及終止炎癥和防止過度或長期炎癥的保護機制。否則，耐受性也可能是免疫麻痹的觸發因素，從而導致嚴重的炎癥性疾病，如敗血癥[14]。RB1是腫瘤抑制基因，經查閱文獻發現與本次研究無明顯關聯性。故芪金合劑治療腎結石與AKT1、MAPK1、MAPK14、TNF、ESR1、JUN、FOS、TP53、MYC等靶點相關。

3.2 ?芪金合劑有效成分

“中藥-成分-靶點”網絡圖中，芪金合劑的有效成分為槲皮素、山柰酚、異鼠李素。槲皮素可有效預防尿石癥，主要潛在機制包括利尿、解痙和抗氧化活性，以及對結晶、成核和晶體聚集的抑制作用[15]。槲皮素通過上調PI3K/AKT通路降低組織炎癥和氧化應激反應[16]。還可下調脂多糖誘導的相關蛋白表達，減少血清中促炎因子的生成，改善膿毒血癥相關的急性腎損傷[17]。高尿酸血癥早期在腎臟尚未形成尿酸鹽沉積時亦導致腎損傷，但槲皮素降尿酸、抗炎、抗氧化的作用可以減少這種腎損傷[18]。

山柰酚具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤和抗糖尿病等多種藥理作用[19]。山柰酚能減少腎臟中AGE積累和ROS（活性氧）產生所引起的線粒體凋亡[20]。山柰酚能減少ROS和亞硝酸鹽生成，減少尿液中草酸鈣晶體的形成，具有急性和長期利尿作用以及保護腎臟的特性[21]，同時可減少草酸鈣晶體沉積和晶體誘導的腎氧化和炎癥損傷[22]。異鼠李素能夠減少ROS、脂質堆積，有抗動脈粥樣硬化、減少巨噬細胞凋亡的作用，其作用途徑與PI3K/AKT通路相關[23]，還可通過抑制TNF-α達到抗菌消炎作用[24]。故芪金合劑可通過上述有效成分發揮抗炎、抗氧化應激反應以及減少晶體代謝沉積、保護腎臟的作用從而治療腎結石。

3.3 ?芪金合劑作用通路

芪金合劑治療腎結石的作用通路可分為兩類：（1）炎癥與氧化應激反應通路：PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路、HIF-1信號通路;（2）免疫、代謝與激素相關通路：脂質和動脈粥樣硬化、AGE-RAGE信號通路、雌激素信號通路。PI3K/Akt信號通路的失活抑制了腎結石中腎小管上皮細胞間質轉化的發展和草酸鈣晶體的形成[25]，對腎草酸鈣晶體誘導的氧化應激、炎癥反應和細胞凋亡也有抑制作用[26]。MAPK信號通路介導了草酸鈣-水晶體誘導的晶體黏附變化[27]，抑制MAPK磷酸化，增強Akt磷酸化，可減輕腎小管上皮細胞的氧化應激損傷和凋亡，達到減少腎結石形成的可能性[28]。TNF、IL-17信號通路與炎癥反應有關，其中，IL-17信號通路在對損傷、生理應激和感染的反應中維持健康方面具有重要作用[29]。TNF信號通路不僅介導多種炎癥反應，同時參與免疫應答。HIF-1是細胞對缺氧適應性反應的主要調節因子，在調節腎小管上皮細胞的多個細胞過程中起著關鍵作用，包括凋亡、自噬、炎癥和代謝模式改變[30]。炎癥效應機制在脂質和動脈粥樣硬化通路中亦發揮著重要作用，嚴重的內質網應激可誘導下游TNF等炎癥細胞因子釋放，從而引發血管內皮細胞損傷后的炎癥細胞活化和一系列慢性炎癥反應[31]。AGEs通過與rage受體結合，通過產生促炎細胞因子、ROS等來誘導炎癥和免疫抑制，這些病理分子導致腎系膜、內皮和足細胞損傷[32]。雌激素信號可起到保護腎臟的作用[34]，雌激素β受體可通過減少草酸合成及草酸引起的腎臟氧化應激損傷，從而抑制草酸鈣結石的形成[33]。故芪金合劑可通過上述通路起到抗炎、抗氧化應激損傷、減少結石晶體的代謝沉積、調節機體免疫等作用治療腎結石。

本研究通過網絡藥理學分析了芪金合劑的有效成分，并對藥物作用靶點及通路進行功能分析，以分子對接技術驗證藥物有效成分與腎結石靶點的結合，預測芪金合劑治療腎結石潛在的作用機制與炎癥、氧化應激反應、代謝、激素及免疫等通路密切相關，其作用靶點與AKT1、MAPK1、MAPK14、TNF、ESR1、JUN、FOS、TP53、MYC等多個基因有關，說明芪金合劑可通過多靶點、多通路、多成分的途徑治療腎結石。腎結石的發病原因與多種因素相關，中醫理論中講究“異病同治”，有望在今后的研究中找到多種疾病的協同作用靶點，發揮中藥治療的最大效果。此外，通過本次研究，可對中藥復方的作用機制、有效成分提取、藥物溶石等方面進一步深入到實驗研究中。

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〔收稿日期〕2021-06-19

〔基金項目〕湖南中醫藥大學校級科研基金項目（2018XJJJ57）;湖南省教育科學規劃課題（XJK015BGD049）;湖南省科技創新計劃項目（2018SK51206）。

〔作者簡介〕賀 ?瀟，女，在讀碩士研究生，研究方向：中西醫結合臨床-泌尿外科。

〔通信作者〕*蔡 ?蔚，女，博士，主任醫師，碩士研究生導師，E-mail：2240430455@qq.com。