松針精油對苜蓿青貯飼料營養成分和發酵品質的影響

孫建政，孫國君，王曉娜，沈思軍，李 劼

（石河子大學動物科技學院，新疆 石河子 832000）

飼料青貯發酵是一個復雜的微生物變化過程，參與青貯過程的微生物種類眾多，主要有腐敗菌、霉菌、芽孢桿菌、乳酸菌（LAB）等，這些微生物存在于青貯原料、青貯發酵過程中和發酵完成后的開窖使用階段[1]。LIN等[2]分析紫花苜蓿等青貯原料上的微生物種類，發現其中主要是腸桿菌、酵母菌和霉菌，LAB只占到微生物總數的5%。腐敗菌、霉菌或其它雜菌的存在會影響LAB的繁殖，不利于青貯的開始或后期進行，從而造成青貯品質的降低，因此抑制有害微生物的繁殖是提高青貯飼料品質，乃至青貯成敗的關鍵。植物精油是一類易揮發、可隨水蒸氣蒸餾出來的油狀液體的總稱，是植物的次生代謝物質，具有顯著的抑菌或殺菌活性。近年來研究發現，在飼料青貯中添加肉桂精油、薄荷精油、百里香精油以及檸檬草精油等植物精油，均可有效改善青貯飼料的發酵品質和有氧穩定性[3-5]。

苜蓿緩沖度高，可溶性碳水化合物（WSC）含量低，單獨青貯較難，一般采用苜?；旌锨噘A或在苜蓿青貯原料中加入添加劑，調制苜蓿青貯飼料。松針是松科松屬植物的葉子，不僅富含氨基酸、微量元素、維生素，還含有精油、黃酮、有機酸等活性物質。前蘇聯科研人員發現，將落葉松針與苜蓿按1∶1比例混合制成青貯飼料，pH值和產氣量最低，青貯飼料中微生物發酵過程和生命活動都受到極大抑制[6]。譚秀麗等[7]在苜蓿青貯飼料中添加10%、30%和50%的松針，也取得良好效果。TURAN A等[8]研究發現，孜然精油能夠提高苜蓿青貯的發酵品質和有氧穩定性，同時影響其化學和微生物特性。筆者認為，在松針和苜?；旌锨噘A過程中及開窖后，松針精油對青貯飼料中微生物的活動起到較強的抑制作用，進而改善青貯飼料的品質。迄今，國內外有關松針精油對青貯飼料品質影響的研究尚未見報道。因此，本試驗以松針精油為青貯飼料添加劑，研究松針精油對苜蓿青貯飼料營養成分和發酵品質的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

松針精油：以樟子松松針為原料，水蒸氣蒸餾法提取松針精油，氣相色譜質譜聯用技術（GC-MS）進行化學成分分析[9]，化學成分如表1所列。

表1 松針精油的主要化學成分及含量Table 1 The main chemical constituents and contents of pine needle essential oil

紫花苜蓿：苜蓿青貯原料，2020年6月初花期（第二茬）收割于石河子大學動物科技學院牧草試驗田。

1.2 試驗設計

采用單因子試驗設計，共設4個組，每組3個重復。紫花苜蓿收割后枯萎3h，切成1.0～2.0cm小段。將1.6、3.2和4.8g松針精油（精油濃度為0.9g·mL-1）分別溶解于100mL70%乙醇中，按100mL混合液∶10kg青貯原料（鮮重）的比例，噴灑在苜蓿原料表面，噴灑后立即攪拌均勻，使松針精油在每千克青貯原料（鮮重）中含量分別為160mg·kg-1（PNE1）、320mg·kg-1（PNE2）和480mg·kg-1（PNE3），對照（CK）均勻噴灑等體積70%乙醇。噴灑后立即攪拌均勻，裝入聚乙烯包裝袋，真空密封。放置室溫環境下發酵60d后，開袋取樣，測定各項指標。

1.3 測定指標

1.3.1 感官評定

依據德國農業協會青貯質量感官評分標準從色澤、氣味和質地3個方面進行等級評定[10]。氣味3個等級（0～14分），質地4個等級（0～4分），色澤3個等級（0～2分）。最后綜合三項得分，依次評定為1級16～20分（優良）、2級10～15分（尚好）、3級5～9分（中等）和4級0～4分（腐?。?。

1.3.2 營養成分分析

參照《飼料分析及飼料質量檢測技術》[11]，測定青貯飼料中干物質（DM）、粗蛋白質（CP）、酸性洗滌纖維（ADF）和中性洗滌纖維（NDF）含量。

相對飼喂價值（RFV）參考王郝為等[12]方法計算：

RFV＝DMI（%BW）×DDM（%DM）/1.29（以綿羊為動物基礎）

其中，DMI（%BW）＝120/NDF（%DM），DDM（%DM）＝88.9－0.779×ADF（%DM）。式中BW為體重；DMI為粗飼料干物質采食量，單位為%BW；DDM為可消化的干物質，單位為%DM。

1.3.3 發酵品質

pHSJ-5型智能酸度計測定pH值。苯酚-次氯酸鈉比色法測定氨態氮（NH3-N）含量[13]，計算NH3-N與總氮的比例（NH3-N/TN）。對羥基聯苯比色法測定乳酸（LA）含量[14]。蒽酮比色法測定WSC含量[15]。島津高效液相色譜儀測定乙酸（AA）、丙酸（PA）和丁酸（BA）含量[16]。

1.3.4 青貯微生物數量分析

各處理分別取5g新鮮的青貯樣品加入裝有45mL滅菌水的三角瓶中，室溫，180r·min-1，離心30min。取上清液用無菌水稀釋成10-1～10-77個濃度梯度。每個稀釋梯度分別取20μL涂布在相應培養基上，同時做兩個平行樣。LAB在MRS瓊脂上37℃培養48h并計數，酵母菌在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上28℃培養24h并計數，霉菌在察氏瓊脂培養基上28℃培養72h并計數，好氧細菌（AB）在營養瓊脂培養基上30℃培養24h并計數。

1.3.5 有氧穩定性測定

取1000g苜蓿樣品置于自封袋中，不封口，用量程為50℃的普通溫度計插入青貯飼料中心測定溫度變化。樣品避光保存，環境溫度根據實際情況確定，當青貯飼料的溫度超過環境溫度2℃時為止。

1.4 數據處理

利用Excel 2013軟件整理試驗數據，SPSS 21.0軟件進行單因素方差分析，并采用Duncan氏法進行多重比較，P＜0.05為差異顯著，試驗數據用平均值±標準差表示。

2 結果

2.1 苜蓿青貯的感官評定

如表2所列可知各處理苜蓿青貯飼料的感官評定得分，其中CK具有微弱的丁酸味，莖葉結構保持較差，呈黃綠色，等級為2級尚好。PNE1、PNE2和PNE3等級均為1級優良，表現為莖葉結構保持良好，呈黃綠色，具有松脂味。

表2 不同處理組苜蓿青貯的感官評分Table 2 Sensory evaluation of the alfalfa silage in different treatment groups

2.2 松針精油對苜蓿青貯營養成分的影響

如表3所列可知，各組苜蓿青貯的DM含量均無顯著差異（P＞0.05）；松針精油處理CP含量均顯著高于CK（P＜0.05），各精油處理間差異不顯著（P＞0.05）；各精油處理NDF含量與CK相比均顯著降低（P＜0.05），其中PNE2和PNE3顯著低于PNE1（P＜0.05），而PNE2和PNE3間差異不顯著（P＞0.05）；各精油處理ADF含量均顯著低于CK（P＜0.05），隨松針精油濃度增加，ADF含量呈降低趨勢，且處理間差異顯著（P＜0.05）；各精油處理苜蓿青貯的RFV顯著高于CK（P＜0.05），隨松針精油濃度增加，RFV呈升高趨勢，且處理間差異顯著（P＜0.05），其中PNE3的RFV含量最高。

表3 松針精油對苜蓿青貯營養成分和相對飼喂價值的影響（干物質基礎，單位：%）Table 3 Effect of pine needle essential oil on the nutritional components and relative feeding value of alfalfa silage（DM basis）

2.3 松針精油對苜蓿青貯發酵品質的影響

如表4所列可知，隨松針精油濃度增加，pH值呈降低趨勢，各精油處理pH值均顯著低于CK（P＜0.05），其 中PNE3顯 著 低 于PNE1和PNE2（P＜0.05），PNE1與PNE2間差異不顯著（P＞0.05）；各精油處理NH3-N/TN含量與CK相比均顯著降低（P＜0.05），PNE2和PNE3間差異不顯著（P＞0.05），且均低于PNE1（P＜0.05）；各精油處理的WSC含量均顯著 高 于CK（P＜0.05），PNE3顯 著 高 于PNE1和PNE2（P＜0.05），但PNE1與PNE2間差異不顯著（P＞0.05）；在LA含量表現上，CK和PNE1間無明顯差異（P＞0.05），PNE2和PNE3間差異不顯著（P＞0.05），但PNE2和PNE3顯著高于CK和PNE1（P＜0.05）；PNE3的AA含量顯著低于CK、PNE1和PNE2（P＜0.05），但CK、PNE1和PNE2間差異不顯著（P＞0.05）；PNE3的PA含量顯著高于CK、PNE1和PNE2（P＜0.05），但CK、PNE1和PNE2間差異不顯著（P＞0.05）；CK中能檢測出少量BA，其他精油處理中均未檢出。

表4 松針精油對苜蓿青貯飼料發酵品質的影響（干物質基礎）Table 4 Effect of pine needle essential oil on the fermentation quality of alfalfa silage（DM basis）

2.4 松針精油對苜蓿青貯微生物數量的影響

如表5所列可知，各精油處理苜蓿青貯的LAB數量均顯著高于CK（P＜0.05），其中PNE3顯著高于PNE1和PNE2（P＜0.05），PNE1與PNE2間無明顯差異（P＞0.05）；各精油處理的酵母菌類數量均低于CK（P＜0.05），PNE1與PNE2間差異不顯著（P＞0.05），PNE3顯著 高于PNE1（P＜0.05），PNE3與PNE2間差異不顯著（P＞0.05）；各精油處理AB數量均低于CK（P＜0.05），PNE3顯著高于PNE1和PNE2（P＜0.05），而PNE1與PNE2間差異不顯著（P＞0.05）。在CK中檢測到少量霉菌，各精油處理中均未檢出。

表5 松針精油對苜蓿青貯中微生物數量的影響（單位：log10CFU·g-1·FM）Table 5 Effect of pine needle essential oil on microbial counts in alfalfa silage

2.5 松針精油對苜蓿青貯有氧穩定性的影響

如圖1所示可知，CK、PNE1、PNE2和PNE3的有氧穩定性時間分別為156h、184h、212h和285h，各松針精油處理均顯著高于CK（P＜0.05），各精油處理間差異顯著（P＜0.05），隨精油濃度增加，各精油處理的有氧穩定性時間也顯著增高（P＜0.05）。

圖1 松針精油對苜蓿青貯飼料有氧穩定性的影響Figure 1 Effect of pine needle essential oil on the aerobic stability of alfalfa silage

3 討論

3.1 松針精油對苜蓿青貯營養成分的影響

本試驗中，添加松針精油對苜蓿青貯飼料的DM含量無明顯作用，這與TURAN A等[8]在苜蓿青貯中添加孜然精油的研究結果相似。這可能是因為在青貯前，對各組原料進行凋萎處理，含水率下降減少了青貯飼料的滲液損失。同時，在一定程度上抑制不良發酵，降低營養物質的損耗。紫花苜蓿的蛋白降解主要依靠植物蛋白酶和微生物蛋白酶兩者的共同作用[17]，青貯過程中pH值的變化對植物蛋白酶活性和微生物繁殖有很大影響，降低pH值可抑制蛋白酶活性[18]。本試驗顯示，松針精油處理苜蓿青貯中CP含量均顯著高于CK，其原因是添加松針精油，抑制有害菌繁殖，促進LAB生長，青貯飼料中LA水平提高，pH值降低，從而降低蛋白質的損失。

現有研究表明，在苜蓿青貯飼料[8]、全株玉米青貯飼料[19]中添加孜然精油，在甘蔗青貯飼料中添加檸檬草精油[5]，可降低青貯飼料中NDF和ADF含量，本試驗結果與上述結果相似。另外，隨松針精油濃度增加，苜蓿青貯飼料中NDF和ADF含量顯著降低，主要原因是松針精油抑制青貯發酵過程中有害菌的作用，降低WSC和蛋白質的損失，從而使NDF和ADF含量相對降低。TURAN A等[8]認為，孜然精油通過刺激相關酶的活性，使植物細胞壁分解。NDF和ADF含量降低，也可能是受pH值降低影響。但CHAVES A V等[20]研究發現，在大麥青貯中添加肉桂精油（120mg·kg-1DM），NDF和ADF含量反而高于對照組，添加等量牛至精油卻不影響NDF和ADF含量。這可能與精油種類及添加劑量等因素有關，其原因還有待深入研究。

飼料中NDF和ADF含量與RFV密切相關，NDF和ADF含量降低，RFV升高。本試驗中，隨松針精油濃度增加，苜蓿青貯飼料中NDF和ADF含量顯著降低，其RFV顯著提高。

3.2 松針精油對苜蓿青貯發酵品質的影響

本試驗顯示，松針精油處理苜蓿青貯pH值均顯著低于CK，原因是松針精油能夠抑制酵母菌、霉菌和AB等有害微生物的繁殖，使LAB迅速占據優勢地位，同時LAB代謝產生大量LA，從而快速降低苜蓿青貯的pH值。HODJATPANAH M A等[21]在玉米青貯中添加120mg·kg-1、240mg·kg-1的薄荷精油、孜然精油、百里香精油和牛至精油，發現僅240mg·kg-1薄荷精油可顯著降低其pH值，說明不同種類精油以及添加劑量對青貯發酵品質的影響不同。NH3-N/TN是反映青貯過程中蛋白質降解程度的指標，NH3-N/TN越低，青貯飼料品質越好。本試驗在苜蓿青貯中添加松針精油，顯著降低NH3-N/TN，這與在青貯飼料中添加植物精油可顯著降低NH3-N/TN水平的已有研究結果相似[3，8]。其主要原因是植物精油有抑制青貯飼料中酵母菌、梭狀芽孢桿菌等有害菌的生長，提高LAB數量的作用，這減少了蛋白質的分解，從而導致青貯飼料中NH3-N的產生減少。優質青貯飼料中LA的含量比例較高，BA含量較低[22]。本試驗在苜蓿青貯中添加松針精油后，LA和PA含量升高，AA含量降低，BA未檢出。BA是由腐敗菌和梭狀芽孢桿菌分解蛋白質、葡萄糖和LA而生成的產物[23]，松針精油處理組均未檢出BA，表明松針精油能夠有效抑制梭狀芽孢桿菌的生長，提高苜蓿青貯的發酵品質。

植物精油具有殺菌、抑菌作用，在青貯飼料中可抑制有害菌，促進有益菌生長。本試驗也進一步證明，添加松針精油后，可抑制苜蓿青貯中酵母菌、AB和霉菌等有害菌的生長，促進LAB的生長。

3.3 松針精油對苜蓿青貯有氧穩定性的影響

有氧穩定性決定青貯飼料暴露在空氣中的質量和安全性，有氧穩定性時間越長說明青貯飼料暴露在空氣中發生腐敗變質所需的時間越長，安全性越高。在青貯飼料中添加植物精油可改善青貯的有氧穩定性已有報道[3，8，24]，本試驗在苜蓿青貯中添加松針精油也取得相似結果，提高了青貯飼料的有氧穩定性。大量研究表明，青貯開封后，耐酸的好氧微生物首先開始利用LA和WSC大量繁殖，使得pH值升高，進而不耐酸的微生物開始繁殖，有害微生物占據主要地位，導致青貯腐敗變質[25，26]。本研究中精油處理的有氧穩定性顯著高于CK，且有氧穩定性隨松針精油濃度增加而提高，這可能是由于松針精油能抑制酵母菌和霉菌等有害微生物的生長，抑制青貯飼料開封后的二次發酵，進而有力證明添加松針精油可提高苜蓿青貯的有氧穩定性。

4 結論

苜蓿青貯中添加松針精油可提高苜蓿青貯中CP和WSC的含量，降低pH值，同時NH3-N、NDF和ADF的含量也降低。松針精油可抑制苜蓿青貯中酵母菌、霉菌和AB的生長，提高苜蓿青貯的有氧穩定性，從而改善苜蓿青貯飼料的品質。