不同產地稻花香水稻代謝產物差異分析

馮玉超，楊宏志,2，安 宇,2，張 舒，盛亞男，王長遠,2,

（1.黑龍江八一農墾大學食品學院, 黑龍江大慶 163319；2.國家雜糧工程技術研究中心, 黑龍江大慶163319）

水稻是我國主要的糧食作物，它含有豐富的營養成分和人體必需的微量元素，可滿足機體健康需求[1-2]。不同的地理位置以及環境因素使得水稻品種多樣、類型豐富，同時其質量品質也存在顯著差異。生活水平的不斷提高使得人們更加注重稻米風味及營養品質，地理標志稻米產品質優味美，雖價格較高，但供不應求。故稻米市場中頻繁出現交易行為不規范的情況，違法者利用這些品牌嚴重損害市場秩序與原產地產品的價值，使消費者權益得不到保障，面對眾多食品安全及市場問題，產地識別或溯源成為解決該問題的有效手段。

目前，應用于實際生活的溯源手段為數據編碼記錄技術，技術門檻不高，易于在產業中推行，但因其相關信息均可被人為更改或操縱，故仍需挖掘更真實、有效的溯源方法及手段。近年，國內外也開展了大量關于水稻產地溯源方面的研究，如采用穩定同位素技術[3-4]、近紅外光譜技術[5]、礦物元素分析技術[6-7]、有機組分指紋圖譜技術[8]、拉曼光譜技術[9-10]、頂空固相微萃取-氣質聯用技術[11-12]等進行溯源，這些方式與大米產地的氣候、土壤、溫度等相關的同位素組成、礦物元素含量、化學成分組成及風味特征物質等相關，而近年更關注水稻本身特性的代謝組學溯源方法逐漸成為研究熱點[13-16]。產地環境對水稻的生長具有重要的影響，不同產地生長的水稻其代謝也會存在差異，最終代謝通路的終端物質則會將這些差異體現出來，水稻的代謝物就是代謝過程的終端物質。王玲[17]發現水稻種子在不同生長環境、不同傳代以及轉入外來基因的情況下，其代謝產物都會發生不同程度的改變，且與基因修飾的影響相比較，不同生長環境對水稻代謝物帶來的影響更大。程建華等[18]對海南和武漢的轉Bt基因大米進行了代謝組學研究，發現轉Bt基因大米與其親本大米中甘油和鼠李糖兩種代謝物的含量存在顯著性差異，產地對大米間代謝組學的差異影響要顯著強于外源基因。

對水稻代謝物進行研究，可以從一個新的角度，直觀地分析不同產地水稻的差異，從而為水稻及農產品的產地鑒別以及溯源提供新的研究方向。本研究基于GC-MS的代謝組學平臺，以稻花香品種水稻為研究對象，通過兩產地稻花香水稻在代謝物水平的差異分析, 對不同產地間水稻的品質以及代謝差異機制進行分析，為水稻產地區分及農產品溯源提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

稻花香水稻 采自黑龍江省寧安（NA）和五常(WC)兩個地理標志稻米保護區，五常地區樣品采集點分布于9個農場，寧安地區樣品采集點分布于7個農場，每個保護區共采集20個糙米樣品（后文圖中的NA代表寧安地區樣本，WC代表五常地區樣本），兩產地稻花香水稻施肥、澆灌水源以及耕作方式具有統一性。在大田收割前于保護范圍內依據代表性采樣原則，采用五點采樣法進行隨機采集，每個地塊隨機設置5個重復點，從每個位置收集1～2 kg的稻穗。將收集的稻谷樣品清洗干凈并風干至水分含量為14%～15%，在稻穗頂部相同的位置將稻谷脫粒，然后裝入尼龍網眼袋中，實驗前將樣品混合均勻，水稻樣品采集自2019年；吡啶（≥99.9%色譜純）、甲醇（色譜純） 阿拉丁試劑有限公司；2-氯苯丙氨酸（純度98.5%）、甲氧基胺鹽酸鹽（純度98%）、N,O-雙（三甲基硅）三氟乙酰胺（含三甲基氯硅烷）99%BSTFA+1%TMCS 均購自麥克林試劑有限公司。

7890A/5975C GC-MS 美國Agilent公司；色譜柱HP-5ms（30 m×0.25 mm×0.25 μm） Agilent J& W Scientific公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 樣品處理方法和色譜方法參照程建華等[18]和ZHOU 等[19]的方法并略有修改。水稻種子液氮研磨后稱取50 mg粉末于2 mL的EP管中，加入800 μL甲醇渦旋混勻30 s，而后置于4 ℃離心機中，12000 r/min 離心15 min，之后吸取200 μL上清液轉入進樣小瓶中氮氣吹干。衍生化：取30 μL甲氧氨鹽酸吡啶溶液至濃縮后的樣品中，渦旋混勻至完全溶解，置于37 ℃恒溫箱90 min，取出后加入30 μL BSTFA，置于70 ℃烘箱60 min，取出后待檢測。衍生化處理后24 h內分析所有樣品。

1.2.2 GC-MS檢測 分析平臺：Agilent 7890A/5975C GC-MS。用自動進樣器進樣1 μL。色譜柱為30 m的HP-5ms，色譜柱的內徑為0.25 mm，膜厚為0.25 μm。采取不分流進樣，進樣溫度為280 ℃，界面設置為250 ℃，離子源調節為230 ℃，四極桿溫度調節至150 ℃。使用氦氣（純度＞99.999%）作為載氣，固定流速為2 mL/min。溫度設定為：80 ℃下等溫加熱2 min，然后以10 ℃/min將溫度升至320 ℃，最后維持320 ℃加熱6 min。在注入下一個樣品之前系統在80 ℃溫度下平衡6 min。使用全掃描模式，掃描范圍為50～550 m/z。

1.2.3 數據分析 GC-MS代謝組學數據分析由上海百趣生物醫學科技有限公司進行。在R軟件平臺下使用XCMS軟件包提取GC-MS數據并進行預處理，然后將已編輯的數據矩陣導入SIMCA軟件（V14.1, Sartorius Stedim Data Analytics AB, Umea,Sweden），進行主成分分析（ PCA） 和正交偏最小二乘-判別分析（ OPLS-DA）等多元統計分析，之后根據學生t檢驗（student’st-test）的P值（P-value）小于0.05，同時OPLS-DA模型第一主成分的變量投影重要度（variable importance in the projection, VIP）大于1，進行差異性代謝產物的篩選。

根據保留時間和質荷比（m/z），在Fiehn代謝組數據庫中進行代謝物及差異代謝物的定性。對單個峰基于四分位數距對偏離值進行過濾以去除噪音，只保留單組空值不多于50%或所有組中空值不多于50%的峰面積數據，其次對原始數據中的缺失值進行模擬，數值模擬方法為最小值二分之一法進行填補，最后進行數據標準化處理，利用每個樣本的總離子流進行歸一化，可為代謝物進行定量。

對篩選出的差異代謝物進行KEGG[20]注釋，檢索出差異代謝物映射的所有通路，然后通過對差異代謝物所在通路的綜合分析（包括富集分析和拓撲分析），對通路進行進一步的篩選，找到與代謝物差異相關性最高的關鍵通路。

2 結果與分析

2.1 離子流色譜圖

通過對GC-MS原始數據的處理，五常地區稻花香樣本共檢測出291個峰，寧安地區稻花香樣本共檢測出318個峰，兩產地稻花香的離子流色譜圖如圖1和圖2所示，兩個產地間的稻花香樣本的總離子流色譜圖大體相近，但存在一定的差異性，色譜峰基線平穩。

2.2 代謝物定性結果分析

代謝物通過Fiehn數據庫進行定性，相似度越接近1000越準確，但是組學中代謝產物多數為中間代謝產物，并不是所有物質均有標準品可依據，故存在部分代謝產物相似度不是特別高的情況。兩產地共鑒定到127個代謝物，五常地區鑒定出99個代謝物，寧安地區鑒定出104個代謝物（標注見圖1和圖2），兩產地稻花香水稻同時擁有的代謝物有76個，兩產地相比較，五常地區獨有的代謝物有23個，寧安地區獨有的代謝物有28個。代謝物定性結果如表1所示，序號1～76為共有代謝物，序號77～99為五常地區稻花香水稻獨有的代謝物，序號100～127為寧安地區稻花香水稻獨有代謝物。

圖1 五常稻花香典型樣本總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of typical samples in the WC

圖2 寧安稻花香典型樣本總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatogram of typical samples in the NA

由表1可知，從寧安和五常產地的大米中鑒定出的代謝物包括脂肪酸及其衍生物，氨基酸及其衍生物，糖類及其衍生物，固醇類和其他物質，其他類包括胺、醛、烷烴、腺苷、有機酸、無機鹽、酮、烯烴、嘌呤等。從數量上看，五常產地的稻花香樣品中，各種物質的比例為脂肪酸及其衍生物占22.22%，糖及其衍生物占27.27%，氨基酸及其衍生物占7.07%，醇及其衍生物占10.10%，酚類占7.07%，類固醇及其衍生物占2.02%，其他類占24.24%。寧安產地的稻花香樣品中，各種物質的比例為脂肪酸及其衍生物占19.23%，糖及其衍生物占31.73%，氨基酸及其衍生物占7.69%，醇及其衍生物占10.58%。酚類占4.81%，類固醇及其衍生物占2.88%，其他類占23.08%。對比可知，五常產地的稻花香水稻中脂肪酸及其衍生物、酚類物質以及其他類物質在數量上所占的比例要高于寧安地區。寧安產地的稻花香水稻中糖類及其衍生物、氨基酸及其衍生物和固醇類物質在數量上所占的比例要高于五常地區。研究表明，氨基酸除了用于蛋白質的合成外，還是次生代謝產物（如激素和植物防御相關物質）的前體，氨基酸的合成直接或間接影響植物生長發育的各個方面[21]。糖的代謝和運輸分布影響糖類進入儲庫細胞以及糖在儲庫細胞中的儲存，從而影響植物材料的質量。稻米中的脂類物質（甘油脂類、游離脂肪酸、固醇類等）含量很少,但在水稻生長發育期間的代謝變化對其生長適應性有重要影響，對植物細胞骨架重塑、生長發育、逆境脅迫、激素響應、衰老過程等具有顯著的生理效應[22-24]。脂類作為稻米的重要組分，不僅具有豐富且獨特的營養價值[25]，而且對稻米品質尤其是蒸煮食味品質也具有較大影響[26-27]，優質水稻品種中脂類物質含量通常要高于非優質的水稻品種。根據兩個產地的稻花香樣品中代謝產物的情況，發現同一品種的稻米在不同產地生長其代謝物數量和比例是不同的，說明產地對稻米代謝產物的種類具有較大影響，不同產地的稻米具有不同的代謝物組成。

表1 代謝產物定性結果Table 1 Qualitative results of metabolites

續表 1

續表 1

2.3 主成分分析（PCA）

主成分分析（principal component analysis, PCA）是將一組觀測的可能相關變量，通過正交變換轉換為線性不相關變量（即主成分）的統計方法，可以揭示數據的內部結構，有效地利用少量的主成分使得數據的維度降低。圖3為兩產地稻花香樣品的PCA得分圖，本次分析中R2X=0.515，Q2=0.182，第一主成分貢獻度為36.4%，第二主成分貢獻度為29.7%。由圖3可以看出，除個別異常樣本外，基本處于95%置信區間（Hotelling’s T-squared ellipse）內，兩產地的稻花香樣本并沒有區分開，存在重疊的現象，可能是由于相同品種，代謝物種類相近的原因造成的，PCA是從整體上反映樣本的情況，所以區分不明顯，但同樣可以看出兩產地的樣本均存在明顯的聚集區。

圖3 NA組與WC組的PCA模型的得分散點圖Fig.3 Score scatter plot of PCA model for group NA vs WC

2.4 正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）及置換檢驗

使用PCA模型進行分析，因相關變量的影響，差異變量會分散到更多的主成分上，無法進行更好的可視化和后續分析。所以下面采用正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal projections to latent structures-discriminant analysis, OPLS-DA）的統計方法對結果進行分析。通過OPLS-DA分析，可以過濾掉代謝物中與分類變量不相關的正交變量，并對非正交變量和正交變量分別進行分析，從而獲取更加可靠的代謝物組間差異與實驗組的相關程度信息。圖4為兩產地稻花香OPLS-DA得分圖。

圖4 NA組與WC組的OPLS-DA模型的得分散點圖Fig.4 Score scatter plot of OPLS-DA model for group NA vs WC

從OPLS-DA得分圖的結果可以看出，兩組樣本區分比較明顯，樣本基本處于95%置信區間內。本次分析共得到兩個主成分，第一主成分貢獻度為29.8%，第二主成分貢獻度為21.3%。R2X=0.449，R2Y=0.649，Q2=0.531，R2X與R2Y數值相差不多，且Q2值大于0.5，說明OPLS-DA模型的預測性較好，不存在過擬合現象。由圖4可知，五常地區稻花香樣本主要分布在左側的置信區間內，而寧安地區稻花香樣本分布在右側的置信區間內，樣本點間沒有重疊，區分效果較好。同時可以發現每個產地的20個樣本點之間存在較大的距離，相對較分散。這可能與采樣地點不同有關，為了體現產地的區別，所以水稻樣本的采集覆蓋整個地理保護區域，而不局限于一個采樣點，使研究結果具有普遍性。由OPLS-DA結果可以看出，產地對水稻的代謝具有顯著的影響。

置換檢驗通過隨機改變分類變量Y的排列順序，多次（次數n=200）建立對應的OPLS-DA模型以獲取隨機模型的R2Y和Q2值，在避免檢驗模型的過擬合以及評估模型的統計顯著性上有重要作用。OPLS-DA模型的置換檢驗結果如圖5所示。圖中橫坐標表示置換檢驗的置換保留度（與原模型Y變量順序一致的比例，置換保留度等于1處的點即為原模型的R2Y和Q2值），縱坐標表示R2Y或Q2的取值，綠色圓點表示置換檢驗得到的R2Y值，藍色方點表示置換檢驗得到的Q2值，兩條虛線分別表示R2Y和Q2的回歸線。原模型R2Y比較接近1，說明建立的模型比較符合樣本數據的真實情況；原模型Q2大于0.5，說明如果有新樣本加入模型，會得到較為近似的分布情況，總的來說原模型可以較好地解釋兩組樣本之間的差異。置換檢驗隨機模型的Q2值均小于原模型的Q2值；Q2的回歸線與縱軸的截距小于零；同時隨著置換保留度逐漸降低，置換的Y變量比例增大，隨機模型的Q2逐漸下降。說明原模型具有良好的穩健性，不存在過擬合現象，即OPLSDA得分圖結果準確。

圖5 NA與WC組的OPLS-DA模型的置換檢驗Fig.5 Permutation test of OPLS-DA model for group NA vs WC

2.5 差異代謝物的篩選

采用OPLS-DA模型的VIP（variable importance in the projection）值（閾值≥1），并結合學生氏t檢驗（student’st-test）的P值（閾值＜0.05）來篩選差異代謝物。在Fiehn數據庫中通過保留時間等條件與庫中物質進行匹配，從而進行物質差異性代謝物的定性，寧安地區對五常地區篩選的差異代謝物定性結果如表2所示。

寧安產地和五常產地的稻花香樣品中共篩選出22個差異代謝物。差異代謝物為兩產地水稻共同擁有的代謝物，但是含量上存在顯著差異。大部分差異代謝物是脂肪酸和脂肪酸衍生物，以及少量糖、有機酸、多元醇和其他物質。在含量上，由表2可知，寧安產地稻花香樣品中有9個差異代謝物的含量均低于五常地區，這些物質多為酚、醛、醇類物質。寧安地區稻花香水稻中有13個代謝物的含量高于五常地區，這些物質多數為脂肪酸及脂肪酸的衍生物，倍性變化在1.34～1.81倍之間。研究表明，溫度對水稻中脂肪酸的含量有較大的影響[28]。寧安地區屬于溫帶大陸性季風氣候，五常屬于中溫帶大陸性季風氣候，寧安獨特的玄武巖“石板地”使地溫、水溫都要略高于五常地區，水稻成熟度更高，所以導致寧安稻花香中脂肪酸的含量要高于五常地區。與2.2中得到的結果綜合分析，可以發現數量上，寧安地區的水稻其脂肪酸等脂類物質在全部代謝物中所占的比例要少于五常地區。但是在含量上，寧安地區脂類物質要顯著高于五常地區，酚類物質在數量和含量上均是寧安地區低于五常地區，醇類物質在數量上兩產地占比相近，含量上寧安地區要低于五常地區。綜上所述，產地對稻米代謝物中影響最大的物質為脂肪酸及其衍生物。

表2 差異代謝物定性結果Table 2 Differential metabolite qualitative results

2.6 差異代謝物的層次聚類分析

對差異代謝物的定量值計算歐式距離矩陣（Euclidean distance matrix），以完全連鎖方法對差異代謝物進行聚類分析，并以熱力圖進行展示，結果如圖6所示。

圖6 中橫坐標代表不同實驗分組，左側為五常地區稻花香樣本，右側為寧安地區樣本；縱坐標代表該組對比的差異代謝物，不同位置的色塊代表對應位置代謝物的相對表達量，紅色代表高表達量，藍色代表低表達量。圖6可以分成上下兩個區域，圖右側的前9個代謝物為上半部分，下方13個差異代謝物為下半部分。在上半部分中可以看出五常地區的樣本中9個代謝物的表達量明顯高于寧安地區樣本代謝物的表達量，這9個代謝物分別為甜菜堿β-環氧丙烷、未知物217、2-脫氧赤蘚糖醇、亞油酸、芐醇、2-氨基苯酚、苯酚、水楊醛、皮糖醇3，多數為酚類、醛類以及多元醇類物質。在下半部分中由顏色區域可知，寧安地區的除上述9個代謝物外的13個差異代謝物的表達量要明顯高于五常地區，這13個差異代謝物多數為脂肪酸以及脂肪酸的衍生物。從聚類分析的顏色變異程度上可以看出，產地不同，脂肪酸類物質含量差異更顯著。

圖6 NA與WC組的層次聚類分析熱圖Fig.6 Heatmap of hierarchical clustering analysis for group NA vs WC

2.7 差異代謝物的代謝通路分析

生物體中的復雜代謝反應及其調控并不單獨進行，往往由不同基因和蛋白質形成復雜的通路和網絡，它們的相互影響和相互調控最終導致代謝組發生系統性的改變。通過京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG） Pathway數 據 庫http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html，共檢索到差異代謝物參與的19個水稻的代謝通路，分別為不飽和脂肪酸的生物合成（ReFSEQ），水稻的代謝途徑（ReFSEQ），脂肪酸生物合成，水稻角質、絲氨酸和蠟生物合成（ReFSEQ），枸櫞酸循環（TCA循環），水稻脂肪酸延伸，脂肪酸降解，水稻氧化磷酸化，精氨酸生物合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，酪氨酸代謝，苯丙氨酸代謝，亞油酸代謝，丙酮酸代謝，丁酸代謝，煙酰胺和煙酰胺代謝，次生代謝物的生物合成，碳代謝，脂肪酸代謝。KEGG注釋分析僅找到所有差異代謝物參與的通路，為了找到與產地影響密切相關的通路，需要對差異代謝物進行進一步的代謝通路分析。通過對差異代謝物所在通路的綜合分析（包括富集分析和拓撲分析），可以對通路進行進一步的篩選，找到與代謝物差異相關性最高的關鍵通路。首先，通過差異代謝物對KEGG、PubChem等權威代謝物數據庫進行映射，映射出3個物質，亞油酸、棕櫚酸以及富馬酸，且均為精確匹配。在取得差異代謝物的匹配信息后，對對應物種Oryza sativa japonica （Japanese rice） 的通路數據庫進行搜索和代謝通路分析，代謝通路分析如表3所示。

由表3可知，共找到8條與代謝物差異相關性最高的關鍵通路，包含兩大類代謝即脂肪酸代謝和氨基酸代謝，而這8條通路中的差異代謝物分別為亞油酸、棕櫚酸以及富馬酸，其中富馬酸參與的代謝通路有4條，棕櫚酸參與的有3條，可見這兩種差異代謝物是處于多條通路的交集處，對通路影響較大。

表3 差異代謝物的代謝途徑Table 3 Metabolic pathways of the differential metabolites

代謝通路分析的結果以氣泡圖進行展示，如圖7所示。氣泡圖中每一個氣泡代表一個代謝通路，氣泡所在橫坐標和氣泡大小表示該通路在拓撲分析中的影響因子大小，越大影響因子越大；氣泡所在縱坐標和氣泡顏色表示富集分析的P值（取負自然對數，即-lnP-value），顏色越深P值越小，富集程度越明顯。由圖7可知，亞油酸代謝處的氣泡顏色最深，而且最大，可見亞油酸對兩產地稻花香水稻之間差異的影響最大，其次是棕櫚酸和富馬酸。亞油酸、棕櫚酸和富馬酸是稻米脂肪酸的主要組成成分，亞油酸和富馬酸屬于不飽和脂肪酸，而棕櫚酸屬于飽和脂肪酸。脂肪酸是水稻品質的關鍵決定因子[29]，稻米中脂類含量與稻米品質呈顯著正相關[30]，亞油酸在水稻脂肪中含量較高，可提高蒸煮時的食味品質，富馬酸不僅可以提升蒸煮時的水稻香味，還起到酸度調節劑的作用，也可以提高水稻的食味品質，而棕櫚酸是一種高級的飽和脂肪酸，對稻米的色澤、口感等也具有顯著地影響，尤其是色澤，但棕櫚酸含量與稻米色澤以及食味品質呈負相關。

圖7 NA與WC組的代謝通路分析氣泡圖Fig.7 Pathway analysis for group NA vs WC

由結果可知，產地對影響稻米品質的代謝物含量具有明顯影響，說明產地對稻米品質具有一定的影響。還有研究表明，棕櫚酸、亞油酸的含量與生長環境的溫度有關，寧安和五常兩個地區中環境溫度也不相同，由代謝通路結果可知，五常與寧安兩個產地的稻花香水稻在代謝中最大的差異體現在脂肪酸代謝過程，則說明不同產地間水稻代謝差異機制可能主要在于脂肪酸類物質的代謝。

3 結論

基于GC-MS代謝組學技術對不同產地水稻代謝產物與代謝差異機制進行研究具有可行性。研究結果表明產地對稻花香水稻代謝物的數量和含量均具有影響，且代謝物種類與含量的差異可能與稻米品質相關。產地不同，對水稻中脂類物質的影響最為顯著，且不同產地間水稻代謝差異機制主要在于脂肪酸類物質的代謝。亞油酸，棕櫚酸和富馬酸是產地影響的脂肪酸代謝中的三種關鍵代謝物。產地對稻米的代謝具有明顯的影響。