蕓豆蛋白抗氧化肽組分對大豆油熱氧化穩定性的影響

崔素萍，穆秋霞，曲柳青，李 琳,2，陳 丹,3，鄭喜群,

（1.黑龍江八一農墾大學食品學院, 黑龍江大慶 163319；2.糧食副產物加工與利用教育部工程研究中心, 黑龍江大慶 163319；3.國家雜糧工程技術研究中心, 黑龍江大慶 163319）

食品在加工、貯藏及運輸過程中，易發生氧化反應，導致食品腐爛變質，甚至危害人體健康，使用抗氧化劑是避免食品氧化變質的方法之一。食品中常用的抗氧化劑有天然來源和人工合成兩大類。研究發現，長期使用合成抗氧化劑可能會引起人體退行性疾病的發生[1]。以天然抗氧化劑替代合成抗氧化劑是食品產業日后發展的必經之路。天然抗氧化劑的研究已成為食品科學發展的新趨勢，用酶水解動植物蛋白制得的抗氧化肽是天然抗氧化劑的一種，具有無毒、安全、抗氧化效果好的特點[2]。近年來，科研工作者篩選出了一些具有較高抗氧化活性的抗氧化肽[3-9]，已用于食品、藥品抗氧化劑的開發[10-13]。有關抗氧化肽在食品中的應用也受到了廣泛關注，并取得了一定的效果[14-16]。如向香腸內添加2%的玉米肽可以延長香腸的保質期，并且肉的顏色不受影響[17]；乳清蛋白抗氧化肽組分、大豆蛋白抗氧化肽組分、雞蛋黃蛋白抗氧化肽組分、馬鈴薯蛋白抗氧化肽組分等對肉制品都有良好的抗氧化效果[18-21]；還有研究表明，莧菜蛋白抗氧化肽組分在葵花油、菜籽油熱氧化過程中具有抗氧化作用，同時可以延緩重組魚產品的脂類物質氧化進程[22]。

蕓豆具有成熟快、對種植的土壤和水質要求不高、適合在溫度較低的地區生長等優點，已成為重要的經濟作物。黑龍江省是蕓豆的優勢產區，年出口蕓豆25萬噸，產量占全國出口量的1/2。英國紅蕓豆因其具有籽粒大、色澤鮮艷、營養價值高等特點，頗受市場歡迎。其蛋白質含量為24%左右，高于其它蕓豆品種，但因甲硫氨酸、色氨酸是其限制性氨基酸，導致蛋白質的營養價值較低，限制了其作為營養蛋白的應用。目前，英國紅蕓豆主要用于制作傳統副食品包括糕點、豆餡、豆沙等，有關英國紅蕓豆蛋白的相關深加工產品較少。為了提高英國紅蕓豆產品的經濟效益，可以利用英國紅蕓豆蛋白，制備高價值的抗氧化活性肽。曲柳青等[23]利用差示熱量掃描技術，評價了英囯紅蕓豆蛋白抗氧化組分（相對分子質量＜1000 U，1000～3000 U，3000～5000 U）在植物油熱誘導中的抗氧化作用。 研究結果表明，三種相對分子質量組分均具有抗氧化作用，其中相對分子質量為1000～3000 U的組分抗氧化活性最強。

在實驗室水平上抗氧化肽已經展示了作為食品抗氧化劑的潛力，但僅有少量研究評價了抗氧化肽在真實食品基質中的作用[24]。由于食品是一個非常復雜的物質系統，在食品的加工、運輸和儲藏過程中將發生許多復雜的變化，因此為了分析和綜合有一個清晰的背景，通常采用一個簡化的、模擬的食品物質系統來進行實驗。大豆油是比較簡單的食品體系，主要成分是三酰甘油，并富含80%以上的多不飽和脂肪酸，不飽和脂肪酸的穩定性相對較差，易發生緩慢氧化，因此，大豆油是研究抗氧化作用比較理想的食品體系。

為了提高蕓豆的經濟效益，開發高附加值的蕓豆蛋白功能性產品，團隊在前期研究工作中，利用堿性蛋白酶及超濾方法制備了具有體外抗氧化活性的英國紅蕓豆蛋白抗氧化肽（BRKBPAPC）[25-26]；利用差示熱量掃描法，間接評價了BRKBPAPC在熱誘導的大豆油中的抗氧化作用[23]。本研究擬將BRKBPAPC添加到大豆油中，用Schaal烘箱法63 ℃加速氧化15 d，研究BRKBPAPC在大豆油中的抗氧化作用及對大豆油熱穩定性的影響，為BRKBPAPC在食品體系的進一步應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

英國紅蕓豆蛋白抗氧化肽組分（分子質量＜1000 Da，1000～3000 Da，3000～5000 Da，5000～10000 Da，純度為95%） 由團隊在前期制備；大豆油（精煉一級非轉基因大豆油） 嘉里糧油有限公司；維生素E合肥博美生物有限公司；吐溫20 食品級，廣東潤華化工有限公司；羥自由基測試試劑盒 南京建成生物工程研究所；枯草芽孢桿菌發酵生產的堿性蛋白酶（2.0×105U/g） 北京鑫澤天佑生物科技有限公司；其它試劑均為分析純。

CHRISTALPha型冷凍干燥機 德國Marin Christ公司；SPECORD?200PLUS紫外可見分光光度計 德國耶拿分析儀器開發有限公司；202-00A型電熱烘箱 天津市賽得利斯實驗分析儀器廠；HX-4GM型無菌均質機 上海滬析實業有限公司；LGR10臺式高速離心機 上海試驗儀器總廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的制備 英國紅蕓豆蛋白抗氧化肽（BRKBPAPC）組分制備方法見參考文獻[23]，以總抗氧化能力為指標，用堿性蛋白酶在最佳酶解條件下（蛋白質質量濃度為5%，pH為10，時間2 h，溫度55 ℃，加酶量4 000 U/mL），對英國紅蕓豆蛋白質進行水解，然后，將酶解液通過5、3及1 kDa的超濾膜進行超濾后，分別冷凍干燥備用。

1.2.2 樣品的分組 BRKBPAPC對大豆油熱氧化穩定性影響的樣品組成見表1。

表1 樣品組成及編號Table 1 Sample composition and number

1.2.3 蕓豆蛋白抗氧化肽組分對大豆油熱氧化穩定性的影響 穩定性評價指標見1.2.4中所列指標。BRKBPAPC、吐溫20、VE的添加量均為10 mg/mL，以SO-Tw做對照組，SO做空白組，SO-VE為陽性對照。樣品在21500 r/min，36 MPa的條件下均質2 min后，用Schaal烘箱法（63±1）℃加速氧化15 d。樣品配制完成時為0 d，放入烘箱后，每 d攪拌1次，每3 d取1次樣。每個樣品做3次重復，取平均值。

1.2.4 指標測定 大豆油的過氧化值（POV）、酸價（Acid Value，AV）、P-茴香胺值、羰基價的測定分別按GB 5009.227-2016《食品中過氧化值的測定》、GB 5009.229-2016《食品中酸價的測定》、GB/T 24304-2009《動植物油脂茴香胺值的測定方法》、GB 5009.37-2003《食用植物油衛生標準的分析方法》方法進行。

1.2.5 添加抗氧化肽的大豆油氧化反應活化能的計算 將抗氧化效果最佳的分子量小于1000 Da的抗氧化肽組分按照2%的添加量加入大豆油中，分別置于65、85、105 ℃溫度下30 d,每3 d取樣測定過氧化值。為了確定添加抗氧化肽大豆油氧化反應的動力學方程，本研究分別用零級反應動力學方程c=-kt+c0和一級反應動力學方程c=c0.e-kt，對大豆油在不同溫度下貯藏過程中的POV值進行擬合，得到相關系數和回歸方程，求得反應速率常數k。根據Arrhenius經 驗 公 式（lnk=lnk0-Ea/RT），用lnk對1/T作圖，得到一條斜率為-Ea/R的直線，由斜率求得表觀活化能Ea。

1.3 數據處理

所獲得的數據均為三次重復的平均值，采用Statistix 8進行數據分析，數據表現形式為平均值±標準誤差（SD）；通過Turkey HSD進行多重比較分析，顯著性差異（P＜0.05）；采用Excel 6.0繪圖。

2 結果與分析

2.1 英國紅蕓豆蛋白抗氧化肽組分對大豆油過氧化值（POV）的影響

POV是指1 kg油脂中所含氫過氧化物的毫摩爾數，是評價油脂初期氧化程度的指標。一般情況下，油脂中出現氫過氧化物，就意味著油脂開始酸敗。氧化初期的氫過氧化物含量越髙，酸敗程度越大[28]。由圖1可知，在15 d的氧化過程中，各樣品的POV均呈明顯上升趨勢，大豆油的熱穩定性降低。其中SO的氧化穩定性最差，SO組的抗氧化能力最弱；SO-h1的抗氧化能力最強，且抗氧化肽的分子量越小，在大豆油中的抗氧化能力越強，大豆油的熱穩定性越強；SO-h1及SO-h2的抗氧化能力均高于SO-VE。SO、SO-h4與SO-h1、SO-h2組間存在差異顯著性（P＜0.05）。隨著氧化時間的延長，除了SO外，其它樣品的過氧化值增加幅度均較小，樣品的熱氧化穩定性較高。

圖1 英國紅蕓豆蛋白抗氧化肽組分對大豆油熱氧化過程中過氧化值的影響Fig.1 Effects of antioxidant peptide components of British red kidney bean protein on peroxide value of soybean oil during thermal oxidation

綜上所述，BRKBPAPC在大豆油的氧化過程中具有抗氧化作用，能增加油脂的熱穩定性，且抗氧化肽組分的分子量越低，抗氧化效果越好，分子量小于1000 Da和1000～3000 Da的兩個組分的抗氧化效果比較好。

2.2 英國紅蕓豆蛋白抗氧化肽組分對大豆油酸價的影響

酸價（AV）也稱酸值，用來衡量油脂中游離脂肪酸的含量，我國規定食用植物油的酸價不得超過5 mg/g。脂肪在儲藏時，因微生物、熱和酶的共同作用，脂肪會緩慢水解，生成游離脂肪酸，導致油脂酸敗，油脂的品質隨之而下降[28]。酸價的大小，可以反應大豆油油脂氧化程度。由圖2可知，在15 d的加速氧化過程中，各樣品AV的變化趨勢基本一致，隨著氧化時間的延長呈上升趨勢，但均小于5 mg/g。SO-h1的抗氧化能力最強，其次是SO-VE；BRKBPAPC分子量越小，在大豆油中的抗氧化能力越強，樣品的AV值越低，樣品的熱氧化穩定越強；SO的抗氧化能力最弱，其次是SO-h3。在不同的氧化時間下，各樣品的AV值差異顯著（P＜0.05）。分子量小于1000 Da和1000～3000 Da的兩個組分的抗氧化效果比較好?？寡趸目梢蕴峁湓踊螂娮忧宄蠖褂脱趸^程中產生的自由基，也可以螯合金屬離子抑制油脂的氧化。有研究表明，添加玉米抗氧化肽可以延緩人造奶油酸價的上升[29]。

圖2 英國紅蕓豆蛋白抗氧化肽組分對大豆油熱氧化過程中酸價的影響Fig.2 Effects of antioxidant peptide components of British red kidney bean protein on the acid value of soybean oil during thermal oxidation

2.3 英國紅蕓豆蛋白抗氧化組分對大豆油P-茴香胺值（p-AV）的影響

油脂氧化酸敗過程中，會分解產生醛、酮、酯及少量小分子物質，例如羥基醛、酮基醛等，使油脂的茴香胺值增大，茴香胺值是評價油脂品質的一個重要指標[28]。由圖3可知，大豆油在加速氧化過程中，隨著時間的延長，P-茴香胺值逐漸增大，說明油脂中醛、酮、醌等次級氧化產物在氧化過程中不斷增加。在15 d的氧化過程中，樣品的熱氧化穩定性由強到弱的順序為：SO-VE＞SO-h1＞SO-Tw＞SO-h2＞SO-h3＞SO＞SO-h4。說明VE、BRKBPAPC對油脂的氧化裂解有一定的抑制作用。BRKBPAC分子量越小，在大豆油中的抗氧化能力越強，分子量小于1000 Da和1000～3000 Da的兩個組分的抗氧化效果比較好。頡宇[24]在研究檸條籽肽對核桃油氧化作用影響的過程中，發現未添加抗氧化肽的核桃油中產生的醛類物質比較多，導致了P-茴香胺值增加。

2.4 英國紅蕓豆蛋白抗氧化組分對大豆油羰基價的影響

羰基價是指油脂在儲存和烹飪加工中產生的含有醛基、酮基的脂肪酸或甘油酸以及聚合物的總稱，是油脂熱裂變以及貯存時的重要指標，也是反應油脂氧化產物以及油脂酸敗程度的重要依據[28]。由圖4可知，在15 d的加速氧化過程中，各樣品的羰基價均呈明顯的上升趨勢；在樣品的氧化過程中，SO樣品的抗氧化活性最弱，其次是SO-Tw；且BRKBPAPC的抗氧化活性與其分子量呈負相關，分子量越小，抗氧化活性越強。其中為分子量為1000 Da和1000～3000 Da的兩個組分的抗氧化效果比較好。一些具有合適氧化還原電位的二價或多價過渡金屬離子是有效的助氧劑，可以加速大豆油的氧化?？寡趸目梢则洗蠖褂椭械慕饘匐x子，抑制油脂的氧化分解，抑制羰基化合物的產生。

2.5 大豆油氧化反應中活化能的計算

將不同溫度下貯藏過程中的POV值進行擬合，得到回歸方程和相關系數，結果如表2所示。

由表2可知，在同一溫度下，零級反應的回歸系數大于一級反應的回歸系數，擬合度高，說明添加分子量小于1000 Da抗氧化肽組分的大豆油的氧化反應屬于零級反應。張建飛等[27]、謝貞建等[30]的研究也發現，大豆油的氧化穩定性與溫度之間的關系符合零級反應方程式的結論，說明本實驗的氧化回歸方程屬于零級反應回歸方程式這一結論具有可靠性。

表2 添加蕓豆抗氧化肽組分分子量小于1000 Da的大豆油基于過氧化值的回歸方程Table 2 Regression equation based on peroxide value of soybean oil with molecular weight of antioxidant peptide less than 1000 Da

根據Arrhenius方程可以反映油脂變質的速率與所處溫度之間的函數關系，方程如下:

對式（1）兩邊取對數可得:

式中：k0-為方程指前因子；Ea-為活化能，kJ/mol；R-為氣體常數，8.314 J/（mol·K）；T-為熱力學溫度，K。

由式（2）可知，lnk與熱力學溫度的倒數（1/T）呈線性關系，斜率為-Ea/R，lnk0為常數項。求得不同溫度下的反應速率常數后，用lnk對絕對溫度的倒數1/T作圖，就可求得活化能和指前因子，如圖5所示。

由圖5可知，-Ea/R=-3190.4，則Ea=26521.66 J/mol= 26.521 kJ/mol?；貧w系數R2=0.9301，說明lnk與1/T具有較好的線性相關性。在此基礎上建立添加分子量小于1000 Da抗氧化肽組分的大豆油氧化反應速率k與貯存溫度T之間的Arrhenius方程為：

圖5 添加蕓豆抗氧化肽組分分子量小于1000 Da的大豆油過氧化值lnk與1/T之間的關系Fig.5 Relationship between the peroxide value lnk and 1/T of soybean oil with the molecular weight of antioxidant peptide less than 1000 Da

3 結論

利用Schaal烘箱法，在63 ℃下，將大豆油加速氧化15 d，發現抗氧化肽具有一定的抗氧化作用，能夠增加油脂的熱穩定性，且分子量越低，抗氧化作用越強。其中，相對分子質量＜1000 Da，1000～3000 Da兩個英國紅蕓豆蛋白抗氧化肽組分在大豆油氧化中具有較強的抗氧化作用。為進一步探討蕓豆蛋白抗氧化肽的抗氧化機理及抗氧化肽功能性食品的開發奠定了基礎。研究團隊在近期將開展英國紅蕓豆蛋白抗氧化肽咀嚼片的研制，擬為黑龍江省蕓豆的開發和產業化提供新的途徑。