高速逆流色譜法分離制備博落回血根堿與白屈菜紅堿

賈長青，馬 瑞，錢璽丞，王丹丹，郁建生,

（1.銅仁職業技術學院藥學院, 貴州銅仁 554300；2.銅仁職業技術學院民族中獸藥國家地方聯合工程中心, 貴州銅仁 554300；3.貴州梵凈山農業高科技股份有限公司, 貴州銅仁 554300）

博落回（Macleaya cordata（Willd.） R. Br.），屬罌粟科博落回屬植物，可以全株入藥，有祛風、散瘀消腫、鎮痛解毒、殺蟲等功效[1]。目前，據國內外有關博落回化學成分與藥理活性研究報道可知，博落回中含有多種藥理活性成分，其中以苯駢菲啶異喹啉類生物堿為主[2]，這些生物堿在殺菌、抗炎、消腫、殺蟲、抗癌、改善肝功能、促進動物生長方面有廣闊的應用前景[3-11]。博落回植株中，以成熟果莢中生物堿含量最為豐富，而在生物堿中，又以血根堿與白屈菜紅堿含量最高[10]。因此，血根堿與白屈菜紅堿的藥理活性研究備受關注，已有其在抗真菌、消炎、抗腫瘤、抗艾滋病和作為生物農藥防治害蟲等方面的活性報道[12-15]，且已有報道血根堿能夠有效清除自由基，減少生物大分子的氧化和羰基化損傷，是潛在的天然的食品抗氧化劑[16]。

采用薄層色譜、凝膠色譜、硅膠柱色譜、制備高效液相、重結晶等多種方法或其聯用，可以從博落回植株不同部位分離得到十幾種生物堿單體成分[17-21]，但存在操作繁瑣、樣品不可逆吸附、成本較高等缺點，不適于大量制備。高速逆流色譜法（HSCCC）是一種液-液分配色譜技術，避免了樣品的不可逆吸附，具有操作簡單、成本低、條件溫和、制備量大等優點，已廣泛應用于天然產物活性成分的分離制備[22-26]。目前關于高速逆流色譜技術在博落回生物堿分離中應用報道較少，僅有利用離子液體改性高速逆流色譜法[27]、pH區帶高速逆流色譜法[28-29]分離純化博落回血根堿與白屈菜紅堿的報道，但這兩種方法在大量制備時，需要對兩相溶劑進行離子改性或逆流色譜系統中額外增加pH在線檢測器，存在操作較復雜、成本較高等不足，在實用性上有一定局限。

因此，為建立一種簡便實用的利用常規的高速逆流色譜（HSCCC）分離制備高純度的血根堿鹽酸鹽與白屈菜紅堿鹽酸鹽的方法，本研究以博落回生物堿粗提物為研究對象，通過分析型HSCCC篩選最優的溶劑體系并應用到制備型HSCCC上，以期分離得到高純度生物堿單體，為血根堿和白屈菜紅堿的進一步研究應用提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

博落回果莢 采自銅仁市大興區山區野生博落回植株；血根堿鹽酸鹽標準品（HPLC測定純度98.00%）、白屈菜紅堿標準品（HPLC測定純度98.00%） 均購自上海源葉生物科技有限公司；UPLC色譜分析所用乙腈 色譜純，默克公司；水為二次蒸餾水；其余實驗所用甲醇、氯仿、鹽酸、硫酸、乙醇等試劑 均為市售分析純試劑。

TEB-30A分析型高速逆流色譜儀、TEB-1000A制備型高速逆流色譜儀、TBP5002恒流泵、DC-0506低溫恒溫槽 上海同田生物技術股份有限公司；UV-2000紫外檢測器 成都千年紅科技有限公司；1290型超高效液相色譜儀 美國Aglient公司；PDF-50L玻璃反應釜、Z-62旋轉蒸發儀 上海普渡生化科技有限公司；DHG-09620B鼓風干燥箱上海副絮實驗儀器；ZB-Ⅲ循環水真空泵 鞏義予華儀器有限公司；CPA2250十萬分之一天平 賽多利斯科學儀器。

1.2 實驗方法

1.2.1 HSCCC進樣原料的制備 采用酸水提取法粗提博落回生物堿。1 kg干燥粉碎的博落回果莢放置于50 L反應釜中，加入60% 乙醇溶液6 L, 0.1 mol/L的硫酸水溶液14 L，加熱至回流，攪拌1～1.5 h，趁熱用50目濾布過濾，得深褐色濾液。濾液用氫氧化鈉調pH至10～10.5，靜置12 h，抽濾，40 ℃鼓風干燥得深褐色博落回總堿粗品粉末。取100 g此深褐色粉末用適量無水乙醇回流提取3次，合并濾液，用硫酸調pH至1，靜置12 h，抽濾得深紅色博落回生物堿粗品[2]。取此深紅色博落回生物堿粗品10 g，2 L水溶解，抽濾除去極少不溶物，澄清水溶液用氫氧化鈉水溶液緩慢調pH至8～9，靜置，抽濾，40 ℃鼓風干燥得灰色粉末固體，避光保存，為HSCCC進樣原料。

1.2.2 HSCCC制備分離條件與過程 分析型HSCCC：在分液漏斗中配制三氯甲烷-甲醇-0.2 mol/L鹽酸水（4:2:2，V/V/V）溶液兩相溶劑體系共400 mL，將其充分振蕩后靜置，用錐形瓶收集上相為固定相，下相為流動相，兩相超聲脫氣30 min，備用。主機轉速1300 r/min，流速1 mL/min，分離溫度25 ℃，檢測波長280 nm，進樣量1 mg，振蕩全溶于1 mL流動相中，為分析型HSCCC進樣溶液[27]。

制備型HSCCC：溶劑體系與分析型HSCCC相同。在10 L分液漏斗中配置兩相溶劑共6 L。上相為固體相，下相為流動相，脫氣30 min，備用。主機轉速455 r/min，流速8 mL/min，分離溫度25 ℃，檢測波長280 nm，進樣量1000 mg，振蕩全溶于20 mL流動相中，為制備型HSCCC進樣溶液[28-29]。

HSCCC分離過程：用較大流速將固定相泵入并充滿色譜柱中，開啟恒溫循環水槽溫度設定為25 ℃，開啟主機電源，正接正傳達到設定轉速，待穩定后，以設定的分離流速泵入流動相。此時記錄從開始泵入流動相至流動相在管柱出口流出時固定相的流出體積（V流出）以計算固定相的保留率。待流動相從管柱出口流出后且基線穩定后，將溶解在適量流動相中的樣品從進樣圈注入。管柱出口流出液在280 nm下連續檢測，根據色譜圖出峰情況，手動收集各組分。在不開逆流色譜主機下，自行測定儀器色譜柱加外接管路總體積（V總）。色譜柱體積（V柱體積）由實驗儀器確定。

1.2.3 分離產物定性及樣品純度分析 使用超高效液相色譜（UPLC）對分離后樣品進行定性分析與純度分析。定性分析采用標準品對照法。標準品與分離產物在同等色譜條件下分別進樣，對比兩者保留時間與吸收光譜圖；再將樣品與標準品混合進樣，觀測其保留時間、峰型是否分裂、吸收光譜有無變化。定性實驗重復三次。

樣品純度分析采用外標法。用十萬分之一天平分別稱取血根堿鹽酸鹽標準品、白屈菜紅堿鹽酸鹽標準品、分離得血根堿鹽酸鹽樣品、分離得白屈菜紅堿鹽酸鹽樣品2～3 mg，統一配制成濃度為0.05 mg/mL左右樣品溶液，分別進行UPLC進樣分析，求得峰面積。按下列公式計算兩種分離得到的樣品的純度。實驗重復三次，每次重復單個樣品進樣三次，觀測其重復性及誤差。

色譜條件為：紫外檢測波長280 nm；C18色譜柱；進樣量1 μL；流速0.5 mL/min；柱溫25 ℃；0.05%磷酸水-乙腈體系作為流動相；采用梯度洗脫：流動相組成A（0.05%磷酸水溶液）-B（乙腈）； 0～1 min 25%A；1～2 min 40%A；2～3 min 40%A；3～4 min 60%A；4～5 min 75%A；洗脫時間為5 min，后運行1 min[20-21]。

1.3 數據處理

核磁共振波譜表征由中國農業大學理學院分析測試中心代為檢測，數據處理使用MestReNova 軟件。圖表數據處理、繪圖使用origin pro 9.1軟件?；衔锝Y構式繪制采用ChembioDraw 14.0 軟件。

2 結果與討論

2.1 溶劑體系的選擇

博落回血根堿與白屈菜紅堿分子中N原子帶有正電荷，不穩定，在溶液中易分解。通常將博落回生物堿成鹽以保持其穩定性[2]。血根堿為例，在文獻中已報道主要有三種形態：血根堿鹽酸鹽、血根堿硫酸氫鹽、羥化血根堿（見圖1）。

圖1 血根堿的三種形態Fig.1 Three forms of sanguinarine

在考察合適的溶劑系統時，通過查閱文獻[2,17-21]與反復實驗，發現博落回生物堿鹽酸鹽、博落回生物堿硫酸氫鹽在純水、甲醇、乙醇、三氯甲烷、乙腈、乙酸乙酯、正己烷等常用溶劑中，溶解度太小，幾乎不可能找到適合分離的溶劑體系。而在考察羥化博落回生物堿時發現其在三氯甲烷、甲醇、低濃度鹽酸水溶液中均有較好的溶解度，在高濃度鹽酸甲醇溶液中，又以鹽酸鹽形式析出。故本研究選擇在堿性形態的羥化博落回生物堿作為HSCCC分離的進樣原料，選擇三氯甲烷-甲醇-低濃度鹽酸水溶液兩相體系作為分離體系，后處理使其以鹽酸鹽形式析出，方便進行終產物收集。

2.2 分析型HSCCC分離條件的優化

分析型高速逆流色譜儀進樣分析實驗一次通常只需30～50 min左右，柱體積也只有28 mL，方便快速，適用于條件摸索。在三氯甲烷-甲醇-低濃度鹽酸水溶液兩相溶劑系統下，設計六種溶劑體系分別進樣進行實驗，結果圖譜見圖2。

由圖2可知，在三氯甲烷-甲醇-低濃度鹽酸水溶液這個溶劑系統中，在e、f體系中，分析時間明顯延長，需要55～65 min；在a、b體系中，分析時間較短（27～35 min），但相鄰色譜峰峰底存在重合情況；在b、d、f體系中（配制兩相溶劑時鹽酸水溶液濃度為0.1 mol/L），相鄰色譜峰峰底也存在重合現象；在c體系（三氯甲烷-甲醇-0.2 mol/L 鹽酸水溶液（4:2:2,V/V/V））中，相鄰色譜峰峰底無重合現象，分離時間較短（42 min）,確定為最優分離條件。在六種溶劑體系下，均有較好的固定相保留率，在64.2%～67.8%之間, 均滿足逆流色譜分析時所要求的最低35% 的固定相保留率。

圖2 在六種不同溶劑體系下利用分析型高速逆流色譜分離博落回生物堿的實驗結果Fig.2 Experimental results of the separation of Macleaya cordata alkaloids by analytical HSCCC with six different solvent systems

根據分析型高速逆流色譜對6種不同的溶劑系統在分離博落回生物堿的實驗中的結果對比，本文選擇三氯甲烷-甲醇-0.2 mol/L 鹽酸水溶液（4:2:2,V/V/V）這一溶劑體系作為優選的溶劑體系直接應用到制備型高速逆流色譜上。

2.3 制備型HSCCC分離結果

將優選的溶劑體系（三氯甲烷-甲醇-0.2 mol/L鹽酸水溶液（4:2:2,V/V/V））直接應用到制備型高速逆流色譜上，經一次HSCCC制備分離，結果從1000 mg博落回生物堿粗品中分離得到3個主要組分，分別標記為A、B、C三種組分（見圖3），溶劑體系固定相保留率為77.2%，滿足逆流色譜分析的要求。由圖3可知，峰與峰之間分離完全，方便對應組分的收集。

根據圖3中色譜圖A、B、C三個出峰位置，用錐形瓶手動收集對應的組分（圖中陰影部分）。收集的每種組分溶液，分別用旋轉蒸發儀除去有機溶劑（主要為三氯甲烷，可循環利用）后，可見部分固體析出，用100 mL甲醇分散溶解后，加入4～6 mL的鹽酸調pH至1左右，靜置固體析出，抽濾，40 ℃鼓風干燥，得灰色的A組分鹽酸鹽12 mg，淡綠色B組分鹽酸鹽435 mg，淡紅色C組分鹽酸鹽505 mg。其具體結構利用UPLC標準品對照法初步確認后，進一步用1H NMR、13C NMR加以確定。上述步驟中，最后成鹽過程相當于一次重結晶純化過程，有利于得到高純度的最終產物。

2.4 血根堿鹽酸鹽與白屈菜紅堿鹽酸鹽的定性分析與樣品純度測定

在色譜分離之前，將HSCCC進樣原料進行UPLC分析（見圖4a）。從圖中可以看出，進樣原料中主要有Ⅰ、Ⅱ兩個組分，其余有些含量較少的雜質。對比進樣原料與血根堿鹽酸鹽、白屈菜紅堿鹽酸鹽的標準品的UPLC色譜圖（見圖4b、c），可初步確定Ⅰ峰（保留時間為1.91 min）為血根堿鹽酸鹽，Ⅱ峰（保留時間為2.76 min）為白屈菜紅堿鹽酸鹽。

圖4 HSCCC進樣原料與血根堿、白屈菜紅堿鹽酸鹽標準品UPLC色譜圖Fig.4 UPLC chromatogram of original analytical sample,standard substance of sanguinarine chloride and chelerythrine chloride

將制備型HSCCC分離得到A、B、C三組分鹽酸鹽進行UPLC色譜分析（見圖5）。與HSCCC進樣原料、標準品色譜圖對比可初步確定：A組分為少量多種雜質的混合物（響應值很低）；B組分為白屈菜紅堿鹽酸鹽；C組分為血根堿鹽酸鹽。采用內標法，將適量B組分與白屈菜紅堿鹽酸鹽標準品混合進行UPLC分析，將適量C組分與血根堿鹽酸鹽標準品混合進行UPLC分析（見圖6a、b）。對比后，無新峰、無分裂，確定B組分為白屈菜紅堿鹽酸；C組分為血根堿鹽酸鹽。

圖5 由制備型HSCCC分離的A、B、C三組分UPLC色譜圖Fig.5 UPLC chromatogram of A, B and C fraction isolated from preparative HSCCC

圖6 內標法測定B、C組分UPLC色譜圖Fig.6 UPLC chromatogram of B and C fraction determined by internal standard method

采用外標法測定B、C兩個組分的純度。實驗重復三次，數據重現性好（見圖7）。白屈菜紅堿鹽酸鹽（B組分）純度均值為99.73%；血根堿鹽酸鹽（C組分）純度均值為99.77%。對比可知， HSCCC分離得到的兩種生物堿的純度均高于所購買的標準品的純度（98.00%）。

圖7 外標法測定B、C組分的純度結果Fig.7 Purity results of component B and C determined by external standard method

2.5 血根堿鹽酸鹽與白屈菜紅堿鹽酸鹽的核磁鑒定

將分離得到血根堿鹽酸鹽與白屈菜紅堿鹽酸鹽進行1H NMR和13C NMR測定，數據如下。與已有文獻對比，核磁數據相符，可以確定分離得到的B組分為白屈菜紅堿鹽酸鹽，C組分為血根堿鹽酸鹽。

白屈菜紅堿鹽酸鹽（B組分），淡綠色粉末。1H NMR（DMSO, 500MHz） δ: 10.12 （s, 1H, H-6），8.87（d, J=8.9 Hz, 1H, H-9），8.85 （d, J=8.9 Hz, 1H,H-10），8.34-8.29（m, 3H, H-1, H-11, H-12），7.80 （s,1H, H-4），6.36 （s, 2H, -OCH2-），5.00 （s, 3H, -NCH3），4.18 （s, 3H, -OMe-7），4.13 （s, 3H, -OMe-8）。13C NMR（DMSO, 126MHz）δ 150.18（C-8），149.98（C-6），148.16（C-3），148.07（C-2），144.80（C-7），131.67（C-12a），131.08（C-4b），130.46（C-12），127.42（C-10a），125.49（C-9），124.67（C-10b），119.53（C-4a），118.75（C-6a），118.64（C-11），118.15（C-10），105.18（C-1），103.67（C-4），102.14（-OCH2-2,3），61.60（OMe-7），56.41（-OMe-8），51.62（N-Me）。與文獻[30]對照，確定為白屈菜紅堿鹽酸鹽（Chelerythrine chloride）。數據中碳氫編號見圖8。

圖8 白屈菜紅堿鹽酸鹽與血根堿鹽酸核磁數據碳氫編號Fig.8 Numbers in NMR date of sanguinarine chloride and chelerythrine chloride

血根堿鹽酸鹽（C組分），淡紅色粉末。1H NMR（DMSO, 500MHz） δ: 10.16 （s, 1H, H-6），8.78（d, J=9.0 Hz, 1H, H-12），8.64 （d, J=8.9 Hz, 1H, H-11），8.30 （d, J=9.1 Hz, 1H, H-10），8.28 （s, 1H, H-1），8.12 （d, J=8.8 Hz, 1H, H-9），7.77 （s, 1H, H-4），6.61（s, 2H, -OCH2-2,3）, 6.36 （s, 2H, -OCH2-7,8），4.93（s, 3H, N-Me）。13C NMR（DMSO, 126MHz）δ 150.40（C-6），149.22（C-2），149.22（C-3），147.99（C-7），146.75（C-6），132.65（C-12a），131.95（C-4b），131.77（C-12），127.64（C-10a），126.15（C-10b），120.76（C-9），120.40（C-4a），119.34（C-11），117.81（C-10），109.96（C-6a），106.21（C-1），105.37（C-4）， 104.71（-OCH2-7,8），103.25（-OCH2-2,3）， 52.58（N-Me）。與文獻[30]對照，確定為血根堿鹽酸鹽（Sanguinarine chloride）。數據中碳氫編號見圖8。

3 結論

利用分析型逆流色譜儀優選合適的分離體系和分離條件，然后將優選的溶劑系統和分離條件直接應用于制備型HSCCC儀器上。在優選的條件下，利用制備型高速逆流色譜儀器，一次能夠從1000 mg博落回生物堿粗品中分離得到血根堿鹽酸鹽505 mg（純度99.77%）和白屈菜紅堿鹽酸鹽435 mg（純度99.73%），二者結構經標準品對照法、1H NMR、13C NMR確認。本文建立了一種利用常規高速逆流色譜技術制備高純度血根堿鹽酸鹽和白屈菜紅堿鹽酸鹽的方法，為血根堿和白屈菜紅堿的進一步開發利用奠定了一定的基礎。