恒山黃芪1H-NMR指紋圖譜的研究

張弘弛，劉 瑞，巴德方，李 慧，楊 陽，周 鳳

（山西大同大學農學與生命科學學院, 山西大同大學應用生物技術研究所, 山西大同 037009）

恒山黃芪，為國家地理標志保護產品，主產于山西省大同市渾源縣，在廣靈縣、靈丘縣等地也有分布[1-3]。天然藥物研究證實，黃芪的主要藥效成分為皂苷類、黃酮類、多糖類等，具有改善人體免疫系統，針對治療心腦血管疾病和腎臟疾病等的作用[4-6]。伴隨著恒山黃芪的市場占有率逐年提升，需要有明確的檢測方法，判斷恒山黃芪的質量差異性?，F行的高效液相色譜技術（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）在評定中藥材的均一性和差異性時具有檢測靈敏度較高[7-9]的特點，但由于中藥材具有成分復雜、難分離特點，通過HPLC建立的指紋圖譜主要側重于中藥材的相似性評價，難以在差異性方面進行評價，因此需要一種兼顧相似性評價和差異性評價同時能快速檢測中藥材化學成分的方法。核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance，NMR）技術具有分析速度快、無偏向性且對樣品依賴較少的特點[10-11]，適于分析中藥材的復雜成分，是對傳統方法的改良。而1H-NMR被應用于天然藥物差異性和均一性的評價[12-15]，是因為相對于高效液相指紋圖譜，氫核磁共振具有更高的靈敏性，更佳的分離性[16-17]，因而對天然藥物中低含量的藥用成分可做更詳細的定性和定量分析。同時該技術不需要繪制標準曲線，且對樣品要求低，可快速檢測天然藥物中不穩定的化合物，成為了國內外藥材評價的研究方法[18-21]。

主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）在進行數據處理時，能有效壓縮數據，將分散的信息集合到主成分上，主成分是多個初變量按照不同權重合成的新變量，通過數據組合成新變量不僅可以描述數據集內部的結構，同時還可以對數據進行降維處理[22-23]。通過1H-NMR技術測定天然藥物的氫核磁共振指紋圖譜，分析圖譜，可獲得多種有機化學成分的信息，同時結合PCA技術，可得到具有統計學意義的綜合數據，再使用軟件分析數據，得到直觀圖形，可達到整體分析藥物化學成分的目的。

本研究采用超聲波復合酶法提取恒山黃芪化學成分，1H-NMR技術測定恒山黃芪的1H-NMR指紋圖譜，并進行重復性、精密度及穩定性考察，進而對其化學成分進行主成分評價。目的是通過該研究建立一種簡單準確的恒山黃芪化學成分的評價方法。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

10批恒山黃芪 樣品的來源見表1，經山西大同大學生命科學學院周鳳教授鑒定均為恒山黃芪（Astragalus membranaceus）；對比分析選用的甘肅黃芪和蒙古黃芪 均購自于不同產區（見表1）；芒柄花苷、毛蕊異黃酮、黃芪皂苷 I、II、III 對照品，上海源葉生物科技有限公司（質量分數＞98%）；芒柄花素、毛蕊異黃酮苷、黃芪甲苷 對照品，成都瑞芬思生物科技有限公司（質量分數＞98%）；氘代氯仿（CDCl3）上海吉至生化科技有限公司；纖維素酶（3 U/mg）和氏璧生物科技有限公司；果膠酶（30 U/mg） 上海藍季科技發展有限公司；糖化酶（10 U/mg） 上海源葉生物科技有限公司。

表1 恒山黃芪來源和年限Table 1 Source and age of Hengshan Astragalus membranaceus

Avance Ⅲ 500 MHz型核磁共振波譜儀 德國布魯克公司；THC-2B超聲波提取器 濟寧天華超聲電子儀器有限公司；XFB-2600小型粉碎機 吉首市中誠制藥機械廠；RE-52AA旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；AXTGL16M微量臺式冷凍離心機 上海趙迪生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 恒山黃芪化學成分的提取

1.2.1.1 酶制劑的制備 準確稱取纖維素酶、果膠酶（質量比1:1）共0.625 g，加少量去離子水，溶解后，定容于25 mL容量瓶中，制成25 mg/mL的復合酶制劑，備用。準確稱取糖化酶0.625 g，加少量去離子水后定容于25 mL的容量瓶中，制成25 mg/mL的酶制劑，備用。

1.2.1.2 復合酶超聲提取 分別稱取10個采樣地點的干燥粉碎的黃芪10 g于250 mL三角瓶中，加入復合酶制劑的量分別為2 mL復合酶和2 mL糖化酶溶液，加去離子水46 mL，調節pH緩沖體系至5.5，酶解40 min，溫度設置60 ℃，攪拌轉速80 r/min，酶解完成后，添加50 mL無水甲醇，設置超聲條件：超聲功率為200 W，時間45 min，設置相同條件，重復提取一次，過濾合并濾液，90 ℃滅活30 s，減壓濃縮后，冷凍干燥。

1.2.21H-NMR的測定

1.2.2.1 核磁分析樣品的制備 取上述10 mg恒山黃芪提取物，加2 mL氘代氯仿，放入容量為5 mL的離心管中，設置離心條件：轉速為13000 r/min，時間為10 min，得上清液，將其轉至核磁管中，用于恒山黃芪化學成分的1H-NMR分析。

1.2.2.21H-NMR測定條件 測定溫度為25 ℃，1HNMR測定條件設置為：頻率500 MHz，掃描次數64次，譜寬為12345.7 Hz，傅里葉變換 0.188 Hz，脈沖間隔D1為1.0 s，延遲時間（RD）為1.0 s。手動進行相位、基線以及峰校正。采用 noesyppr1d 脈沖序列壓制水峰，內標為TSP。

1.2.3 方法學考察

1.2.3.1 精密度實驗 以3年恒山黃芪（編號Am-01）提取液為標準供試品溶液，在設定的1H-NMR條件下測定5次核磁圖譜，用MetreNova軟件處理圖譜，采用下述核磁數據分析方法，計算5組數據之間的相對峰面積積分值間的相關系數，分析儀器精密度。

1.2.3.2 重復性實驗 取3年恒山黃芪（編號Am-01）提取液，進行重復性實驗，在設定的1H-NMR條件下連續測定核磁圖譜，用MetreNova軟件處理圖譜，采用下述核磁數據分析方法，計算5組數據之間的相對峰面積積分值間的相關系數，分析實驗重復性情況。

1.2.3.3 穩定性實驗 取3年恒山黃芪（編號Am-01）提取液，進行穩定性實驗，溫度條件為25 ℃（即室溫條件），分別放置0、4、8、12、24 h后，在設定的1HNMR條件下分別測定核磁圖譜，用MetreNova軟件處理圖譜，采用下述核磁數據分析方法，計算5組數據之間的相對峰面積積分值間的相關系數，分析實驗穩定性情況。

1.3 數據處理

1.3.1 核磁數據分析 將基于MestreNova 8.0分析處理得到的核磁指紋圖譜，對其進行定標、相位以及基線校正處理，以0.04 ppm為單位對圖譜進行分段積分，位置區間為0～8.5 ppm，設置總峰面積為參照物，對其進行歸一化處理，得到各化學位移段對應的信號峰面積值，分析處理得到的數據。在Excel軟件中分析處理積分得到的數據用于后續分析。

1.3.2 主成分分析 將上述不同來源的恒山黃芪樣品的1H-NMR數據導入SIMCA-P 13.0軟件進行主成分分析，進一步評價恒山黃芪的化學成分。

2 結果與分析

2.1 方法學考察

精密度實驗中分段積分法計算相關系數結果分別為0.998、0.996、0.995、0.993和0.992，相關系數都大于0.99，證明儀器精密度高。重復性實驗中相關系數計算結果分別為0.997、0.994、0.995、0.998和0.996，從5次相關系數都大于0.99，可以看出該提取方法重復性良好。穩定性實驗中相關系數計算結果分別為0.994、0.995、0.996、0.992和0.993，從5次相關系數都大于0.99，可以看出在室溫條件下24 h內供試品溶液穩定。

2.2 恒山黃芪1H-NMR的典型信號歸屬

用于1H-NMR指紋圖譜研究的提取對象是混合體系，而非單體化合物，因而化合物的鑒定，會有其他成分的干擾，按照文獻[20]的報道，在氖代溶劑中加入一定pH范圍的緩沖鹽（本研究加入pH7.5的磷酸緩沖液），可以有效地緩解各成分化學位移值的漂移，從而降低成分間的干擾，提高NMR分析的準確性。圖1為典型的恒山黃芪1H-NMR譜圖（500 MHz，CDCl3），采用“加標準品定性”實驗進行黃芪皂苷I、II、III、黃芪甲苷、芒柄花素、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷8種成分的1H-NMR信號歸屬。比對數據庫HMDB（www.hmdb.ca）和BMRB（www.bmrb.wisc.edu）及相關文獻[1,24-27]進行其余代謝次級代謝產物、氨基酸、糖類等成分的1H-NMR 信號歸屬。結果，從恒山黃芪中共鑒定出了24種化合物，其中6個異黃酮類化合物、7個皂苷類化合物（結構見圖2）和其他11個初級代謝產物。

圖1 恒山黃芪特征1H-NMR信號峰Fig.1 Characteristic 1H-NMR signal peak of Hengshan Astragalus membranaceus medicinal materials

圖2 恒山黃芪中的皂苷和異黃酮Fig.2 Saponins and isoflavones in Hengshan Astragalus membranaceus

為了方便描述，將黃芪1H-NMR譜圖分為3個部分：黃酮類成分（主要是芳香區域δ 5.0～9.0）、皂苷類成分（主要是糖區域δ 2.0～5.0）、氨基酸類成分（主要是脂肪區域δ 0.5～2.0），以下分別為3個區域核磁數據分析和化學信號歸屬。

黃酮類成分：與芒柄花素的相似信號δ 3.78（s），6.86（d，2.0），6.96（2H，d，7.2），6.92（dd，2.0，8.8），7.48（2H，d，8.4）；與芒柄花苷相似的信號δ 3.81（s），7.26（s），5.10（d，7.2），7.01（d，8.5），7.16（d，1.5），7.54（d，8.5）；與毛蕊異黃酮相似的信號δ 3.78（s），7.04（s），6.84（d，2.4），7.94（d，8.8）；與毛蕊異黃酮苷相似的信號δ 3.78（s），6.94（s），7.04（s），5.05（d，5.2），6.84（d，2.4），6.91（d，2.4），7.94（d，8.8）；與3-羥基-9，10-二甲氧基紫檀烷相似的信號δ 3.70（s），3.72（s），5.54（s），6.25（s），6.46（dd，8.0，8.4），6.96（d，8.0），7.28（d，8.4）；與9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷相似的信號δ 3.73（s），3.74（s），5.56（s），4.85（d，7.5），6.55（d，7.5），6.72（d，2.4），7.01（d，8.5），7.42（d，8.5）。

皂苷類成分：恒山黃芪的核磁數據中與黃芪皂苷I相似的信號（化學位移、耦合常數、裂峰等），包括δ 0.93（s），1.27（s），1.30（s），1.42（s），1.60（s），1.79（s），1.97（s），2.03（s），2.52（d，8.0），3.14（dd，21.0，11.5），3.39（dd，11.5，4.5），3.80（ddd， 8.5，8.5，3.5），4.82（d，7.5），4.93（d，7.5）；與黃芪皂苷Ⅱ相似的信號δ 0.93（s），1.27（s），1.31（s），1.41（s），1.58（s），1.80（s），2.04（s），2.51（d，7.5），3.39（dd，11.0，4.0），3.76（ddd，10.0，9.0，3.0），3.88（dd，8.0，5.5），4.77（d，8.0），4.97（dd，14.2，7.2），4.90（d，7.5）；與黃芪皂苷III相似的信號δ 1.01（s），1.19（s），1.30（s），1.32（s），1.44（s），1.45（3 s），1.96（s），2.55（d，7.5），3.12（dd，21.4，11.0），3.57（dd，11.5，4.5），3.75（ddd，9.0，9.0，3.5），4.93（d，6.5），5.04（dd，14.0，7.0），5.42（d，7.5）；與黃芪甲苷相似的信號δ 0.95（s），1.30（s），1.38（s），1.42（s），1.59（s），2.06（s），2.53（d，9.0），3.14（dd，200，10.5），3.80（ddd，8.5，8.5，4.0），4.88（d，6.5），4.92（d，7.5）；與異黃芪苷I相似的信號δ 0.93（s），1.28（s），1.31（s），1.42（s），1.59（s），1.82（s），1.96（s），2.03（s），2.53（d，7.6），3.14（dd，21.0，10.6），3.78（ddd，9.0，9.0，3.8），3.89（dd，9.2，5.2），4.80（d，7.8），4.94（d，7.4），4.99（dd，14.8，7.2）；與異黃芪苷II相似的信號δ 1.02（s），1.11（s），1.28（s），1.30（s），1.36（s），1.48（s），1.50（s），2.00（s）；2.53（d，7.6），3.14（dd，21.0，10.6），3.39（dd，11.2，4.4），3.78（ddd，9.0，9.0，3.8），3.89（dd，9.2，5.2），4.80（d，7.8），4.94（d，7.4），4.99（dd，14.8，7.2）；與環黃芪醇相似的信號δ 1.03（s），1.30（s），1.33（s），1.37（s），1.45（s），1.58（s），1.89（s），1.96（dd，12.0，4.0），2.06（dd，11.5，9.0），2.55（d，7.5），3.12（dd，11.5，9.0），3.66（dd，11.5，4.5），3.80（d，9.5），3.89（dd，9.0，5.5）。

氨基酸類成分：與甘氨酸相似的信號，包括δ 3.60（s）；與丙氨酸相似的信號，包括δ 1.49（d，7.2）；與纈氨酸相似的信號，包括δ 1.06（d，6.6），1.00（d，7.2）；與脯氨酸相似的信號，包括δ 2.08（m），2.36（m），4.16（dd，8.4，6.6）；與蘇氨酸相似的信號，包括δ 1.33（d，6.6），4.20（m）；與天冬酰胺相似的信號，包括δ 2.85（dd，7.8，16.8），2.95（dd，4.2，16.8），4.01（dd，7.8，4.2）；與蘋果酸相似的信號，包括δ 2.66（d，3.0），2.68（d，3.0）；與膽堿相似的信號，包括δ 3.21（s）；與尿苷相似的信號，包括δ 5.89（dd，4.2，7.2），7.93（d，7.8），3.85（dd，12.6，3.6）；與腺苷相似的信號，包括δ 6.03（d，6.6），8.23（s），8.35（s）；與蔗糖相似的信號，包括δ 4.03（t，8.4），4.18（d，9.0），5.40（d，4.2），3.44（t，8.4），3.82（m），3.53（dd，9.9，3.6），3.70（t，9.6）。

2.3 恒山黃芪典型1H-NMR指紋圖譜以及相似度分析

將10批恒山黃芪、3批蒙古黃芪和3批甘肅黃芪的1H-NMR測定數據導入MestReNova軟件，通過處理不同年限的恒山黃芪的積分面積，以相關系數為標準，使用中值向量法計算得到10批恒山黃芪不同氫核磁共振指紋圖譜的共有模式R（圖3中對照圖譜R）。通過分析其相同成分（1H-NMR中顯示相同信號），確定共有峰，并依據化學位移和耦合常數等，對其化學成分進行鑒定，得到了10批恒山黃芪的1HNMR特征指紋圖譜（見圖3）。通過譜圖直觀分析，可以看到蒙古黃芪（赤峰、烏蘭察布、包頭）、甘肅黃芪（隴西、岷縣、渭源縣）、恒山黃芪（山西渾源）3個不同省份產的黃芪的提取物，其1H-NMR譜圖峰形以及化學位移、耦合常數等在高中低場區基本相同，證明3個不同省份產的黃芪都含有異黃酮類、皂苷類、氨基酸類等成分。但在部分場區仍有一定差異，如在低場區（δ 7.0～7.7），異黃酮的信號峰的強度存在著一定差異，恒山黃芪的信號峰強度明顯高于蒙古黃芪和甘肅黃芪，說明恒山黃芪的異黃酮含量高于蒙古黃芪和甘肅黃芪。而在高場區（δ 0.8～2.0），恒山黃芪、蒙古黃芪、甘肅黃芪的信號峰數量以及峰形有一定的差別，表明它們的氨基酸、脂肪酸類、以及部分糖基等有一定差別。

以共有模式R作為標準，在Excel軟件中計算三個不同產地以及不同年限的黃芪的相似度。相似度評價結果見表2。從表中結果中可以看出，10批恒山黃芪的相識度都在0.9以上，而3批甘肅黃芪的相似度分別是0.774、0.753、0.761，3批蒙古黃芪的相似度分別是0.858、0.845、0.833。相識度分析結果與1H-NMR譜圖分析結果一致，說明3個不同省份產的黃芪在化學成分上和含量上有明顯的差異性。10批恒山黃芪樣品的氫核磁共振指紋圖譜的平均相似度為0.975，結果表明不同年限恒山黃芪的1HNMR圖譜總體相似，差異較小，同時還可以看到，編號Am-02、Am-05、Am-06、Am-10恒山黃芪相較于其他年限的恒山黃芪相似度相對略低，表明這四批樣品相較于其他樣品存在一定差異。

表2 相似度評價結果Table 2 Similarity evaluation result

2.4 主成分分析

2.4.1 貢獻率分析 為了進一步評價不同鄉村產的恒山黃芪藥材的質量差異性，將10批次樣品的恒山黃芪的1H-NMR數據導入SIMCA-P 13.0軟件進行主成分分析。數據采用中心化方法（Mean-centering and Not Scaling）進行尺度同一化處理。通過主成分分析（見表3），可以看出恒山黃芪中的前4個主成分能夠預測95.5%的變量（圖4），R2X和Q2分別為0.955和0.629，對于變量具有良好的預測能力。主成分個數的提取原則為其對應的特征值大于1，故取前3個作為主成分，其累計貢獻率達到89.8%，它代表了所研究1H-NMR的89.8%的信息量。因為相差越大，貢獻率越高，因而從圖4中看出，排在第一和第二的主成分對于變量，貢獻率分別為51.8%和20.6%，是恒山黃芪最重要的成分群，因此前兩個主成分能夠預測大部分的變量。

表3 抽取的主成分特征值及貢獻率Table 3 The characteristic value and contribution of principal components

圖4 恒山黃芪主成分貢獻率分析Fig.4 Analysis of contribution rate of the main components of Hengshan Astragalus membranaceus

由圖5主成分因子相關圖可以看出，前2個主成分因子與化學位移δ 0.98～1.72，1.84～2.44，2.80～3.12，3.88～4.16，5.36～6.76，7.08～7.32，7.76～7.96這六個分段峰內特征峰高度正相關，說明其對樣品的區分評價貢獻最大。而根據恒山黃芪1H-NMR的典型信 號 歸 屬 分 析，0.98～1.72，1.84～2.44，2.80～3.12，3.88～4.16分段，主要是三萜皂苷特征峰集中的區域，5.36～6.76，7.08～7.32，7.76～7.96分段，主要是異黃酮特征峰集中的區域，中國藥典中恒山黃芪的主要藥物化學成分也集中體現在這兩類物質中，而1H-NMR的PCA分析也證實了其與藥典的統一性，上述高度正相關的特征峰在恒山黃芪藥材的質量控制中有相對重要的作用，而1H-NMR的快速分析也證實了其廣泛有效的應用性。

圖5 主成分因子相關圖Fig.5 Principal component factor correlation graph

2.4.2 恒山黃芪的主成分分析 主成分分析研究結果與相似度評價結果基本一致，建立的1H-NMR指紋圖譜結合多元統計分析方法可用于恒山黃芪的質量控制和評價。主成分分析的二維得分圖和3D圖見圖6。圖6二維得分圖顯示，不同采樣地點的恒山黃芪數據點相互交錯，均呈現出較松散的分布，樣品離散度相似且化學成分組呈現出一定的變異，然而，10批恒山黃芪在PCA分析聚為2類（樣品Am-01、Am-02、Am-04、Am-05、Am-09聚為一類，樣品Am-03、Am-06、Am-07、Am-08、Am-10聚為一類），但聚類分組不明顯，而樣品Am-02、Am-05、Am-06、Am-10距離中心點較遠。圖6的3D圖顯示恒山黃芪較為集聚（Am-10遠離群落，這與相似性分析結果一致），表明該組內的均一性相對較好，在建立的三維坐標圖中，不同來源的恒山黃芪集中在三維的位置，說明10批的恒山黃芪樣品化學成分差異較小。綜合主成分分析說明渾源縣不同地點生長的恒山黃芪，雖然生長環境有所不同，但在化學成分上不存在顯著差異，具有很強的相似性。

圖6 恒山黃芪主成分分析的分數散點圖和3D圖Fig.6 Principal component analysis score scatter plot and 3D plot of Hengshan Astragalus membranaceus

對比分析Am-02、Am-05、Am-06、Am-10的采樣地點，可以得出恒山黃芪主要化學成分與其生態因子，特別是地區海拔有著密切關系。研究已經證實，海拔高度和經緯度是影響植物布局及其生長發育的重要因子，在一定范圍內，海拔高度對植物化學成分有顯著影響[28-30]。恒山黃芪最適宜生長的海拔高度為1400～1800 m[31]，而Am-02、Am-05、Am-06、Am-10的生長海拔分別為1845、1910、1270和1856 m，并且從主成分3D圖可以看出Am-02、Am-05、Am-10的成分差異性更大，說明恒山黃芪的主要化學成分隨海拔的增高而差異性變大。這一結果，也與胡明勛等[32]基于HPLC-DAD分析環境因素對黃芪的黃酮和皂苷類成分的影響結果一致。

3 結論與討論

通過不同來源恒山黃芪的相似度分析和主成分分析，發現渾源縣不同地方產的恒山黃芪化學成分不存在明顯差異性，建立了典型的恒山黃芪1H-NMR指紋圖譜，鑒別其存在24種化合物，包括三萜皂苷、異黃酮、氨基酸、有機酸、糖等，三萜主要有黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷III、黃芪甲苷、異黃芪苷I、異黃芪苷II、環黃芪醇；異黃酮主要有芒柄花素、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷、3-羥基-9，10-二甲氧基紫檀烷、9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷。

現行的1H-NMR分離技術常用于對中藥材進行系統生物分離后再進行NMR分析，本研究未經系統的生物分離過程，也達到了快速分析的目的，和高效液相圖譜分析相比，基于氫核磁共振的靈敏性可以更快速的更全面的顯示出恒山黃芪中的含量成分。為了更精密的測量恒山黃芪指紋圖譜中的信號，可進一步采取將二維核磁共振（2D-NMR）圖譜與高分辨質譜結合的方法，可對重疊信號進行一定的分離并提供更多的結構鑒定信息。

PCA相關分析結果表明，恒山黃芪的主要化學成分含量與海拔有一定的相關性，恒山黃芪作為山西地道藥材，其表現出的品質優勢是恒山地區多種環境因子決定的，是特定的氣候條件下，海拔、經緯度、氣候、土壤的綜合影響的結果。而生態因子對藥材品質的影響是多方位的，因此后續研究應采用應用多元統計分析方法，同時分析不同生態因子相互作用的影響，進一步分析生態因子對藥材化學成分代謝的關鍵酶。