單增李斯特菌雙元調控系統hssS/hssR缺失株的構建及其生物學特性

安 妮，張 鈺，方小偉，梁雄燕，劉 晶，楊玉瑩，方 春

(長江大學動物科學學院，荊州 434025)

單核細胞增生性李斯特菌(又稱為產單核細胞李氏桿菌)簡稱單增李斯特菌(LM)，是革蘭陽性胞內寄生菌，在自然界分布廣泛，可導致人獸共患病[1-2]。動物感染李斯特菌主要是由于食入被李斯特菌污染的飼料，繼而通過排泄物、分泌物排出細菌，污染肉制品、奶制品或水產品，并通過這類食物感染人，從而引起人的李斯特菌病。李斯特菌病患者通常為老年人、嬰幼兒及孕婦等抵抗力低下者，主要引發敗血癥、腦膜炎、胃腸炎、流產等疾病[3-4]。

LM能抵抗外界多種惡劣環境，如強酸、強堿、高鹽、低溫和強氧化環境，這一特性對食品安全構成了嚴重的威脅[5-7]。在細菌感染宿主的過程中同樣會面臨各種環境，如胃酸、吞噬體中的弱酸環境及非特異性炎性因子的識別[8-9]。雙組分調控系統(TCSs)是幫助細菌適應自然界和食品加工過程中遇到的許多應激因素的主要系統之一，該系統由感應外界信號的組氨酸激酶(HK)和調控胞內相關基因表達的應答調控因子(RR)組成，研究證明，PhoP/PhoR、LisR/LisK、CheY/CheA等多種TCSs介導單增李斯特菌抗應激、毒力和對抗生素的抵抗力[10]。LM中的雙元調控系統HssSR的主要功能是調控血紅素應激，通過激活hrtAB表達來排出多余的血紅素，從而提高細菌的存活率[11]。單增李斯特菌LO28的基因組編碼一個推定的HssR一致物Lmo2583，與金黃色葡萄球菌HssR具有48%的同源性[12]。但在金黃色葡萄球菌中，HssS/HssR除了抗血紅素應激外，Hss或Hrt系統的失活會導致金黃色葡萄球菌毒力增強，而Hss和Hrt系統也存在于單增李斯特菌中[13]。但HssS/HssR的其他功能尚不清楚，因此本研究以單增李斯特菌10403S為親本株，利用同源重組技術構建hssS/hssR基因缺失株，并通過應激生長試驗、細胞試驗和雞胚毒力試驗來評估其對單增李斯特菌抗應激能力和毒力的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、載體、細胞及雞胚 單增李斯特菌參考菌株10403S(血清型為1/2a型)；大腸桿菌DH5α；穿梭質粒pKSV7由本實驗室保存。小鼠單核巨噬細胞RAW264.7細胞株由長江大學動物科學學院郭利偉老師惠贈。雞胚購自長江大學實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑 LB培養基購自上海生工生物技術有限公司；腦心浸液培養基BHI購自北京陸橋生物技術有限公司；2×TaqPlus Master Mix Ⅱ和瓊脂糖購于南京諾唯贊生物科技有限公司；限制性核酸內切酶BamH I購自NEB公司；核酸染料Goldview購自上海自賽百盛公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒及DNA Marker購自武漢擎科生物技術有限公司；無縫克隆試劑盒購自北京艾德萊生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 根據參考單增李斯特菌株10403S(登錄號為CP002002)的基因序列信息，使用Vector NTI軟件設計hssS/hssR上、下游同源臂擴增引物(表1)，引物由武漢擎科生物技術有限公司合成。

表1 本研究所用的引物

1.2.2 基因缺失株的構建 按照文獻報道的方法構建基因缺失株[14]，以單增李斯特菌10403S基因組為模板，通過融合PCR方法擴增hssS/hssR同源臂，同源臂回收后與BamH I線性化的pKSV7進行重組連接構建重組穿梭質粒pFL333。將pFL333電轉至10403S感受態細胞中，在含10 μg·mL-1氯霉素的BHI中，41 ℃培養條件下連續傳代實現同源重組；已重組的克隆在無抗BHI中于30 ℃培養箱中連續傳代消除重組質粒，以獲得缺失株ΔhssS/hssR。

1.2.3 生長曲線測定 根據文獻方法測定細菌生長曲線[15-16]。將親本株10403S和缺失株ΔhssS/hssR分別挑取單菌落，37 ℃震蕩培養過夜，調OD600 nm至0.6，將菌液分別在含20 mmol·L-1H2O2、pH 7、pH 4.5和5% NaCl的BHI培養基中稀釋100倍后，加入96孔酶標板中，每株菌設置4個平行，置于37 ℃靜置培養，每2 h測定其OD600 nm，直至測到生長平臺期并繪制生長曲線。

1.2.4 應激生長試驗 參照文獻[17-18]方法進行細菌體外應激生長試驗。將生長至對數期的親本株10403S和缺失株ΔhssS/hssR加入終濃度為20 mmol·L-1H2O2的BHI培養基中，37 ℃靜置培養1 h，將H2O2作用前后的菌液進行倍比稀釋，點板后置于37 ℃培養箱過夜培養，根據菌落計數計算出生長率。本試驗進行3次獨立重復。

1.2.5 細菌抗吞噬與胞內增殖試驗 參照文獻[15,19]方法進行細菌抗吞噬和胞內增殖試驗。將生長至對數期的親本株10403S和缺失株ΔhssS/hssR各取1 mL菌液離心收集，并用1 mL PBS重懸菌體，作為原液；以感染比(MOI)為細菌量∶細胞量=10∶1的比例感染單層的RAW264.7細胞，孵育30 min后，棄去培養液，用PBS洗3遍，并加入含有慶大霉素(200 μg·mL-1)的DMEM培養基，繼續孵育1 h后，棄去培養液，PBS洗3遍，每孔加入1 mL滅菌去離子水，室溫靜置10 min，隨后充分吹吸，將其倍比稀釋后平板計數，以計算吞噬率；另一塊細胞板加入低濃度慶大霉素(20 μg·mL-1)的DMEM培養基，繼續培養6 h，以同樣的方法裂解細胞后，進行平板計數，以計算細菌在胞內的增殖率。本試驗進行3次獨立重復。

1.2.6 雞胚毒力試驗 參照文獻[20-21]方法進行雞胚毒力試驗。將生長至對數期的親本株10403S和缺失株ΔhssS/hssR菌液離心收集，并用 PBS重懸菌體，作為原液進行倍比稀釋，選取10-4、10-5、10-63個梯度，每個稀釋梯度經尿囊腔接種0.1 mL至14日齡雞胚6個，同時接種同樣劑量的PBS作為陰性對照組，38 ℃ 65%濕度孵育24 h后開始照蛋，觀察7 d(168 h)，棄去48 h內的死亡胚，觀察并統計48～168 h各稀釋梯度雞胚的死亡情況，使用改良寇氏法計算雞胚半數致死量并繪制存活率曲線圖。7 d后，將親本株與缺失株中的10-5稀釋度攻毒組內的雞胚無菌取出肝，用研缽研磨后加入1 mL PBS混勻，連續梯度稀釋后進行平板計數以計算雞胚肝載菌量。本試驗進行3次獨立重復。

1.2.7 統計分析 所有試驗均重復3次，并通過GraphPad Prism 5對組間數據進行分析處理，P<0.05和P<0.01分別表示差異顯著和差異極顯著，在圖中分別用“*”和“**”標注。

2 結 果

2.1 LM hssS/hssR基因缺失株的構建

以LM 10403S株基因組為模板，分別擴增上、下游同源臂片段，大小分別為558和587 bp，以第一輪混合回收后的PCR產物擴增融合的同源臂片段(1 145 bp)；將融合的同源臂與穿梭載體pKSV7重組連接后轉化DH5α感受態細胞中，成功構建pFL333重組質粒。將重組質粒電轉至單增李斯特菌10403S感受態細胞中，將電轉成功的菌株，在41 ℃、氯霉素(10 μg·mL-1)條件下進行同源重組，獲得重組菌株，將其置于30 ℃、無抗條件下傳代培養20代后獲得無氯霉素抗性的重組菌株，即為hssS/hssR基因缺失株(圖1)。

M1.DL2000 DNA相對分子質量標準; 1.上游同源臂; 2.下游同源臂; 3.上下游同源臂; 4～7.重組質粒pFL333; 8.陰性對照；M2.DL5000 DNA相對分子質量標準; 9.親本株10403S; 10.缺失株ΔhssS/hssR

2.2 生長曲線測定

為了探索HssS/HssR雙元調控系統是否介導單增李斯特菌的抗應激作用，本研究使用了不同條件(pH 4.5、20 mmol·L-1H2O2和5% NaCl)的BHI培養基來評估單增李斯特菌對酸、氧化和滲透壓環境的抗應激能力。親本株10403S和缺失株ΔhssS/hssR在pH 4.5、20 mmol·L-1H2O2和5% NaCl條件下的生長曲線顯示(圖2)，在正常生長狀態下(pH 7)，缺失株與親本株生長能力無差異；在酸和滲透壓應激條件下，生長平臺期以前親本株和缺失株生長能力無差異，到達平臺期后缺失株的存活量低于親本株；而在氧化應激條件下，在任何生長時期缺失株的生長能力均低于親本株。以上結果表明HssS/HssR可能介導單增李斯特菌的抗酸、抗滲透壓和抗氧化應激，其中對抗氧化應激的作用最明顯。

A.pH 7; B.20 mmol·L-1 H2O2; C.5% NaCl; D.pH 4.5

2.3 應激試驗

通過生長曲線得知氧化應激對缺失株生長的抑制作用最大，接著通過氧化應激試驗來進一步評估HssS/HssR對氧化應激的貢獻。結果顯示(圖3)，在氧化環境中應激處理1 h后，缺失株的生長率顯著低于親本株(P<0.01)。說明雙元調控系統HssS/HssR介導單增李斯特的抗氧化應激作用。

**.P<0.01

2.4 細菌抗吞噬與胞內增殖試驗

本研究用小鼠巨噬細胞RAW264.7研究缺失株抵抗巨噬細胞吞噬的能力及其在巨噬細胞內的存活增殖能力。結果顯示(圖4)，與親本株10403S相比，缺失株的吞噬率顯著降低(P<0.01)，說明缺失株的抗吞噬能力更強；且缺失株在胞內的增殖率顯著升高(P<0.05)，說明缺失株在胞內的增殖能力更強，進一步說明了HssS/HssR介導單增李斯特菌的胞內感染過程。

*.P<0.05; **.P<0.01

2.5 雞胚毒力試驗

為了探索HssS/HssR對單增李斯特菌毒力的作用，本研究分別用親本株和缺失株對雞胚進行攻毒，測定其存活率、半數致死量和肝載菌量。根據規定時間內的累計死亡率，按改良寇式計算法得出親本株LD50為102.2，缺失株LD50為101.4，與親本株10403S相比，缺失株的毒力更強；繪制10-5稀釋梯度攻毒組的存活率曲線圖(圖5，第90小時后雞胚不再死亡)，缺失株在攻毒后的第60小時雞胚存活率為67%，而親本株存活率為83%，且在第60小時后缺失株組存活率一直低于親本株，說明與親本株10403S相比，缺失株ΔhssS/hssR的毒力更強；臟器載菌量結果(圖6)顯示缺失株ΔhssS/hssR在雞胚肝定殖能力較親本株強(P<0.01)。以上結果表明，hssS/hssR基因缺失后顯著增強單增李斯特菌的毒力。

圖5 攻毒后雞胚的存活率曲線

**.P<0.01

3 討 論

單增李斯特菌在自然界中分布廣泛，可耐受外界多種惡劣環境，如低溫、低pH、高鹽、強氧化等環境[21]，單增李斯特菌已成為食品加工過程中非常常見的污染物之一，威脅到了人類的健康[22-23]。在感染過程中，TCSs發揮了不可或缺的作用，單增李斯特菌通過HK感受外界環境刺激后將信號傳遞給胞內的RR，然后通過調節不同的基因來增強其自身在環境中的生存能力，尤其是在惡劣的環境中，LM會上調毒力基因來促進其生存[16]。根據P2CS數據庫最新數據顯示，單增李斯特菌一般具有13～18對TCSs[24]。

本研究以10403S為親本株，構建了hssS/hssR基因缺失株，應激存活試驗表明hssS/hssR基因缺失后抗氧化應激能力顯著降低，同時酸應激和滲透壓應激條件下的存活率也降低，顯示HssS/HssR可能在LM適應環境和應激過程中發揮了作用。P?ntinen等[25]發現在參考菌株EGD-e中敲除lmo2582不影響LM在37 ℃及低溫下的生長能力，其他條件未見報道；本研究發現hssS/hssR的缺失并沒有影響LM在37 ℃的生長能力，但明顯降低了細菌在氧化應激環境(20 mmol·L-1H2O2)中的生長能力，說明HssS/HssR可能介導LM的抗氧化應激作用。巨噬細胞吞噬溶酶體內存在氧化應激[26]，其中的氧化成分復雜，含有多種ROS和RNS，且有研究表明H2O2可顯著促進LM毒力基因的轉錄[27]，本研究發現與親本株10403S相比，缺失株ΔhssS/hssR抗吞噬能力顯著增強，且在小鼠巨噬細胞內的增殖能力也顯著增強，說明hssS/hssR基因缺失后可能導致LM對氧化環境更敏感，從而促進毒力基因的轉錄，但具體調控機制還有待研究。Torres等[13]報道hssR失活會導致金黃色葡萄球菌在感染小鼠96 h后，肝載菌量上升，本研究中缺失株感染雞胚后，在肝載菌量上升，與已有研究結果趨勢一致。細胞試驗與動物試驗結果一致，初步顯示HssS/HssR介導單增李斯特菌的毒力。

綜上所述，本研究成功構建雙元調控系統hssS/hssR缺失株，通過部分生物學特性比較結果顯示單增李斯特菌HssS/HssR雙元調控系統可能介導其抗氧化應激與毒力，但其具體調控機制還有待深入研究。

4 結 論

成功構建了單增李斯特菌hssS/hssR基因缺失株，hssS/hssR基因的缺失不影響單增李斯特菌的生長狀況，但導致單增李斯特菌在氧化應激條件下的生長能力顯著降低，同時增強其抗巨噬細胞吞噬能力、巨噬細胞內增殖能力以及對雞胚的致病性。雙元調控系統HssS/HssR可能介導單增李斯特菌抗氧化應激作用和毒力。