葡萄炭疽病病原生物學特性及室內毒力測定

孔 瓊，倪 銳，陳燦靈，薛春麗，朱天貴，李正旭，袁盛勇

（1.紅河學院生物科學與農學學院/云南省高校滇南特色生物資源研究與利用重點實驗室，云南蒙自 661199；2.蒙自市農業和科學技術局，云南蒙自 661199）

葡萄（Vitis vini feraL.）為葡萄科葡萄屬木質藤本植物，其果實營養豐富，用途廣，是全球最廣泛栽培的水果之一，其種植面積和產量居世界水果生產前列。據不完全統計，我國葡萄栽培面積已超過1198.5萬畝，鮮品產量超過1366.9萬t[1]。目前鮮食葡萄種植是我國農業產業結構調整中的主導產業，也是很多縣市農民發家致富的產業之一[2]。但隨著葡萄大面積種植和品種的單一化，病害也隨之增多，成為葡萄生產上的主要問題。據課題組前期于2015—2016年在云南省蒙自市草壩鎮進行葡萄病蟲害調查時發現未套袋的“紅提”和“黑蜜”果實上炭疽病較為嚴重，其發病率高達50%，該病主要降低了果實品質和產量，還造成了巨大的經濟損失。該病主要為害果實，同時穗軸、葉片、葉柄和新梢也會感病。其中發病果實表面產生褐色小斑點，隨后擴大形成黑褐色圓形凹陷病斑，溫度高和濕度大時，凹陷病斑處溢出粉紅色黏液，最后造成果實脫落和腐爛[3-4]。前人將其病原菌鑒定為炭疽菌屬的膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）2種[5]，而我國僅有膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）侵染葡萄引起炭疽病的報道[6-8]。該病在多雨和潮濕條件下發病流行，主要于葡萄著色期開始盛發，病穗率有時高達50～70%，引起嚴重減產[9]。本課題組前期進行了蒙自市葡萄病蟲害的田間調查，發現葡萄炭疽病發病較為嚴重，且將病原分離鑒定為膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides），但目前關于云南省蒙自市葡萄炭疽病的田間發病規律、病原菌種類等相關研究均無報道。因此本文采用葡萄炭疽病病原膠孢炭疽菌為試驗材料，對該病原進行生物學特性和室內藥劑篩選，為云南蒙自市葡萄炭疽病的發生規律和田間防治提供試驗數據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和藥劑

采用組織分離法對蒙自市草壩鎮的帶病“黑蜜”果實（圖1-A）進行病原菌分離，參考《植物病原真菌學》張忠義等[10]進行形態特征觀察，并對其致病性進行了測定，最終將其病原鑒定為膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides Penz（圖1-B）。毒力測定使用了9種殺菌劑，即10 %苯醚甲環唑（北京北農天風農藥有限公司）、250 g/L吡唑醚菌酯（德國巴斯夫股份有限公司）、50 %啶酰菌胺（德國巴斯夫股份有限公司）、125 g/L氟環唑（德國巴斯夫股份有限公司）、50 %福美雙（河北贊峰生物工程有限公司）、30 %己唑醇（華北制藥集團愛諾有限公司）、25 %丙環唑（上海生農生化制品有限公司）、250 g/L戊唑醇（安道麥馬克西姆有限公司）、80 %代森錳鋅（印度科門德國際有限公司）。

圖1 葡萄炭疽病田間癥狀及病原菌形態特征

1.2 方法

1.2.1 病原生物學特性研究

1.2.1.1 溫度對病原菌菌落生長、孢子萌發、產孢量及孢子致死溫度的影響

溫度梯度設為5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃和40 ℃，將直徑為6 mm菌絲塊接種于PSA平板中央，置于上述溫度下恒溫暗培養。每個處理3次重復，第7 d對菌落直徑和產孢量進行統計；同時將制好的孢子懸浮液置于不同溫度下進行培養，24 h后鏡檢，統計孢子的萌發情況[11]。

孢子致死溫度的測定：取2 mL菌懸液裝入滅菌試管中，分別在40 ℃、42 ℃、44 ℃、46 ℃、48℃、49 ℃、50 ℃、51 ℃、52 ℃下恒溫水浴加熱15 min，取出后立即在冷水中冷卻，在干凈無菌的凹面玻璃上注入1～2滴菌液，于25 ℃下保濕培養，24 h后在顯微鏡下觀察并對結果進行記錄。

1.2.1.2 pH對病原菌菌落生長及產孢的影響

用0.1 mol/L HCL或NaOH分別制成pH為3、4、5、6、7、8、9和10的PSA平板，于平板中接入菌絲塊后置于恒溫培養箱中（1.2.1.1中篩選出測最佳溫度）進行生長，7 d后統計結果。

1.2.1.3 光周期對病原菌菌落生長及產孢的影響

將接入PSA平板中央的菌絲塊置于1.2.1.1中篩選出測最佳溫度下，全日照、全黑暗、光暗交替三種光周期恒溫培養，于第7 d測定結果。

1.2.1.4 不同碳氮源對病原菌菌落生長及產孢量的影響

用查彼（Czapek）培養基為基礎培養基，以等質量的葡萄糖和淀粉等碳源取代Czapek培養基中蔗糖制成含碳培養基；同樣以等質量的硝酸銨、硫酸銨、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏替換Czapek培養基中硝酸鉀制成含氮培養基，于1.2.1.1中篩選出測最佳溫度下恒溫培養，7 d后測量結果。

1.2.1.5 濕度對孢子萌發的影響

將孢子懸浮液均勻涂抹于載玻片上，在室溫下自然干燥，用小容器調節法，以硫酸控制相對濕度，濕度設置為55%、65%、75%、80%、85%、90%、93%、95%、98%、100%[11]。置于1.2.1.1中篩選出測最佳溫度下暗培養，24 h 后統計萌發率。

1.2.2 病原菌室內毒力測定

將9種殺菌劑分別配制成不同濃度的含藥PSA平板，并接入直徑為6 mm菌絲塊，設不含藥為空白對照，3次重復，于1.2.1.1中篩選出測最佳溫度下暗培養8 d，用十字交叉法測量菌落直徑，計算相對抑制率。公式為：相對抑制率=[(對照菌落生長直徑—處理菌落生長直徑)÷對照菌落生長直徑]×100%[12]。所得結果經Finney幾率分析法和DPS統計軟件進行處理，求出各殺菌劑的毒力回歸方程、EC50及相關系數（r）。

2 結果與分析

2.1 生物學特性

2.1.1 溫度對病原菌菌落生長、產孢量及孢子萌發的影響

葡萄膠孢炭疽菌在溫度為5℃和40℃時菌絲不生長，10℃時菌絲少量生長，且無孢子產生（表1）。適宜菌絲生長和孢子萌發的溫度范圍為20℃～ 30 ℃，其中25℃和30℃下最高，二者之間在0.05水平下差異不顯著。在20℃～ 30℃的溫度范圍內，病原菌的產孢量隨著溫度的增加而增高，且于30℃時達到最大為（2.77±0.40）×107個/mL，顯著高于其他處理。因此高溫有利于該病原菌的生長發育，且病菌菌絲生長、產孢和孢子萌發的適宜溫度為20℃～30 ℃，最適溫度為30℃。

表1 溫度對病原菌菌落生長、產孢量和孢子萌發的影響

2.1.2 孢子致死溫度

通過測定，發現分生孢子在40℃～ 52 ℃共計9個溫度條件下水浴15 min后，其在40℃、42℃、44℃、46℃和48 ℃下均能萌發，且萌發率呈現下降趨勢，分別下降了10.25%、5.23%、3.94%、3.01%和1.64%，而49℃、50℃和52 ℃下均不能萌發。因此分生孢子的致死溫度為49 ℃、15 min。

2.1.3 pH對病原菌菌落生長及產孢的影響

由表2可看出葡萄炭疽病原菌對酸堿適應性較強，菌絲能在pH值在3～10范圍內生長，同時也有孢子產生。pH 為6時，菌絲生長雖然達到最大，但與pH為4和5的處理差異不顯著；而產孢量于pH為4的處理達到最高為（2.27±0.43）×107個/mL，顯著高于其他處理。說明該病原菌喜酸性環境。

表2 pH對病原菌菌落生長及產孢量的影響

2.1.4 光周期對病原菌菌落生長及產孢的影響

葡萄炭疽病病原菌在三種不同光周期處理下均能生長和產孢（見表3）。其中全黑暗處理下菌落生長最慢，顯著低于有光照的處理，而產孢量達到最大為（1.43±0.66）107個/mL，顯著高于其他兩種光周期處理。因此光照有利于菌絲的擴展，黑暗有利于產孢量的增加。

表3 光周期對病原菌菌落生長及產孢的影響

2.1.5 不同碳氮源對病原菌菌落生長及產孢的影響

在測試的3種碳源中，蔗糖為碳源的培養基上菌絲生長最快和產孢量最高（表4）。此時菌落直徑為（5.47±0.68）cm，其次為葡萄糖和淀粉的處理，但二者差異不顯著。而在供試的6種氮源下，適合菌絲生長的氮源是蛋白胨、牛肉膏和酵母膏，其中蛋白胨的處理為最大為（6.43±0.40）cm，三種處理間差異不顯著；適合產孢的氮源是牛肉膏和硝酸鈉，其中牛肉膏的處理最高為（2.58±0.73）×107個/mL。因此適合病原菌菌絲生長和產孢的碳氮源是蔗糖和牛肉膏。

表4 不同碳氮源處理對膠孢炭疽菌菌絲生長和產孢量的影響

2.1.6 濕度對孢子萌發的影響

在測試的10個濕度條件下，孢子萌發率與濕度成正比關系，且高濕條件有利于孢子萌發（圖2）。當相對濕度低于80%時，孢子不能萌發，而在80%～100%均能萌發，且隨著濕度的增加孢子萌發率增高，100%時孢子萌發率達到最高,為47%。

圖2 不同濕度對炭疽菌孢子萌發的影響

2.2 殺菌劑對病原菌的毒力比較

通過菌絲生長速率法測定發現，9種殺菌劑對葡萄炭疽病菌絲生長均有不同的抑制作用（表5）。其中丙環唑乳油、氟環唑水懸浮劑、苯醚甲環唑水分散粒劑、己唑醇水懸浮劑的抑制效果較好，其EC50均低于0.50 μg/mL，分別為0.35μg/mL、0.44μg/mL、0.45 μg/mL、0.47 μg/mL，且相關性高，適合田間用藥選擇。戊唑醇水乳劑和吡唑醚菌酯乳油的EC50介于0.50～ 1.50 ug/mL之間；而福美雙可濕性粉劑、啶酰菌胺水分散粒劑和代森錳鋅可濕性粉劑的EC50較大，介于10～ 55 μg/mL之間。

表5 9種殺菌劑對葡萄炭疽病病原的抑制結果

3 討論與結論

植物病害的發生流行是寄主、病原和環境互作后的結果，因此病原菌生物學特性與病害發生發展有著緊密聯系。炭疽菌屬（Colletotrichum）是一類寄主廣泛的植物病原真菌，目前有600余種，多發生于高溫濕熱地區，主要引起葉斑、枝枯、爛果等，造成減產。其中較為常見的致病種是膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）[13-14]。本研究從云南葡萄種植產區蒙自市的葡萄炭疽病標本上分離鑒定出其病原菌為膠孢炭疽菌，該菌菌絲生長和孢子萌發的溫度范圍為20℃～30℃，且最適溫度為25℃，而產孢適宜溫度相對較高為30℃，分生孢子致死溫度為49 ℃、15 min；喜高濕環境，孢子萌發相對濕度要求高于80%；光照有利于菌絲的擴展，黑暗有利于產孢量的增加；這些與董陽輝等和趙杰等對葡萄炭疽病生物學特性測定中溫度、濕度和光照等影響因素結果相似[15-16]。但與王培松等[17]對山東煙臺葡萄炭疽菌的生物學特性研究結果略有差異，可能是同一病原菌存在不同的生態適應性。不同酸堿環境和營養條件對葡萄膠孢炭疽菌生長也有較大影響。本文中病原菌菌落生長的適宜pH范圍較大，其菌絲生長最適pH為6，產孢最佳pH為4，喜酸性環境；適宜病菌菌絲生長和產孢的碳源和氮源是蔗糖和牛肉膏，而無機氮源的促進生長效果不佳；相似的結果也表現于董陽輝等和趙杰等對葡萄炭疽病生物學特性測定中[14-15]。因此該病易在高溫、高濕和酸性環境（果實著色期）下侵染和發生，這與葡萄炭疽病易發生流行于蒙自市草壩鎮的5月下旬葡萄收獲季節的天氣條件相一致。

關于葡萄炭疽病的防治主要還是化學防治，目前主要采用三唑類甾醇脫甲基抑制劑咪鮮胺、戊唑醇、苯醚甲環唑，以及甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑嘧菌酯、吡唑醚菌酯等多種藥劑交替使用[18-21]。本文采用菌絲生長速率法測定了9種殺菌劑對葡萄炭疽病病原膠孢炭疽菌的毒力情況，發現丙環唑、氟環唑、苯醚甲環唑和己唑醇抑菌活性很高，EC50分別為0.35μg/m、0.44μg/m、0.45μg/m、0.47μg/mL。因此，在防治葡萄炭疽病時，上述所測定的4種三唑類甾醇脫甲基抑制劑是值得推薦的殺菌劑，其次是有機硫類的福美雙和煙酰胺類的啶酰菌胺等。若要將本文的研究結果應用于田間，還需要進一步的盆栽防治試驗，或者將上述6種不同類型的藥劑混配篩選，才能進行該病害的有效防控。