地骨皮乙素對低溫爆震肺氧化應激損傷影響研究

孫久惠， 劉 穎， 叢培芳， 史秀云， 馬瑞珩， 金紅旭

1.錦州醫科大學研究生培養基地，遼寧 沈陽 110016；2.北部戰區總醫院 急診醫學科，遼寧 沈陽 110016

低溫環境應激反應可影響呼吸系統，氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡與系統損傷活動有關[1]。肺作為空腔臟器，是爆震發生時最易受損的器官之一。因此，明確低溫爆震對肺的影響并尋找有效的救治藥物具有重要意義。地骨皮為茄科植物枸杞或寧夏枸杞的干燥根皮，含有生物堿類、有機酸及酯類、苯丙素類、蒽醌類、柳杉酚、東莨菪素等成分[2]。地骨皮具有抗細菌和真菌、免疫調節、降血壓、解熱、降血脂和血糖等多種藥理作用[3]。有研究認為，地骨皮提取物能夠抑制體內氧自由基的產生，增強抗氧化能力，加速自由基的清除[4]。本研究旨在探討地骨皮提取物地骨皮乙素對低溫爆震肺氧化應激損傷的影響及機制，為更有效地利用地骨皮提供理論依據?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 24只雄性C57/BL小鼠購自遼寧長生生物科技有限公司。地骨皮乙素購自上海源葉生物科技有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒和丙二醛(malonaldehyde，MDA)試劑盒均購自遼寧匯佰生物科技有限公司。實驗設計得到北部戰區總醫院動物倫理委員會許可。

1.2 模型建立 將小鼠隨機分入對照組、模型組、地骨皮乙素組，每組各8只。地骨皮乙素組灌胃給予地骨皮乙素4.0 g/kg，每天1次，連續4周；對照組和模型組分別灌胃給予等體積生理鹽水。小鼠均飼養于SPF級實驗室，溫度維持在(22±3)℃，濕度維持在45%～65%，自由飲食飲水。適應性飼養7 d后，-20℃、濕度15%恒溫箱中低溫飼養7 d，禁水不禁食，每8小時觀察小鼠狀態并喂食，建立低溫損傷模型。7 d后采用自主設計研發的高仿真爆震傷模擬裝置建立低溫爆震傷致小鼠肺損傷模型(模型組和地骨皮乙素組)，具體方法參考文獻[4]。

1.3 濕干重檢測 10%水合氯醛麻醉C57/BL小鼠，快速取得肺組織，濾紙擦去表面水分，置于已烤干并稱重(重量為W)的載玻片上稱重并記錄(W1)，然后置于60℃烘箱內烘烤24 h，間隔15 min重復稱重以取得恒重并記錄(W2)。

組織含水量(%)=(W1-W)/(W2-W)×100%

1.4 酶聯免疫吸附試驗 將組織標本進行蛋白提取后，從已平衡至室溫的密封袋中取出板條和試劑。標準品孔和加樣孔均按照說明書操作。按順序加入工作液和孵育，顯色并終止后450 nm下測量光密度值。

1.5 反轉錄酶-聚合酶鏈鎖反應 Trizol reagent提取組織總RNA。取4.0 μg總RNA，65℃變性5 min，經AMV逆轉錄酶42℃逆轉錄30 min，合成cDNA。取5 μl cDNA產物，依次加入10×PCR緩沖液、上下游引物各50 pmol、dNTP 0.2 mmol/L、MgCl22.0 mmol/L、Taq DNA poly-merase 1 U。以下列條件進行擴增：94℃ 3 min，94℃ 45 s，52℃ 45 s，72℃ 45 s。進行30次循環后進一步延伸，72℃ 5 min。

1.6 Western-blot 分別進行組織蛋白提取和總蛋白測定后，將蛋白樣品經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉移至PVDF膜上，室溫封閉1 h，分別用一抗4℃孵育過夜。TBST漂洗3次，加入相對應二抗室溫孵育1 h。TBST漂洗3次，采用ECL Western印跡試劑盒進行化學發光檢測。

2 結果

2.1 各組小鼠肺組織含水量比較 與對照組比較，模型組小鼠肺組織含水量升高(P<0.05)；與模型組比較，地骨皮乙素組小鼠肺組織含水量降低(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織含水量比較

2.2 各組小鼠氧化應激相關指標比較 對照組、模型組、地骨皮乙素組小鼠SOD1分別為(222±13)pg/ml、(731±29)pg/ml、(253±18)pg/ml，SOD2分別為(112±8)U/ml、(211±12)U/ml、(121±11)U/ml，MDA分別為(235±17)nmol/ml、(669±22)nmol/ml、(238±15)nmol/ml。模型組小鼠SOD1、SOD2、MDA水平均高于對照組(P<0.05)，地骨皮乙素組小鼠SOD1、SOD2、MDA水平均低于模型組(P<0.05)。

2.3 各組小鼠Nrf2、Keap1、ARE mRNA表達水平比較 對照組、模型組、地骨皮乙素組小鼠Nrf2 mRNA分別為1、(4.40±0.57)、(1.30±0.28)，Keap1 mRNA分別為1、(3.20±0.34)、(1.50±0.31)，ARE mRNA分別為1、(2.20±0.14)、(1.30±0.17)。模型組小鼠Nrf2、Keap1、ARE mRNA表達水平均高于對照組(P<0.05)，地骨皮乙素組小鼠Nrf2、Keap1、ARE mRNA表達水平均低于模型組(P<0.05)。

2.4 各組小鼠Nrf2、Keap1、ARE蛋白表達水平比較 與對照組比較，模型組小鼠Nrf2、Keap1、ARE蛋白表達水平升高(P<0.05)；與模型組比較，地骨皮乙素組小鼠Nrf2、Keap1、ARE蛋白表達水平降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組小鼠Nrf2、Keap1、ARE蛋白表達水平比較

3 討論

在爆震傷損傷動物模型中，C57/BL小鼠具有結果精確度高、可比性好、價格低廉、血量豐富、免疫系統完善、應激反應均一、器官發育完全等優點，因此，本研究選用C57/BL小鼠建立低溫爆震肺損傷模型。作為呼吸系統的主要器官，肺對寒冷環境和沖擊波的反應變化非常敏感，主要表現為肺內氧氣彌散和氧合效果明顯降低。在低溫爆震損傷后，肺部的病理變化主要表現為：大量中性粒細胞導致肺部炎癥反應，肺內毛細血管膜通透性增加，出現肺組織水腫，以及由于血管內皮受損而形成的血栓和出血[5-6]。細胞凋亡是導致肺損傷的重要原因，細胞內活性氧水平升高是低溫加速細胞凋亡的細胞學表現[7-8]。本研究結果顯示：低溫爆震肺損傷發生后，小鼠肺組織濕干重增加，血清氧化應激相關指標改變，Nrf2、Keap1、ARE mRNA和蛋白表達水平升高；而地骨皮乙素干預能夠有效降低小鼠濕干重，減少氧化應激蛋白，改善低溫爆震肺損傷，且其機制與通過Nrf-Keap1-ARE通路調節細胞氧化應激有關。

Nrf2是一種轉錄因子，可通過調節一系列抗氧化和細胞應激基因來對抗氧化應激，在調控壽命和衰老進程氧化應激損傷等防御機制中起著非常重要的作用[9]。當細胞受到氧化應激時，Keap1蛋白的構象發生改變，與Nrf2的結合減弱，削弱了靶向Nrf2的泛素化修飾和降解，從而使更多新合成的Nrf2轉移入核，結合到相應靶基因啟動子的ARE序列上，激活下游抗氧化損傷基因轉錄。除Nrf-Keap1-ARE通路外，Nrf2作為抗氧化應答中最核心的轉錄因子之一，還能夠參與非Keap1依賴的抗氧化損傷途徑[10]，激活Nrf2可介導下游的一系列抗氧化酶相關基因和蛋白，從而抑制氧化損傷，維持細胞氧化還原平衡。有研究報道，地骨皮乙素能夠作用于Nrf-Keap1-ARE通路，在多種疾病中發揮有效作用[11]。

綜上所述，地骨皮乙素能夠有效改善低溫爆震損傷小鼠肺組織的氧化應激損傷，機制與調節Nrf-Keap1-ARE通路有關。