芪白平肺膠囊對COPD痰瘀阻肺證大鼠肺血管Bax、Bcl-2表達的影響

石孟瑤，朱潔，方莉，童佳兵，王小樂，高雅婷，劉桐，李澤庚，*

(1.安徽中醫藥大學，安徽 合肥 230038；2.安徽中醫藥大學第一附屬醫院，安徽 合肥 230031)

慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary diseases，COPD)是一種進行性和損傷肺血管、肺實質以及氣道的慢性疾病[1]。肺動脈高壓(pulmonary artery hypertension，PH)作為COPD的常見合并病，是導致COPD預后不良的重要因素。肺血管重塑是PH的重要病理改變，表現為肺血管壁增厚導致的管腔狹窄，血流阻力增加[2-3]。早期對肺血管重構及時干預，控制COPD進一步發展合并PH，對降低病死率至關重要。而肺血管內皮細胞的增殖與凋亡失衡，肺內皮細胞凋亡，平滑肌細胞(pulmonary arterial smooth muscle cell，PASMCs )過度增殖遷移是促使肺血管重構的主要機制之一[4]。因此，干預肺血管內皮細胞的增殖與凋亡失衡是防治COPD合并肺動脈高壓的有效方法。

COPD屬中醫學的“肺脹”“喘病”等范疇，該病主要病理特點為本虛標實，虛病位主累及肺、脾、腎三臟，標實主要指痰濁、血瘀[5-6]。清張璐《張氏醫通 肺萎肺脹》曰：“痰夾瘀血礙氣而脹”[7]，從現代醫學角度出發，脈為血之府，肺血管重構相關病變類似于血脈不利導致血液瘀阻，肺為儲痰之器，痰瘀互結聚于肺，辨為痰瘀阻肺之證[8]。前期的動物實驗證明芪白平肺膠囊能夠干預肺血管重構的[9]，細胞實驗證明芪白平肺膠囊可以通過線粒體凋亡途徑，降低低氧造模下的PASMCs中Bcl-2水平，提高Bax的水平，抑制了PASMCs增殖能力[10]，但其相關的體內機制有待進一步明確。為此，本研究在前期研究基礎上觀察芪白平肺膠囊對COPD痰瘀阻肺大鼠肺血管的凋亡/增殖程度的影響，探究其改善COPD合并PH的可能機制。

1 材料及方法

1.1 主要儀器

香煙煙熏箱(自制,長130 cm×寬80 cm×高75 cm)；臺式冷凍離心機(安徽，嘉文儀器裝備有限公司)；生物組織自動脫水機(湖北，亞光)；生物組織包埋機(湖北，亞光)；徠卡切片機 (德國，Leica)；顯微鏡(日本，OLYMPUS)；熒光定量PCR儀(美國，Thermo Scientific)。

1.2 主要試劑與藥品

芪白平肺膠囊由安徽中醫藥大學第一附屬醫院制劑中心提供；雄獅牌香煙(焦油：11 mg，煙堿：1.2 mg，浙江中煙工業公司)；大鼠血管內皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF);ELISA試劑盒(武漢 基因美，JYM0634Ra)；Trizol(America Life technogies，251804)，Novostart SYBR qPCR SuperMix Plus(上海，novoprotein，1910G08)，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(大連，TaKaRa，AJ51485A)，兔抗大鼠Bax抗體(上海 abcam，ab32503)；兔抗大鼠Bcl-2抗體(上海 abcam，ab32124)，通用型二抗試劑盒(北京 Zsbio，PV-6000)。

1.3 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠，由山東省實驗動物中心提供，許可證號：SCXK20190003。安徽中醫藥大學動物房飼養，自由取食、飲水，保持室內溫度(22～24℃)及相對濕度(40%～50%)穩定，采光好，室內干凈整潔。

1.4 方法

1.4.1 模型建立及分組給藥

參照團隊前期造模方法[11]建立COPD痰瘀阻肺證病證結合大鼠模型。30只SPF級大鼠隨機分成正常組、模型組、芪白平肺膠囊組(10只/組)。每天將模型組與芪白平肺膠囊組大鼠置于自制的1 m3熏煙箱內煙熏，每天煙熏1 h，每次20支香煙。煙熏后將大鼠置于常壓低氧裝置內，每天低氧5 h(氧濃度10%～10.5%，CO20.03%左右)。連續造模4周，6 d/周。正常組大鼠正常飼養。其中，芪白平肺膠囊組每天造模結束后予以藥物灌胃1次(10 mL/kg，每1 mL含芪白平肺膠囊0.1 g)，正常組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃。

1.4.2 肺組織病理檢查

取右肺上葉于4%甲醛固定48 h后進行石蠟包埋、切片、制片，后進行HE染色觀察肺組織病理形態。

1.4.3 ELISA檢測血清中VEGF的表達水平

大鼠末次給藥后，經麻醉，腹主動脈取血，經4℃ 800×g離心15 min，取上層血清，按照ELISA試劑盒說明書檢測血清中VEGF表達水平。

1.4.4 熒光定量PCR法檢測肺血管中Bax、Bcl-2基因表達

取適量組織充分研磨，加入1 mL Trizol，孵育10 min，12 000 r/min 4℃ 離心10 min，取上清液，加入一半體積無水乙醇，混勻，靜置2 min，12 000 r/min 4 ℃ 離心3 min，棄廢液，加入500 μL洗滌液，靜置2 min，12 000 r/min 4℃ 離心30 s，棄廢液。按說明書準備相應反應混合物，37 ℃，15 min；85 ℃，5 s，取出上述反應液，即為cDNA，采用SYBR Green 熒光PCR檢測組織中的Bax、Bcl-2 mRNA表達。引物序列見表1。

表1 引物序列表

1.4.5 Western blot檢測肺血管組織的Bax、Bcl-2蛋白水平

分離肺葉外肺動脈，按50 mg加入500 μLRIPA裂解液(含1 mmol PMSF)，冰上勻漿并裂解20 min后，經12 000r/min 4 ℃,離心10 min后收集含有總蛋白的上清液，按1∶4比例加5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液和上清液，渦旋混勻后，100 ℃煮沸8 min制備樣品。待樣品冷卻到室溫后，Western blot法檢測樣品中Bax、Bcl-2蛋白表達情況，其中Bax和Bcl-2抗體按1∶1 000比例稀釋，二抗按1∶10 000稀釋。

1.4.6 統計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠肺組織病理形態對比

正常組大鼠肺泡結構未見明顯破壞，肺血管管壁薄，內皮細胞連續均勻排列，管壁各層未見明顯浸潤的炎性細胞、無明顯增生的平滑肌細胞。模型組可明顯看見肺泡結構破壞，融合，管腔內有滲出物，肺血管增厚明顯，管壁有炎癥細胞浸潤，管腔狹窄。芪白平肺膠囊組大鼠有少量肺泡壁結構破壞，管壁各層有少許炎癥細胞浸潤，肺血管增厚程度較模型組明顯減低，見圖1。

圖1 肺組織HE染色(×200)

2.2 血清中VEGF表達水平比較

與正常組相比，模型組的血清VEGF表達水平明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，芪白平肺膠囊組VEGF水平明顯降低(P<0.01)，見表2。

表2 各組大鼠血清VEGF水平比較

2.3 肺血管組織中的Bax、Bcl-2 mRNA表達

與正常組相比，模型組肺血管組織中Bax mRNA表達水平明顯降低(P<0.01)，Bcl-2 mRNA表達明顯增多(P<0.01)；與模型組相比，芪白平肺膠囊組Bax mRNA表達增多(P<0.01)，Bcl-2 mRNA表達降低(P<0.01)，見表3。

表3 各組大鼠組織Bax、Bcl-2mRNA相對表達量比較

2.4 肺血管組織的Bax、Bcl-2蛋白表達比較

與正常組相比，模型組肺血管組織中Bax蛋白表達水平降低(P<0.01)，Bcl-2蛋白表達明顯增加(P<0.01)；與模型組相比，芪白平肺膠囊組Bax蛋白表達相對增多(P<0.01)，Bcl-2蛋白表達降低(P<0.01),見表4。各組大鼠肺血管中Bax、Bcl-2蛋白條帶圖見圖2。

表4 各組大鼠肺血管組織Bax、Bcl-2蛋白相對表達量比較

注：A.正常組；B.模型組；C.芪白平肺膠囊組。圖2 各組大鼠肺血管中Bax、Bcl-2蛋白條帶圖

3 討論

COPD在中醫屬于“肺脹”“喘證”等范疇，以虛為本，痰、瘀為標，病位在肺，痰瘀阻肺證是COPD常見證型之一[12-13]，有研究基于數據挖掘法發現痰濕證、血瘀證是COPD穩定期常見基礎證候[14]。用現代醫學觀點聯系，可理解為肺血管與肺絡有一定關聯，肺絡受損與肺血管重構有一定聯系[15]。肺血管壁主要分為3層：內膜、中膜層、外膜層，當受到低氧等刺激，肺血管各層均發生變化，其中主要由效應細胞—PASMCs組成的中膜層異常肥大、增殖、遷移到內膜層導致肺血管管腔狹窄[16]，血液循環不暢，機體處于高凝狀態，進而發生肺動脈高壓，導致肺心病。這種肺血管的異常增生狀態主要跟肺血管平滑肌細胞增殖及抵抗凋亡有關，也就是一種增殖與凋亡的失衡狀態[17]。芪平白肺膠囊功效主益氣活血化瘀，臨床上對COPD有一定療效，能夠干預肺血管重構，延緩COPD進一步發展成PH[18]。

Bcl家族蛋白在細胞凋亡機制中發揮著決定性作用，其中Bcl家族蛋白成員Bax促進細胞凋亡，Bcl-2作為控制凋亡的關鍵蛋白可以結合Bax從而達到抗凋亡的效果[19-20]，研究發現香煙刺激下肺血管中Bax蛋白及mRNA表達降低，Bcl-2蛋白及mRNA表達升高且隨著吸煙時間增多而表達增加[21]。劉楊等[22]研究發現異綠原酸A可以降低成纖維細胞的Bcl-2表達，促進Bax表達，促進關節請內成纖維細胞的凋亡，減弱成纖維細胞抗凋亡的能力，達到改善關節腔積液的效果。本實驗結果證明芪白平肺膠囊治療后的COPD痰瘀阻肺證大鼠，Bax基因及蛋白升高表達水平增高，Bcl-2基因及蛋白的表達降低，說明芪白平肺膠囊能夠導致肺血管平滑肌細胞趨向凋亡，起到抑制肺血管中細胞的增殖效果，改善血管管腔狹窄。

血管內皮生長因子(VEGF)是一種血管損傷因子，主要表達于血管平滑肌及氣道中，在吸煙、低氧、炎癥等刺激因素影響下，VEGF的分泌增多能夠，導致血管通透性增加及血管內皮增殖，參與肺血管重構[23]。研究發現溴域抑制劑可以通過抑制VEGF/PI3K/AKT通路，促進Bax表達水平升高，降低Bcl-2表達水平，促進膠質瘤干細胞凋亡[24]。謝文英等[25]研究發現二陳湯能夠降低COPD大鼠肺組織中VEGF水平從而抑制肺血管重構。本研究結果顯示模型組的大鼠血清中VEGF的水平升高，而芪白平肺膠囊組的大鼠血清中VEGF水平降低，說明芪白平肺膠囊可以降低VEGF水平抑制肺血管平滑肌細胞增殖及遷移，干預肺血管重構。

本研究發現，芪白平肺膠囊改善COPD痰瘀阻肺證大鼠肺血管重構的機制可能與降低了血清中VEGF的水平及調控Bax/Bcl-2蛋白的表達，改善血管凋亡與增值的失衡有關。然而芪白平肺膠囊是否通過下調VEGF水平抑制PI3K/AKT通路，增加肺血管中的Bax的含量，降低Bcl-2的含量還需進一步研究。