二妙散水提液的急性毒性試驗研究

劉敏，宣自華，丁捷敏，孟祥文，賈曉益*

(1.安徽中醫藥大學藥學院,安徽 合肥 230012；2.安徽省中藥復方重點實驗室，安徽 合肥 230012;3.安徽省中藥研究與開發重點實驗室，安徽 合肥 230012)

二妙散源于元代醫家朱丹溪的《丹溪心法》，由蒼術和黃柏1∶1配伍而成,主治濕熱下注、下焦濕瘡、足膝紅腫熱痛。在中醫基礎理論中二妙散是清熱燥濕的基礎名方[1]。其中黃柏為君藥，是蕓香科黃檗屬植物黃柏或黃皮樹的干燥樹皮，其味苦、性寒，歸腎、膀胱經[2]。藥典記載主要功效為清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡；蒼術為菊科植物北蒼術或茅蒼術的干燥根莖，其味甘而辛烈，性溫而燥，化濕運脾，用于濕阻中焦，風濕痹痛，眼目昏澀?，F代藥理研究發現，黃柏中主要含有生物堿類，甾醇類，內脂等化學成分[3]，蒼術根莖主要含有揮發油，油中主要含有β-桉油、蒼術醇、蒼術素等成分[4]。黃柏和蒼術具有抗菌、抗炎、止痛、改善機體免疫功能等作用[5-10]。在現代臨床上二妙散主要用于抗炎免疫的治療[11-12]。黃敬文等[13]人報道二妙散能夠保持Th1/Th2細胞的動態平衡從而改善銀屑病的發展。本課題組前期研究發現二妙散水提取物對AA大鼠模型有治療作用，能明顯降低關節炎大鼠病理變化[14]。還有文獻報道二妙散在共煎的過程中能促進有效成分的溶出，具有更強的抗氧化作用[15]，所以二妙散在臨床應用中具有廣闊的前景。但是，關于二妙散的急性毒性研究未見報道，本試驗根據最大給藥劑量法[16]，將通過灌胃給予小鼠二妙散水提液，評價二妙散的安全性，為二妙散的抗炎免疫調節機制研究及臨床應用提供基礎資料。

1 材料

1.1 動物

選用SPF級健康適齡昆明小鼠40只，體質量20～22 g，雌雄各半，購于安徽醫科大學動物實驗中心。實驗動物使用許可證號：SCXK(皖)2017—001。小鼠稱量體質量后隨機分籠飼養，飼養期間自由進食飲水，環境適宜。實驗前適應性飼養7 d。

1.2 藥物

1.2.1 二妙散水提液的制備

蒼術、黃柏中藥飲片購自于安徽省草藥制品有限公司(安徽省亳州市)。稱取蒼術、黃柏各200 g，加10倍水浸泡2 h，用武火煮沸后改用文火煎煮1.5 h。再分別以8倍水、6倍水先武后文煎煮1 h、0.5 h，合并3次濾液，濃縮至153 mL，最終生藥量為2.613g·mL-1(剛好能自由通過灌胃針頭的最大濃度)。密封分裝于4 ℃冰箱保存。

1.3 儀器設備及主要試劑

美菱醫用冷藏箱(YC-260L，中科美菱低溫科技股份有限公司)； 電子天平(mL104/02，梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；血液細胞分析儀(希森美康XT4000i);生化分析儀(貝克曼 AU5800)；D-37520低溫高速離心機(Thermo scientific，美國)；主要生化試劑購自美國貝克曼庫爾特有限公司。

2 方法

2.1 預試驗

二妙散水提液組給藥劑量為209.04 g·kg-1的小鼠給藥后死亡2只，給藥量為156.78 g·kg-1的小鼠死亡1只，給藥量為130.65 g·kg-1和104.52 g·kg-1的小鼠未見死亡。因為致死率未達70%，而且水提液的藥物濃度和給藥體積已經達到最大限度。根據毒理學和中藥藥理實驗技術指導，無法測出二妙散水提液的半數致死量(LD50)。因此我們對二妙散水提液進行最大耐受量試驗。

2.2 正式試驗

2.2.1 最大耐受量試驗

取SPF級昆明小鼠40只，雌雄各半。常規飼養一周后隨機分為二妙散水提液組和正常對照組并標記稱重，每組20只。在禁食不禁水12 h后，水提液組用最大灌胃濃度2.613 g·mL-1，最大灌胃體積0.25 mL·10 g-1給小鼠灌胃，正常對照組灌等量生理鹽水。每日2次，間隔8 h，第二次給藥前4 h繼續禁食不禁水，然后兩組進行常規飼養，連續觀察14 d。

2.2.2 指標觀察及檢測

在給藥后4 h內密切觀察小鼠的死亡情況，4 h穩定之后在試驗期間，每天上午和下午分別對小鼠進行觀察，并記錄試驗小鼠的行為活動、外觀變化、器官分泌物、大小便、精神狀態、呼吸狀態和死亡情況；記錄給藥前1天和給藥后第7天、14天的體質量變化；第14天觀察結束，禁食不禁水12 h后，摘除小鼠眼球取血，一部分放入抗凝管，用作血常規檢測。另一部分放入EP管中，靜置3 h后3 000 r·min-1離心15 min，取上清用作血液生化指標檢測；解剖小鼠，摘取心、肝、脾、肺、腎等主要臟器，先肉眼觀察有無大小、顏色改變，有無結節、腫瘤和壞死現象。再剔除多余的結締組織，稱重后用于計算主要臟器系數，臟器指數=臟器濕重/質量(mg·g-1)；然后將主要臟器用10%福爾馬林溶液固定，再用5% HNO3脫鈣，石蠟包埋、切片，進行HE染色，用光學顯微鏡觀察各臟器病理組織學變化。

2.3 統計學方法

本試驗用SPSS23.0進行統計學分析，在數據資料符合正態分布的情況下，采用均數±標準差表示，組間應用獨立樣本t檢驗統計分析，以P<0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 二妙散對小鼠一般生理狀態影響

觀察表明，水提液組在給藥2 h內小鼠精神萎靡，活動和攝食飲水減少。有稀便現象，且大便次數增加。兩組口、鼻、眼、耳、均未見異常分泌物。8 h后水提液組小鼠精神狀態恢復，活動增加，攝食飲水恢復正常。連續觀察14 d，給藥組小鼠行為活動、精神狀態、呼吸運動、攝食飲水、大小便等情況與正常對照組相比無明顯差異，并且觀察期間，水提液組和空白組均未見小鼠死亡。

3.2 對小鼠體質量變化的影響

試驗期間，分別記錄各組小鼠給藥前和給藥后第7天、14天的體質量。由表1可見水提液組在給藥后體質量正常增加，第7天和第14天后的體質量與正常對照組相比無顯著性差異(P>0.05)。

表1 二妙散水提液對小鼠體質量的影響

3.3 對小鼠血常規的影響

收集實驗小鼠的血液樣本進行血常規檢測，由表2可見水提液組的血小板(PLT)、血紅蛋白(HGB)、白細胞(WBC)、紅細胞(RBC)分別與正常對照組相比均差異無統計學意義(P>0.05)。

表2 二妙散水提液對小鼠血常規的影響

3.4 對小鼠血液生化指標的影響

收集實驗小鼠的血清，用全自動生化儀分析谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)的含量，如表3所示，水提液組小鼠血清中谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)的含量與正常對照組相比無顯著性差異(P>0.05)。

表3 二妙散水提液對小鼠血液生化指標的影響

3.5 對小鼠主要臟器系數的影響

解剖小鼠，摘取心、肝、脾、肺、腎等主要臟器，先肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎大小、顏色、有無明顯改變。再剔除多余的結締組織，稱重后計算臟器系數，比較各組間臟器系數的變化。由表4可見水提液組小鼠的心、肝、脾、肺、腎系數與正常對照組相比無顯著性差異(P>0.05)。

表4 二妙散水提液對小鼠臟器系數的影響

3.6 小鼠主要臟器病理組織學檢測

摘取試驗小鼠心、肝、脾、肺、腎等重要臟器，肉眼可觀察到主要臟器大小、顏色、結構均正常。病理組織學切片結果也表明水提液組與正常對照組相比均未見明顯病變。說明本試驗二妙散水提液對檢測小鼠主要臟器沒有造成急性損傷，見圖1。

注：A.心臟；B.肝臟；C.脾臟；D.肺臟；E.腎臟。圖1 小鼠主要臟器HE染色圖(×100)

4 討論

二妙散作為清熱燥濕藥的基礎名方，在臨床上對于關節炎、痛風等具有良好的治療作用。隨著現代醫學的發展，研究者從細胞水平以及分子生物學角度研究了二妙散對于抗炎免疫的可能作用機制。多種研究證據表明，二妙散以黃柏和蒼術1∶1為最佳比例,通過抑制IL-1β、TNF-α等炎癥因子的產生從而減輕炎癥的發生與發展，機體免疫調節的失衡都會導致炎癥因子的產生。雖然二妙散的藥用價值高，但中藥成分復雜，存在多種生物活性成分，其安全性和毒副作用也備受關注。急性毒性實驗是指在24 h內動物接受藥物1～2次，觀察給藥后7～14 d內動物所產生的急性中毒反應[17]。本實驗遵循《中藥新藥研制開發技術與方法》中“中藥、天然藥物急性毒性研究技術指導原則”設計了二妙散水提液的急性毒性試驗研究。

根據預試驗的結果顯示二妙散水提液給藥量大于130.65 g·kg-1時小鼠出現致死現象，這可能是由于藥物濃度過大導致，也提示我們藥物共煎過程中可能會產生復雜的化學反應從而會有“增毒、減毒”的作用。最大耐受量結果顯示，與正常組比，水提液組在給藥2 h內小鼠精神萎靡，活動和攝食飲水減少，出現大便稀薄的現象，且大便次數增加。這可能是由于高劑量的藥物對于胃腸道存在一定的刺激。兩組眼、耳、口、鼻均未見異常分泌物。8 h后水提液組小鼠精神狀態恢復，活動增加，攝食飲水恢復正常。連續觀察14 d，給藥組小鼠行為活動、精神狀態、呼吸運動、攝食飲水、大小便等情況與正常對照組相比無明顯差異。水提液組與正常組相比體質量均增加，且無顯著性差異(P>0.05)。與正常組相比，兩組給藥組臟器系數無顯著性差異(P>0.05)。進一步對主要臟器病理形態學進行觀察，結果顯示各組小鼠均未出現由受試藥物引起的中毒性的病理改變。血常規和血液生化指標也顯示各組間并無顯著性差異(P>0.05)。

綜上所述，通過二妙散水提液的最大耐受量試驗，對昆明小鼠的急性毒性結果顯示，試驗小鼠在給藥量為130.65 g·kg-1時各檢測指標均無顯著性差異，表明二妙散水提液最大耐受量為130.65 g·kg-1，在大于該劑量時會產生毒性作用。