地黃飲子對APP/PS1小鼠工作記憶及海馬超微結構影響的研究

李全，張健，王琪，周妍妍*

(1.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學基礎醫學院，黑龍江 哈爾濱 150040)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)即老年性癡呆，是一種以認知功能障礙進行性加重為臨床表現的退行性神經病[1-2]，其病理改變主要以β-淀粉樣蛋白(amyloid-β, Aβ)沉積、Tau蛋白過度磷酸化所導致的神經纖維纏結(neurofibrillary tangle，NFT)為特征[3]。中醫認為腎精虧虛、痰蒙腦竅是AD的基本病機，地黃飲子出自《黃帝素問·宣明論方》，有補腎、化痰、開竅之功用，現代臨床、實驗研究發現地黃飲子防治神經退行性疾病有著顯著的療效[4]。課題組前期實驗研究證實地黃飲子APP/PS1雙轉基因癡呆小鼠具有提高學習記憶能力、抑制氧化應激[5]及神經炎癥等作用[6]，為進一步探討地黃飲子對APP/PS1雙轉基因癡呆小鼠工作記憶及海馬超微結構的影響，故而進行了本次實驗研究。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

選取6月齡的雄性APP swe/PS1dE9雙轉基因癡呆小鼠60只，體質量(25±4)g，同月齡同背景的陰性小鼠30只，體質量(23±5)g，購自常州卡文斯實驗動物有限公司(江蘇)，編號：SCXK(蘇)2016-0010，于室溫(22±3)℃、相對濕度(45±5)%的SPF級實驗動物飼養室中適應性飼養，自由飲食、自由飲水。

1.2 實驗藥物

地黃飲子藥物組成：熟地黃、山茱萸、肉蓯蓉、石斛、麥冬、五味子、石菖蒲、遠志、茯苓、肉桂、炮附子和巴戟天各20 g，生姜、大棗、薄荷各5 g，由黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院提供，將上述飲片浸泡1 h、煎煮1 h后濾出藥液,再次加水煎煮1 h，將2次藥液混合分裝, 4 ℃冷藏備用。

1.3 主要實驗試劑及設備

多聚甲醛、戊二醛(北京雷根)；鹽酸戊巴比妥鈉(上海斯信)；甲苯胺藍(美國SIGMA)。Y迷宮、Su-P erMaze行為學測試軟件(上海欣軟)；透射電鏡(日本HITACHI)；倒置光學顯微鏡(日本NIKON)；超薄切片機(德國LEICA)。

2 實驗方法

2.1 動物分組及給藥

2.2 Y迷宮實驗

Y迷宮行為學測試于實驗第1、2、3個月地黃飲子或蒸餾水灌胃結束后進行。正式實驗開始前進行適應性訓練，將小鼠放入迷宮中央區任其自由活動8 min，每只小鼠活動結束后用75%消毒酒精噴撒宮臂以消除小鼠氣味，適應周期為1 d。正式實驗時，將小鼠頭部朝向起始臂末端擋板，將其放入起始臂自由探索8 min，同時記錄進臂總次數；計算小鼠正確自發交替率，小鼠身體完全進入宮臂記為有效進臂次數，每3次進入不同的宮臂則記為一次正確的自發交替，自發交替率=[正確進臂次數/(總進臂次數-2)]×100%，試驗周期為1 d[7]。

2.3 透射電鏡檢測

透射電鏡檢測于行為學實驗結束后進行，從各實驗月份的空白組、模型組、地黃組隨機選取3只小鼠，以1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，以4%多聚甲醛(pH=7.4)、生理鹽水心臟灌流至肝臟變為白色，斷頭取腦并依照腦立體定位圖譜剝離海馬后放入2.5%戊二醛中下固定2 h，將海馬組織樣本修飾成1 mm3小塊，丙酮梯度脫水、包埋、半薄切片處理后甲苯胺藍染色，倒置光鏡定位后制作超薄切片,經醋酸雙氧鈾、枸椽酸鉛雙染色[8]，透射電鏡1 200～4 000倍觀察小鼠海馬CA1區神經細胞超微結構并抓拍照片。

2.4 統計學分析

應用SPSS 23.0統計軟件將所得數據處理分析，數據結果以均數±標準誤表示，對實驗所得數據采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，P<0.05認為差異具有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 地黃飲子對APP/PS1小鼠自發交替率的影響

3.1.1 實驗第1個月地黃飲子對APP/PS1小鼠自發交替率的影響

實驗第1個月的各組小鼠進臂總次數無差異，不具有統計學意義(P>0.05)；與B1組相比，M1組小鼠正確自發交替率顯著降低，具有統計學意義(P<0.01)；與M1組相比，D1組小鼠正確自發交替率顯著提高，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 給藥1個月Y迷宮測試結果比較

3.1.2 實驗第2個月地黃飲子對APP/PS1小鼠自發交替率的影響

實驗第2個月的各組小鼠進臂總次數無明顯差異，不具有統計學意義(P>0.05)；與B2組相比，M2組小鼠正確自發交替率顯著降低，具有統計學意義(P<0.01)；與M2組相比，D2組小鼠正確自發交替率顯著提高，具有統計學意義(P<0.01)，見表2。

表2 給藥2個月Y迷宮測試結果比較

3.1.3 實驗第3個月地黃飲子對APP/PS1小鼠自發交替率的影響

應做到真正合理有效的利用現有的資源，結合水利信息工程建設自身的特點，有針對性地制訂與其相關的標準，逐步實現水利信息化建設的標準。

實驗第3個月的各組小鼠進臂總次數無明顯差異，不具有統計學意義(P>0.05)；與B3組相比，M3組小鼠正確自發交替率顯著降低，差異具有統計學意義(P<0.01)；與M3組相比，D3組小鼠正確自發交替率顯著提高，具有統計學意義(P<0.01)，見表3。

此外，M3組與M1組小鼠相比正確自發交替率顯著降低，具有統計學意義(P<0.01)，M3組與M2組小鼠相比正確自發交替率顯著降低，具有統計學意義(P<0.05)，而各給藥月份地黃組小鼠正確自發交替率無明顯差異，不具有統計學意義(P>0.05)。

表3 給藥3個月Y迷宮測試結果比較

3.2 地黃飲子對APP/PS1雙轉基因小鼠不同時期病理特征的影響

3.2.1 實驗1個月地黃飲子對APP/PS1小鼠病理特征的影響

鏡下觀察B1組小鼠海馬CA1區可見神經細胞數目較多、結構完整、分布密集，見圖1A。與B1組相比，M1組海馬CA1區神經細胞結構相對完整，但內質網減少且伴有不同程度的擴張，線粒體腫脹，線粒體嵴呈畸形樣改變，鏡下觀察細胞電子密度不均，散見少量的溶酶體與脂褐素，見圖1B。與M1組相比，D1組海馬CA1區神經細胞結構完整，線粒體輕度腫脹，結構相對完整，形態較為規則，見圖1C。

3.2.2 實驗2個月地黃飲子對APP/PS1小鼠病理特征的影響

至實驗第2個月，B2組小鼠海馬CA1區神經細胞器結構完整，見圖1D。M2組與B2組相比小鼠海馬CA1區神經元細胞染色質邊集，可見細胞凋亡現象，見圖1E。而地黃飲子組小鼠海馬CA1區神經細胞數量較多且分布密集，結構完整，可見少數脂褐素，見圖1F。

3.2.3 實驗3個月地黃飲子對APP/PS1小鼠病理特征的影響

至實驗第3個月，B3組小鼠海馬CA1區少數線粒體輕度腫脹，鏡下可見散在少量溶酶體，見圖1G。與B3組相比，M3組小鼠海馬CA1區神經細胞破裂、分散，細胞固化萎縮后可見凋亡小體，內質網減少且伴有不同程度的擴張，線粒體腫脹、破裂，溶酶體與脂褐素并見，見圖1H。而D3組小鼠CA1區線粒體形態結構規則，與空白組神經元細胞鏡下形態已較為接近，見圖1I。

圖1 各實驗月份各組小鼠海馬CA1區超微結構

4 討論

AD是一種起病隱匿并且呈進行性發展的神經系統退行性疾病，AD病在中醫上被歸為“癡呆”“呆癥”范疇，腎精虧虛，痰蒙腦竅是其基本病機，經典名方地黃飲子在方劑學中被歸為陰陽雙補之劑[9]，具有補腎、化痰、開竅之功效，符合AD的中醫發病機制，無論是古代醫家還是現代醫家運用地黃飲子防治老年性癡呆都有著顯著療效，故本實驗選用地黃飲子探討其對APP/PS1雙轉基因癡呆小鼠工作記憶及海馬超微結構的影響。

通過對Y迷宮實驗結果的分析發現，各實驗月份的各組小鼠的進臂總次數并無明顯差異(P>0.05)，說明小鼠視力及運動能力正常，排除體力及視力對小鼠探索迷宮的影響。隨著實驗月份的增加，模型組APP/PS1小鼠自發交替率逐漸降低，尤其是M3組與M1、M2組相比，APP/PS1小鼠工作記憶能力顯著降低；而經地黃飲子干預的APP/PS1小鼠自發交替率逐漸上升，這表明地黃飲子能夠提高APP/PS1小鼠的工作記憶能力，并且隨著給藥時間的增加呈逐漸上升的趨勢。

本課題組基于前期HE染色、尼氏染色、免疫熒光染色等實驗[10]，探討了光鏡下APP/PS1小鼠海馬區的病理改變，為進一步觀察APP/PS1小鼠海馬區的超微結構改變，本實驗采用了透射電鏡呈像技術。經透射電鏡鏡下觀察顯示，隨著實驗月份的增加，模型組小鼠海馬CA1區線粒體逐漸發生腫脹、變形、破裂，神經細胞出現凋亡現象，并隨著小鼠月齡的增加凋亡小體逐漸增多；而經地黃飲子干預的APP/PS1小鼠海馬CA1區線粒體只是輕度腫脹，同時神經細胞也未發生凋亡現象，并且隨著給藥時間的增加神經細胞形態結構已與空白組相接近。此外，本研究還發現在B3組小鼠海馬CA1區線粒體出現了輕度的腫脹、變形的改變，這表明即使是陰性空白組小鼠也會隨著月齡的增長線粒體結構出現改變，而地黃飲子能夠顯著保護神經細胞，抑制細胞的凋亡，改善線粒體形態結構，這與課題組既往研究[11]的地黃飲子含藥腦脊液可減輕細胞的受損程度，提高細胞活力，抑制細胞凋亡的實驗結果相符。

綜上，各實驗月份的各組小鼠的病理學改變與行為學改變相一致，APP/PS1小鼠隨著月齡增加工作記憶能力呈進行性下降，線粒體發生腫脹變形，并且至小鼠9月齡時出現大量的凋亡小體；地黃飲子可改善APP/PS1小鼠隨月齡增長而下降的工作記憶能力，并抑制神經細胞凋亡，改善線粒體形態結構。