水質細菌總數FISH 檢測技術的優化

汪 河，王 莉*，申慧彥，李衛華

（1.安徽建筑大學 環境與能源工程學院，安徽 合肥 230601；2.環境污染控制與廢棄物資源化利用安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230601）

水質衛生檢測的標準方法，國內外主要采用培養計數法[1]。這種方法雖具有易于標準化，結果可比性強的優點，但缺點也顯而易見——耗時長（十幾小時到幾天不等），不能同時檢測多種項目，且檢測出的微生物數量由于培養手段的限制遠遠低于實際數量[2-3]。鑒于此，一系列快速檢測方法如高光譜技術[4]、ATP 生物發光技術[5]、流式細胞計數法[6]和MTT 法[7]等不斷開發出來。而分子生物學領域出現的熒光定量PCR 法[8]、原位雜交法[9]、熒光原位雜交法[10]等方法，則不僅實現了同時檢測多種微生物指標的設想，而且大大突破了環境微生物數量的檢測限度。

熒光原位雜交（Fluorescence In Situ Hybridization，FISH）是20 世紀80 年代初期在原有的放射性原位雜交技術的基礎上發展起來的一種非放射性原位雜交技術[9]。其原理是把非放射性的熒光信號基團標記在特異性堿基序列的核酸探針上，再用帶有熒光標記的探針與固定在玻片或濾膜上的細胞中特定的核苷酸序列進行雜交，然后在熒光顯微鏡下對熒光信號進行辨別和攝像。目前，FISH 技術已廣泛應用于淡水、海洋、土壤和活性污泥的微生物數分布、豐度以及整個微生物群落組成、結構、多樣性的觀察[11-14]。然而，在水質衛生檢測方面卻鮮少見報道。限制FISH 技術應用的原因，很可能是因為該技術對實驗條件要求高，雜質干擾、酶解條件不適、雜交條件不適、清洗脫落、熒光淬滅等都可能影響實驗結果的穩定性[15-16]。本研究以水質細菌總數為主要觀察指標，對FISH 技術的樣品固定和雜交環節進行優化，旨在為FISH 技術日后在水質衛生檢測的成熟應用奠定一定的技術基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

主要儀器：凈化工作臺（蘇州凈化SW-CJ-2D）；恒溫干燥箱（上海陽光202-5SA）；恒溫生化培養箱。

蛋白酶K 緩沖液（50 mL）：1 mol/L Tris-HCl（pH7.2）0.5 mL，0.5 mol/L EDTA 1 mL，5 mol/L NaCL 1 mL，10% SDS2.5 mL，20 mg/mL 蛋 白 酶K25 μL，44.98 mL ddH2O。

雜 交 緩 沖 液（2 mL）：5 mol/L NaCL360 μL，1 mol/L Tris-HCl（pH7.2）40 μL，10% SDS 2 μL，甲酰胺800 μL，798 μL d H2O。

洗脫液（50 mL）：5 mol/L NaCL 560 μL，1 mol/L Tris-HCl（pH7.2）1 mL，0.5 mol/L EDTA 500 μL，10% SDS 50 μL，47.89 mL d H2O。

1.2 樣品的采集與固定

樣品采集于安徽建筑大學校園內湖水。取水樣1 000 mL 0.45 μm 濾膜過濾，5 mL 0.2 mol/L PBS（pH 7.2，滅菌）下清洗細菌。取0.5 mL 清洗水樣加入0.5 mL 的冷凍乙醇固定，搖勻至-20 ℃保存。

1.3 FISH 過程及優化

實驗中使用的探針為針對所有真細菌的EUB338-mix（5’-GCWGCCWCCCGTAGGWGT-3’）[17]，探針在5’末端用氨甲香豆素乙酸（AMAC）染料標記。FISH 基本操作按Nielsen[18]等人的方法：將10 μL 固定過的水樣置于預先用0.1 mg/mL 多聚賴氨酸包埋的載玻片上，樣品均勻攤開后干燥制片；蛋白酶K 緩沖液處理，滅菌水清洗；載玻片依次在50%、80%和100%（V/V%）的乙醇溶液中各脫水3 min，風干；雜交緩沖液和EUB338-mix 探針混合后加至載玻片覆蓋樣品區域，載玻片放入濕盒置于恒溫生化培養箱在46 ℃雜交；48 ℃洗脫液中浸洗20 min；滅菌水清洗，風干備檢。

在以下幾個方面對FISH 過程進行優化：自然干燥5 h 和46 ℃烘烤制片（2 h、5 h）；蛋白酶K 消化時間（2 min、5 min、10 min）；探針終濃度（2.5 ng/μL、5 ng/μL、10 ng/μL）；雜 交 時 間（2 h、5 h、10 h）。

1.4 鏡檢和計數

樣品通過熒光顯微鏡觀察，AMAC 標記的FISH 信號通過紫外激發模塊觀察。所有數碼照片都在40×的物鏡下拍攝。每個FISH 條件樣品準備3張雜化載玻片，每張載玻片隨機拍攝20張照片。每張照片中發熒光的細胞數通過Image-Pro Plus 6.0 中的手動計數功能計數。

2 結果與分析

2.1 制片方式對細菌數量的影響

制片方式對細菌細胞數量的影響實驗，截止在雜交步驟前。由材料與方法1.3 可知，FISH 過程的蛋白酶K 消化和雜交后洗滌環節都需要清洗，而清洗或多或少會引起粘附在載玻片上的細胞掉片。有效增加細胞粘附力的做法通常是用明膠、多聚賴氨酸等粘附劑預先包埋載玻片[11-14]。除此之外，有人發現將粘附有樣品的載玻片37-60 ℃適當烘烤也能一定程度地減少細胞掉片[12-13，19]。本實驗觀察了自然干燥制片和46 ℃2 h、5 h）烘烤制片對載玻片細胞粘附力的影響。圖1 可見，和自然干燥組（a）相比，46 ℃烘烤對增加載玻片細胞粘力有一定的促進作用，（b）和（c）細胞數量明顯多于（a）。但烘烤時間延長至5 h 并不能明顯減少洗滌過程中的細胞流失，（b）和（c）細胞數量無明顯差異。因此下面實驗制片采用46 ℃ 2 h 烤片。

圖1 不同制片方式下的細菌數量圖片

2.2 蛋白酶K 消化時間對雜交結果的影響

蛋白酶K 消化在FISH 中具有消化包圍靶DNA 蛋白質的作用，以增加探針與靶核酸結合的機會，提高雜交信號。但蛋白酶K 的濃度過高、消化時間過長或孵育溫度過高時，都會對細胞結構有一定的破壞，影響細胞的完整性或導致細胞脫落，從而影響雜交結果。根據前人的經驗[13，16，20]，終濃度10 μg/mL 溫度37 ℃分別是FISH 檢測中消化細菌靶DNA 蛋白質較佳的濃度和溫度條件，而消化時間則需要根據樣品去實際摸索。

由圖2 和表1 可知，水中細菌總數的FISH 檢測應設蛋白酶K 消化環節，和未用蛋白酶K 消化組（26±0.83）比，其他各組的熒光細胞數（＞ 70）均明顯增加（和0 min 組相比，2 min 和5 min 組均P＜0.001，10 min 組P＜0.05）。蛋白酶K 消化時間控制在5 min 內較合適，繼續消化會大大減少熒光信號。2 min（b）和5 min（c）消化組熒光信號數（128±5.66 和135±3.27）沒有明顯差異（P＞0.05），而當溫度延長至10 min（d）時，熒光信號數量大大減少（72±1.62）（和5 min 組相比，P＜0.01）。下面的實驗蛋白酶K 消化時間統一采用2 min。

表1 不同蛋白酶K 消化時間下的熒光細胞數量

2.3 探針終濃度對雜交結果的影響

FISH 檢測中，一般來說，探針濃度越大，雜交率會越高。但探針濃度過高會造成背景染色過高，探針濃度過低又會導致熒光信號的不足。根據國內外多數研究人員[12-14，18，21]的經驗，當探針終濃度為5 ng/μL 左右時，FISH 檢測可以得到較佳的信噪比，我們的實驗證實了相關研究的結果，圖3 顯示，隨探針濃度增加，雜交信號越高。表1 可見，當探針濃度從2.5 ng/μL 增加至10 ng/μL 時，樣品的熒光細胞數量也從61 ± 2.12 增加至232 ± 11.02（和2.5 ng/μL 組 相 比，5 ng/μL 組P ＜ 0.01，10 ng/μL 組P ＜ 0.001）。但需要注意的是，10 ng/μL 下的雜交背景稍高，因此，下面的實驗探針雜交終濃度采用5 ng/μL。

圖3 不同探針濃度下的細菌FISH 圖片

表2 不同探針濃度下的熒光細胞數量

2.4 雜交時間對雜交結果的影響

雜交時間對雜交也有較大的影響。時間過短會造成雜交不完全，而過長則會增加非特異性雜交。據前人的經驗表明，雜交時間因探針及樣品的不同而不同，有的探針時間短至1-2 h[11，14，22]，有的探針需長至6 h 甚至過夜[20，23]。一般認為，寡核苷酸探針可在6 h 以內和目標細胞完成雜交[11，14，16，22]。圖4 和表1 表明，5 h 是本實驗比較合適的雜交時間，此時，寡核苷酸探針EUB338-mix 能與細菌細胞充分地結合。和5 h 相比，2 h 顯然雜交尚未完成，熒光信號相對較低（5 h 250±13.83；2 h 158±8.51）（兩組相比，P＜0.01）。而當時間延長至10 h，熒光信號并未明顯提高（10 h 273±16.69）（和5 h 組相比，P＞0.05）。

圖4 不同雜交時間下的總細菌FISH 圖片

表3 不同雜交時間下的熒光細胞數量

2.5 條件優化后的FISH 定量結果比較

表4 顯示了優化條件下（46 ℃ 2 h 制片，蛋白酶K 消化時間2 min，探針濃度5 ng/μL，46 ℃雜交5 h）的三次FISH 檢測結果。顯然，三次實驗檢測出的熒光細胞數量無明顯差異（P＞0.05），分別為267±10.19、253±5.62 和272±16.07?？梢?，優化后的FISH 技術檢測結果具有較高的穩定性，提示將FISH 檢測技術應用于水的衛生檢測是可行的。

表4 優化條件下的FISH 實驗定量結果

3 結論

本研究主要針對FISH 在水質衛生檢測中結果穩定性差的問題，在細胞制片、蛋白酶K 消化時間、探針雜交濃度和雜交時間四個方面對FISH 技術進行優化，得到如下結果：

（1）細胞制片烘烤比自然干燥好，適度烘烤可一定程度減少FISH 過程因洗滌造成的細菌細胞流失，46 ℃ 2 h 烘烤的合適條件。

（2）水質細菌總數的FISH 檢測應設蛋白酶K消化環節，終濃度10 μg/mL 的蛋白酶K 37 ℃作用細菌細胞2 min，可得到較佳的信噪比。

（3）探針終濃度5 ng/μL，46 ℃ 5 h，可使寡核苷酸探針EUB338-mix 與細菌細胞充分地結合。

（4）條件優化后的FISH 定量結果穩定性較好，優化條件下FISH 技術三次檢測的熒光細胞數量無明顯差異。本研究結果為FISH 法日后在水質衛生檢測的成熟應用奠定了一定的技術基礎。