草本組方對γ 射線全身照射小鼠的保護作用

付海英 吳國忠

（中國科學院上海應用物理研究所 上海 201800）

根據世界衛生組織國際癌癥研究機構發布的數據，2019 年和2020 年我國的癌癥新發病例為393 萬和456 萬例［1］，這表明每天有超過1 萬人確診為癌癥，除了常規的手術及化學治療，約70%的患者接受放射治療。這是由于放療適應范圍性廣、治療簡便，約有40%的實體腫瘤可以用放療根治［2］，因此放射治療逐步成為治療惡性腫瘤的主要手段之一。但是放射治療是利用α、β、γ射線和各類X射線治療機或加速器產生的X射線、電子線、質子束及其他粒子束對腫瘤進行局部治療?；颊咴诜派渲委煏r，臨床上根據不同腫瘤的放射敏感性，確定患者接受放療時的總劑量，如淋巴類腫瘤、腎母細胞瘤患者放療的劑量為20～40 Gy，而大多數鱗癌、腦瘤患者的劑量約為60 Gy，單次放射性治療的劑量為1～4 Gy［3‐4］。另外，利用X射線、超聲和核素的γ射線等對病理變化進行判斷的放射診斷已在醫學影像領域被廣泛應用，如CT具有密度分辨率高、可連續掃描等優點而被患者接受，但一次胸部CT，患者接受輻射當量劑量約2 mSv。不同組織器官和細胞對輻射表現出不同的敏感性，從而產生不同的輻射生物學效應。放射治療或診斷時除了患病部位，正常的組織器官也會或多或少受到電離輻射照射，引起不同程度的副作用，影響患者的治療效果和生活質量［5］。

輻射損傷的主要危害是對造血及血液系統的損傷［3］。機體受到輻射損傷后，對骨髓細胞的增殖產生抑制作用，造成細胞內生物大分子的劇烈分解，從而使某些造血細胞產生壞死，結果會降低骨髓的造血功能，出現造血系統的功能下降，同時也對血液系統的功能產生損害，使得如紅細胞、白細胞、以及血小板等的數量出現不同程度的減少，最終導致各種并發癥，如出血、感染、貧血等，對人體造成比較嚴重的損害。輻射損傷也會對機體免疫系統有損傷作用，出現免疫力低下現象。同時輻射損傷會產生過量的自由基，導致人體的生物防御系統遭受破壞。輻射防護劑首先在體外實驗中被發現［3］，近幾十年的發展，已經從最初的氨巰基類和色氨酸類防護劑，發展到毒性小的黃酮、多糖類合成藥和天然中草藥［6‐7］。前者可在機體受照射前短時間內給藥有效，照射后給藥無效，其毒副作用較大、有效時間短、有效劑量窄、口服效果不好。近年來，美國［5，8］、韓國［9‐10］、印度［11‐12］和中國［13‐15］等國家的科研工作者在此領域開展了大量研究，從人工合成氨磷汀、超氧化物歧化酶類藥物逐漸過渡到從可食資源中提取維生素、黃酮類天然提取物。

天然草本提取物存在廣泛，容易獲取，且具有較強的抗氧化生物活性，又沒有明顯的毒副作用，近年來已逐漸成為各國研究篩選天然抗輻射防 護 劑 的 熱 點［5，16］。研 究 表 明：黃 芪［17‐18］、當歸［4，19］、肉蓯蓉［20‐21］、白芍［22］等草本提取物含有的黃酮、苯乙醇苷、多糖等活性成分具有較強的抗氧化功效，能有效防護電離輻射造成的造血系統、血液系統、抗氧化系統及免疫系統損傷。由于單一組分天然提取物的水溶性差，單一使用時用量大。日本Aizawa等［23］利用蘆丁、橙皮素、柚皮素等多種物質制備了復合防護劑，與單一組分相比，復合防護劑能更好地清除體內氧化性自由基，并修復X 射線照射后的造血功能。韓國Kim等［22］開發了白芍、川芎、當歸等提取物作為輻射防護劑，研究了對小鼠經單次輻射3 Gy 或多次輻射7 Gy 后的喂養情況，系統比較了小鼠的免疫功能、造血機能變化，獲得了一種能促進抗癌，提高免疫力和造血功能，保護機體免于氧化損傷的草本復合物，基于該專利的產品，Hemo Him已商業化，為腫瘤患者放射性治療時輔助使用。

本實驗研究C57BL/6 成年小鼠在受到輻射損傷（一次性全身照射4 Gy）后，利用黃芪、當歸、肉蓯蓉、槐米、白芍等提取物制備草本組方進行灌胃干預，同時以市場上購買的Hemo Him產品作為對照組（Hemo‐1#）進行對比，比較不同配方草本組方對小鼠造血功能的修復，評價其防輻射功效，為進一步研發天然輻射防護劑提供依據。

1 材料與方法

1.1 儀器

60Co γ 射線輻射源，中國科學院上海應用物理研究所，劑量率0.067 Gy/min；全自動動物血液細胞分析儀，BC‐2800Vet，深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司；電子天平，ML503/02，梅特勒‐托利多儀器（上海）有限公司，精度1 mg；真空干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司。

1.2 材料

草本提取物均由陜西省某科技發展有限公司提供。黃芪提取物，棕褐色粉末；槐米提取物，黃色粉末，含曲克蘆丁98%；阿拉善肉蓯蓉提取物，黑色純粉；當歸提取物，黃褐色粉末；白芍提取物，黃褐色粉末。

1.3 藥品配制

粉末樣品用自封袋密封后，經60Co γ射線照射4 kGy滅菌后，樣品保存于真空干燥箱內。草本組方的制備：經照射后的各提取物分別加入一定量的去離子水，于50°C的熱水浴中超聲震蕩2 h，過濾除去不溶物。按等比例配置成質量分數均為12%的混合物樣品Exp‐2#和Exp‐3#，其中Exp‐2#為當歸、白芍、肉蓯蓉、槐米的草本混合物；Exp‐3#為當歸、白芍、肉蓯蓉、槐米、黃芪的草本混合物。對照組Hemo‐1#直接使用商業產品Hemo Him。

2 動物

小鼠品系：C57BL/6，周齡：6～8 周，性別：雌雄各半，體重：（20±2）g，來源：菲諾克生物科技（上海）有限公司。實驗環境溫度為（22±2）°C，相對濕度為（50±10）%。動物實驗在菲諾克生物科技（上海）有限公司完成。

2.1 分組與處理

56只成年小鼠，隨機分為4組，每組雌雄性小鼠各7 只：照射空白組（Blank）、1 組市售產品對照組（Hemo‐1#）、2組不同配方實驗組（Exp‐2#和Exp‐3#）。除照射空白組的小鼠給予200 μL的蒸餾水灌胃處理外，其余三組照射前3 d開始給藥，每天灌胃劑量均為200 μL，照射當天不給藥；照射后，繼續給藥21 d。連續喂養3 d 后，4 組小鼠用60Co γ 射線全身一次性照射，吸收劑量率0.067 Gy/min，總吸收劑量4 Gy。

2.2 小鼠體重的變化

觀察指標。（1）整體狀況：每天密切觀察各組小鼠的外觀皮毛、活動情況、攝食變化、體型及精神狀態變化。（2）體質量：每只小鼠每天灌胃前稱量并記錄體重，以各組平均體重為縱坐標，稱重天數為橫坐標，繪制體重變化曲線，觀察灌胃給藥對小鼠體重的影響。

2.3 外周血象分析

小鼠照射后第1 天，于灌胃后1 h，眼球采血30 μL左右，吸入肝素抗凝管，采用自動血球分析儀測外周血白細胞和淋巴細胞數量，各組分別于照射后第4、7、14 和21 天再測全血白細胞（WBC）、紅細胞（RBC）、血紅蛋白（HGB）、血小板（PLT）和淋巴細胞（Lymph）計數。

2.4 統計學處理

采用SPSS（Version 17.0）軟件對數據進行統計分析，結果以平均值±標準方差（means±SD）表示，組間差異采用t檢驗。以顯著性差異p＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果與討論

3.1 體重變化

照射前3 d 開始對Hemo‐1#、Exp‐2#和Exp‐3#組小鼠給藥，觀察到小鼠出現軟便，體重為（23.3±0.8）g，保持不變，活動正常。照射后第4天，小鼠軟便消失，說明小鼠對草本混取物適應性為7 d左右。

γ射線照射后小鼠體重變化曲線見圖1。由圖1可知，受照射后小鼠的體重均下降，Exp‐3#組小鼠體重變化最為明顯，到第4天體重下降到最低，約降低10%。實驗過程中，Hemo‐1#組小鼠體重變化趨勢與Blank組最為接近，變化幅度小，體重增長比較平穩，而兩個配方Exp‐2#和Exp‐3#組的小鼠體重變化均起伏較大。照射后第14天，4組小鼠的體重均趨于穩定。實驗中喂養草本組方對小鼠體重的促進效果并不明顯，可能與小鼠對藥物的適應性有關。

圖1 草本組方對照射小鼠體重變化Fig.1 Changes of the body weight after γ‐ray irradiation

3.2 白細胞和淋巴細胞計數

白細胞作為機體免疫調節和免疫效應細胞，對輻射有極高的敏感性，極易受到輻射的影響而發生DNA 的斷裂，細胞形態和功能以及細胞數量改變，因而白細胞計數已被用來作為輻射損傷程度的評估指標。

未受到照射的正常8周齡C57BL/6小鼠的白細胞計數為（4.8±0.6）×109L-1，而照射空白組照射后第1 天，外周血白細胞計數為（1.0±0.1）×109L-1，表明照射后小鼠白細胞數量急劇下降，約為正常小鼠白細胞數量的20.8%。給藥的3 組小鼠白細胞數量較正常小鼠也下降，但均高于照射空白組。照射后第4 天，Hemo‐1#組的白細胞數量平穩上升，而實驗的兩組Exp‐2#和Exp‐3#起伏較大。

圖2（b）中淋巴細胞與白細胞趨勢一致，小鼠經4 Gy 照射后第1 天，外周淋巴細胞受到嚴重損傷，數量急劇下降。給藥的Hemo‐1#、Exp‐2#和Exp‐3#組淋巴細胞數量有所降低，但均高于Blank組。而照射后第4天，兩實驗組無論白細胞還是淋巴細胞計數都出現急劇下降，推測小鼠對草本組方存在4～7 d的適應性。到第7天，均逐步恢復。

圖2 草本組方對照射小鼠白細胞計數(a)和淋巴細胞計數(b)的影響Fig.2 Effects of herb formulas on the leukocyte counts(a)and lymph counts(b)for mice irradiated

3.3 血小板計數

血小板在止血和凝血過程中起重要作用，當血管受損傷或破裂時，血小板受刺激，由靜止相變為機能相，迅即發生變形，表面黏度增大，凝聚成團；同時，在表面第Ⅲ因子的作用下，使血漿內的凝血酶原變為凝血酶，后者又催化纖維蛋白原變成絲狀的纖維蛋白，與血細胞共同形成凝血塊止血，血小板顆粒物的釋放則進一步促進止血和凝血。

血小板壽命為10 d 左右，未受到輻射損傷的成熟巨核細胞可生成血小板。圖3顯示外周血中血小板在照后緩慢下降，照射后第7天最為明顯，但均在正常范圍，此后逐步恢復。

圖3 草本組方對照射小鼠血小板計數的影響Fig.3 Effects of herb formulas on the PLT counts for mice irradiated

3.4 紅細胞及血紅蛋白含量

動物造血系統對電離輻射極為敏感，一定劑量射線作用后，可引起外周血象及各類血細胞不同程度的變化。一般認為，射線對成熟血細胞的直接殺傷效應不大，但可導致幼稚造血細胞數量急劇減少，增殖功能明顯下降，結果外周血中成熟血細胞來源匱乏，加上死亡加速，導致全血細胞減少。事實上，造血系統的損傷是輻射對機體最直接、最典型的生物學效應表現。

成熟紅細胞的壽命是120 d，每天以1%的速度更新，所以照射后早期紅細胞和血紅蛋白的變化不大，隨后逐漸減少；照射處理后第4天小鼠外周血的血紅蛋白顯著減少，且持續在較低的含量。

照射后第1 天及照射后第14 天，血紅蛋白的含量出現異常（圖4（b）），超出小鼠血紅蛋白正常范圍110～143 g/L，可能是因為全身照射4 Gy 的劑量對小鼠的心肺等臟器造成較嚴重的損傷。

圖4 草本組方對照射小鼠紅細胞(a)和血紅蛋白(b)含量的影響Fig.4 Effects of herb formulas on the RBC(a)and HGB(b)level for irradiated mice

進一步比較γ射線照射后，利用草本組方持續喂養21 d，小鼠體重及血象指標如表1所示?？梢钥闯?，照射后第1天，小鼠白細胞、淋巴細胞、紅細胞、血小板計數和血紅蛋白含量的下降說明電離輻射引起了小鼠造血機能損傷，給藥對照組Hemo‐1#、Exp‐2#和Exp‐3#可不同程度減緩照射小鼠白細胞、淋巴細胞的下降幅度。持續喂養21 d后，4 組小鼠血象指標白細胞、淋巴細胞、紅細胞、血小板計數和血紅蛋白含量均趨于正常。同時研究過程中也觀察到血紅蛋白含量超出正常范圍，推測4 Gy 的劑量導致小鼠臟器部分受損，一次劑量對小鼠損傷的影響有待進一步研究。

表1 草本組方對照射后小鼠血常規指標Table 1 Changes of conventional indicators of peripheral blood after γ-ray irradiation (n=14）

4 結論

本研究采用黃芪、當歸、白芍、肉蓯蓉等天然提取物配置草本組方，應用于γ射線全身照射的小鼠，觀察其對照射前后小鼠體重、血象的影響，結果表明：4 Gy γ射線照射成年小鼠，導致小鼠白細胞、淋巴細胞、紅細胞、血小板和血紅蛋白含量的下降，說明電離輻射引起了小鼠造血機能的損傷，給藥后逐步恢復：照射后第7 天，白細胞、紅細胞和淋巴細胞恢復正常。兩給藥組與市售產品Hemo‐1#比較，對小鼠體重影響、血象指標的恢復基本相當，但與Blank 組相比，差異均不顯著。實驗配方組Exp‐2#與Exp‐3#相比，照射后小鼠體重穩定增長，Exp‐3#組出現波動起伏大，Exp‐2#組血象指標數值也略優于Exp‐3#組。綜合考慮，該草本組方含有多種提取物，其活性成分多，具有一定的輻射保護效果。但本研究僅選擇韓國商業產品Hemo Him作對比，獲得了相近的結果，后續需在組方活性成分、吸收劑量、受照射后骨髓干細胞、DNA 氧化性損傷等方面開展更為系統的研究，為多方位評價草本組方的應用提供依據。

作者貢獻說明 付海英是本研究工作的實驗執行人，完成數據采集與分析，論文初稿的寫作，參與實驗設計和結果分析；吳國忠是項目的構思者及負責人，指導實驗設計、論文寫作與修改。二位作者都閱讀并同意最終的文本。