香葉木苷對異丙腎上腺素誘導的大鼠心臟功能紊亂和氧化應激的影響及其分子機制

耿棟棟 蘇淑紅 杜慧清 王志方

1 新鄉醫學院，河南 新鄉 453000；2新鄉市中心醫院 特需病房，河南 新鄉 453000；3新鄉市中心醫院 急診科，河南 新鄉 453000；4新鄉市中心醫院 心血管內科三病區，河南 新鄉453000

根據世界衛生組織的報告，全世界每年有1 200萬人死于心肌損傷。盡管過去幾十年來通過藥物和機械干預在心肌損傷的治療方面取得了進展，但心肌損傷仍是死亡的主要原因。已經確定，損傷程度的限制是減少心肌損傷后果的一個重要因素[1]。心肌缺血和心肌缺血再灌注后，活性氧的產生增加。研究[2]表明，活性氧在心肌損傷的發展中起關鍵作用。異丙腎上腺素通過誘導氧化應激、心肌損傷和心肌細胞能量儲備的耗竭，引起復雜的生化和結構變化，導致細胞損傷和壞死[3]。香葉木苷是一種不飽和黃酮，主要存在于牛膝草和迷迭香中[4]。香葉木苷具有抗炎、抗氧化和抗誘變的特性[5]。本研究通過建立異丙腎上腺素誘導心肌損傷模型，探索香葉木苷對異丙腎上腺素誘導的大鼠心臟功能紊亂和氧化應激的作用，以期為香葉木苷應用于心肌損傷的防治提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

選用45只SPF級健康成年雄性大鼠。鼠齡6～7個月，體質量150～200 g，飼養于新鄉醫學院實驗動物中心。隨機分為5組，分別為對照組(n=9)、異丙腎上腺素組(n=9)、香葉木苷低劑量組(n=9)、香葉木苷中劑量組(n=9)、香葉木苷高劑量組(n=9)。本研究通過我院醫學倫理委員會批準。

1.2 主要儀器

Varioskan Flash 多功能酶標儀(美國Thermo Fisher公司)；AMA440N 高壓滅菌鍋(英國Astell公司)；高速低溫離心機(美國Beckman公司)；OLYMPUS DP71顯微鏡(日本奧林巴斯光學有限公司)；電泳槽，電轉儀(美國Bio-Rad公司)；ABI StepOnePlus TM 熒光定量PCR儀(美國基因儀器公司)；凝膠成像系統GDS-800 UVP(美國UVP公司)。

1.3 藥品與試劑

香葉木苷和異丙腎上腺素(美國Sigma公司)；Bax，Bcl-2，Caspase-3，Survivin，Nrf2，PGC-1α，TFAM，Ki67抗體(美國NEB公司)；HRP標記的山羊抗小鼠二抗(美國Santa Cruz公司)；蛋白Marker，Fermentas；EDTA 緩沖液(p H8.0)(武漢百耐特化工有限公司)；PrimeScriptTMRT reagent Kit (TaKaRa(DRR037S))；SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNase H Plus，TaKaRa(DRR420A))；ECL 發光試劑盒，RIPA強裂解液(碧云天)；PVDF膜(谷歌生物)；大鼠CK、CKMB、c TnI ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；大鼠SOD，MDA，LDH 試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.4 動物模型建立與藥物干預

將異丙腎上腺素溶于生理鹽水中，每隔24 h皮下注射(100 mg/kg·d)大鼠，誘導實驗性心肌梗死[6]。香葉木苷低、中、高劑量組大鼠分別用5、10、20 mg/kg劑量的香葉木苷口服給藥。每天給藥1次。連續給藥10周后處死小鼠，取心臟組織進行相關研究。

1.5 實驗方法

1.5.1 心臟功能指標

每組大鼠治療10周后，檢測心率(HR)，記錄心電圖T 波變化，并通過BL-420F生物機能實驗系統記錄LVSP水平和LVEF水平。

1.5.2 ELISA 法測定外周血中心損標記物CK、CKMB、c TnI的含量

每組大鼠治療10周后，取大鼠外周血，分離出血清。采用ELISA 法測定大鼠血清CK、CKMB、c TnI的含量。操作步驟嚴格按照大鼠CK、CKMB、c TnI ELISA 試劑盒說明書進行。

1.5.3 HE染色

每組大鼠治療10周后，麻醉處死大鼠取部分心臟組織放入4%多聚甲醛溶液進行固定，24 h后脫水，石蠟包埋、切片；然后HE染色:將切片分別置于二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ，以及體積分數為100%、95%、90%、80%、70%的酒精各10 min，自來水沖洗；蘇木精染色、伊紅染色；由低到高濃度酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片；光學顯微鏡拍照，觀察其形態特征。

1.5.4 免疫組化分析

采用鏈霉親和素-生物素-復合過氧化物酶試劑盒對腫瘤組織中Ki67進行免疫組織化學染色。最后，將載玻片沖洗、脫水并安裝在顯微鏡下檢查和計數免疫反應細胞(黃色到棕色)。在與奧林巴斯顯微鏡相連接的Image-Pro Plus圖像分析系統上對異種移植物的免疫染色進行分析。在400×放大倍數下，通過計算黃色到棕色細胞和5個隨機選擇的視野中的細胞總數來定量Ki67染色呈陽性的細胞。

1.5.5 試劑盒檢測MDA、SOD、LDH 的含量

每組大鼠治療10周后，麻醉處死大鼠，取心肌組織，提取心肌細胞上清。分別采用SOD、MDA、LDH 試劑盒測定心肌細胞上清液SOD、MDA、LDH、GSH 的含量。操作步驟嚴格按照大鼠SOD、MDA、LDH、GSH 試劑盒說明書進行。

1.5.6 免疫印跡法

使用裂解緩沖液(Beyotime，Shanghai，China)裂解細胞樣品。然后，使用BCA 蛋白質測定試劑盒(Beyotime)定量蛋白質濃度。含有20 mg蛋白質的樣品在體積分數為10%的SDS-PAGE 中分離，然后轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用體積分數為5%的脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h，隨后加入一抗(Bax，1∶1 000；Bcl-2，1∶1 000；Caspase-3，1∶1 000；Survivin，1∶1 000；Nrf，1∶1 000；PGC-1α，1∶1 000；TFAM，1∶1 000于4 ℃封閉過夜，第2天加入對應二抗室溫封閉1 h，最后滴加ECL，設置曝光參數，檢測目的條帶對應化學發光強弱。

1.6 統計學方法

采用SPSS 21.0統計軟件進行數據分析，數據以表示。采用單因素方差分析，若方差齊則兩組間比較用LSD 法，若方差不齊則兩組間比較用Dunnett's法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 香葉木苷保護異丙腎上腺素誘導心肌損傷大鼠的心臟功能

如表1所示:與對照組比較，異丙腎上腺素組HR、LVSP和LVEF 均顯著降低(P＜0.05)；與異丙腎上腺素組比較，香葉木苷中、高劑量組HR、LVSP和LVEF均顯著升高(P＜0.05)。

表1 不同組心臟功能指標檢測

2.2 香葉木苷降低血清中CK、CKMB、cTnI的含量

如表2所示:與對照組比較，異丙腎上腺素組大鼠血清中CK、CKMB、c TnI含量均顯著升高(P＜0.05)；與異丙腎上腺素組比較，香葉木苷中、高劑量組大鼠血清中CK、CKMB、c TnI含量均顯著降低(P＜0.05)。

表2 不同組血清中CK、CKMB、cTnI的含量

2.2 香葉木苷緩解異丙腎上腺素誘導的心肌損傷

如圖1所示:對照組心肌細胞邊緣清晰，核膜完整，心肌纖維排列整齊，無細胞間物質水腫；異丙腎上腺素組心肌細胞出現腫脹，明顯的細胞間物質水腫，界限模糊，有少量交叉條紋；中、高劑量香葉木苷分別處理后，細胞間水腫減輕，心肌損傷介于異丙腎上腺素組和對照組之間。

圖1 不同組大鼠心肌組織病理學變化

2.3 香葉木苷促進心肌細胞中Ki67的表達

如圖2所示，對照組心肌細胞內可見大量棕黃色顆粒，與對照組比較，異丙腎上腺素組僅見少量棕黃色顆粒。依次用低、中、高劑量的香葉木苷處理后，心肌細胞內棕黃色顆粒依次增多。如圖3所示，對照組、異丙腎上腺素組、香葉木苷低劑量組、香葉木苷中劑量組和香葉木苷高劑量組心肌細胞中Ki67陽性細胞分別為(58.45±5.21)%、(5.98±1.43)%、(9.12±2.41)%、(61.22±5.79)%。與對照組比較，異丙腎上腺素組心肌細胞中Ki67陽性細胞數顯著降低(P＜0.05)；與異丙腎上腺素組比較，香葉木苷中、高劑量組心肌細胞中Ki67陽性細胞數顯著升高(F=155.70，P＜0.05)。

圖2 免疫組化檢測Ki67的表達

2.4 香葉木苷促進Survivin的蛋白表達，抑制Bax/Bcl和Caspase-3的蛋白表達

從圖4所示western-blot條帶中可看出:與對照組比較，異丙腎上腺素組Bcl-2/Bax和Caspase-3蛋白表達量升高，Survivin蛋白表達量降低。香葉木苷中、高劑量組Bcl-2/Bax和Caspase-3蛋白表達量較異丙腎上腺素組降低；Survivin蛋白表達量較異丙腎上腺素組升高。western-blot灰度分析結果見表3:與對照組比較，異丙腎上腺素組Bcl-2/Bax和Caspase-3蛋白表達水平均顯著升高(P＜0.05)，Survivin蛋白表達水平顯著降低(P＜0.05)；與異丙腎上腺素組比較，香葉木苷中、高劑量組Bcl-2/Bax和Caspase-3蛋白表達水平均顯著降低(P＜0.05)，Survivin蛋白表達水平顯著升高(P＜0.05)。

表3 不同組Bax/Bcl、Caspase-3和Survivin蛋白表達水平的western-blot灰度分析結果

圖4 不同組Bax/Bcl、Caspase-3和Survivin蛋白表達水平

2.5 香葉木苷對SOD、LDH活性及MDA含量的影響

如表4所示:與對照組比較，異丙腎上腺素組SOD活性顯著降低(P＜0.05)，MDA含量及LDH 活力均顯著升高(P＜0.05)；與異丙腎上腺素組比較，香葉木苷中、高劑量組SOD 活性顯著升高(P＜0.05)，MDA 含量及LDH 活力均顯著降低(P＜0.05)。

表4 不同組SOD、MDA和LDH的含量

2.6 香葉木苷促進PGC-1α，TFAM 蛋白表達和Nrf2的活性

如圖5所示:從western-blot條帶中可以看出，各組Nrf2總蛋白相對表達水平比較無統計學意義(P＞0.05)。異丙腎上腺素組p-Nrf2、PGC-1α，TFAM 蛋白表達量較對照組降低。與異丙腎上腺素組比較，香葉木苷中、高劑量組p-Nrf2、PGC-1α，TFAM 蛋白表達量明顯升高。Western-blot灰度分析結果見表5，與對照組比較，異丙腎上腺素組p-Nrf2，PGC-1α，TFAM 蛋白表達水平均顯著降低(P＜0.05)。與異丙腎上腺素組比較，香葉木苷中、高劑量組p-Nrf2，PGC-1α，TFAM 蛋白表達水平均顯著升高(P＜0.05)。

表5 不同組大鼠心肌組織Nrf2、PGC-1a和TFAM 蛋白表達水平

圖5 不同組Nrf2、PGC-1a和TFAM 蛋白表達水平

3 討論

心肌損傷可引起心臟血流動力學參數的改變，從而影響心臟功能。HR 以及LVSP、LVEF 水平均為心臟功能的指標。研究[7]發現，心肌缺血/再灌注損傷能引起HR 和LVDP明顯降低，心臟功能受到破壞。Song[8]等報道稱miR-320治療后LVEF，LVFS，LVSP明顯升高，可改善心臟功能，緩解缺血再灌注損傷。與前人研究結果相似，本研究發現香葉木苷治療后，HR、LVSP、LVEF 水平均升高，表明香葉木苷對心臟功能具有保護作用。

c TnI和CK、CKMB三種心肌損傷標志物在心肌損傷診斷發揮著重要作用。異丙腎上腺素誘導的心肌梗死大鼠血清中CKMb含量的升高證實造成了心肌損傷。研究[4]發現香葉木苷通過降低CK、CKMB含量可阻斷過量異丙腎上腺素的毒性作用，抑制心臟損傷。同樣，Abdel-Daim[9]等通過HE 染色發現香葉木苷能明顯減輕心肌組織病理學損傷，在香葉木苷處理后，血清中CKMB 的濃度顯著降低。c Tn T 作為可收縮蛋白，是診斷人類和動物心肌梗死模型的高度特異性和敏感性的標志物，研究[10]發現，香葉木苷可降低異丙腎上腺素誘導的心肌梗死大鼠血清c TnI的水平，這可能是由于香葉木苷秦楚自由基的作用使心肌損傷程度下降所致。本研究發現香葉木苷治療降低了大鼠血清中CK、CKMB、c TnI的含量，表明香葉木苷對心肌具有保護作用。

通過抑制細胞凋亡和促進細胞生長對氧化應激相關性心血管疾病的發揮著重要作用。Ki67為增殖細胞中核抗原，表達量與細胞分裂密切相關，而Survivin是凋亡抑制因子家族中一個獨特的成員，在細胞周期調控、凋亡過程中起著重要作用，研究發現香葉木苷通過降低Bax和Caspase-3的表達，對三氯乙烯誘導的腎損傷具有保護作用[11]。LIU[12]等研究發現高劑量的香葉木苷能顯著上調Bcl的表達，下調Bax的表達，對缺血再灌注損傷具有有效的抗凋亡作用。本研究發現香葉木苷處理后，心肌細胞中Ki67陽性細胞數升高。香葉木苷促進Survivin的蛋白表達，抑制Bax/Bcl和Caspase-3的蛋白表達，表明香葉木苷促進心肌細胞生長，可能通過調節內源性凋亡途徑，從而抑制細胞凋亡。

氧化應激是心肌損傷的主要病理因素。Nrf2是細胞內重要的保護性轉錄調節因子，可調節眾多與緩解細胞氧化應激相關的基因表達，對于抵抗氧化應激有重要的調節作用[13]。PGC-1α是線粒體重要的轉錄調節因子，可以與其他轉錄因子結合進而調控線粒體抗氧化狀態。PGC-1α與Nrf2 共激活可以調節TFAM 的表達，進而調節線粒體DNA 轉錄和復制。目前尚無香葉木苷對氧化應激相關蛋白Nrf2，PGC-1α，TFAM 影響的相關研究，而本研究發現香葉木苷治療后，激活Nrf2通路，氧化應激相關蛋白PGC-1α和TFAM 表達水平升高，表明香葉木苷具有線粒體抗氧化的作用，具體作用機制有待進一步研究。Abdel-Daim[9]等報道稱香葉木苷能夠降低MDA 的濃度，增加SOD 的活性，從而發揮抗氧化作用。研究[14]發現香葉木苷治療后，SOD的活性增加，LDH 活力降低，從而減輕氧化損傷。本研究發現香葉木苷治療后，SOD 活性升高，MDA含量以及LDH 活力降低，表明香葉木苷具有抗氧化作用。

綜上所述，本研究通過建立異丙腎上腺素誘導心肌損傷模型，香葉木苷可能通過直接或間接途徑激活Nrf2通路，促進心肌細胞生長，抑制其凋亡，緩解異丙腎上腺素誘導的大鼠心臟功能紊亂和氧化應激，表明香葉木苷對異丙腎上腺素誘導的心肌損傷具有緩解作用，為香葉木苷應用于臨床治療心肌損傷提供實驗依據。