不同種植模式下番茄根際土壤養分和真菌多樣性分析

馮翠　衣政偉　錢巍　姜小三　劉慧穎　李成忠

摘要：為探究番茄與不同作物輪作后其土壤理化性質及真菌組成的差異，明確番茄土傳病害發生的原因，在連種2茬番茄后設置番茄-番茄連作、茄子-番茄輪作、慈姑-番茄輪作3種處理，分析土壤養分及根際土壤真菌的多樣性。結果表明，不同種植模式間的土壤養分含量明顯不同。輪作降低了番茄根際土壤有機質和全氮含量，極顯著提高了土壤有效磷含量、有效鉀含量和緩效鉀含量，提高了真菌的豐富度和多樣性。子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）和被孢霉門（Mortierellomycota）為優勢菌群，其中2種輪作模式間的真菌屬組成最為相似，均含有被孢霉屬（Mortierella）、木霉屬（Trichoderma）等抑制土傳病害發生的生防真菌。相關性分析結果顯示，土壤 pH 值與 Chao1指數呈正相關，Shannon 指數和 Simpson 指數與土壤 pH 值、有機質含量、全氮含量呈負相關，與土壤有效磷含量、有效鉀含量和緩效鉀含量均呈正相關。綜上所述，輪作能改善土壤肥力，提高土壤真菌群落多樣性，維持土壤菌群結構的平衡;土壤pH 值對真菌群落的組成影響較小，土壤含氮量較高，導致土壤真菌多樣性降低。慈姑-番茄輪作是減緩番茄土傳病害發生的有效方式之一，具有較好的應用前景。

關鍵詞：番茄;真菌多樣性;土壤養分;相關性分析;土傳病害

中圖分類號：S641.2文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2022）02-0462-07

Analysis on nutrients and fungal diversity of rhizosphere soil of tomatoes under different cropping patterns

FENG Cui YI Zheng-wei QIAN Wei JIANG Xiao-san LIU Hui-ying LI Cheng-zhong

Abstract：The aim of the study was to investigate the difference of physical and chemical properties and fungus component of rhizosphere soils of tomatoes after rotation with different crops， and identify the causes of soil-borne diseases of tomatoes. Three treatments including continuous cropping tomatoes， eggplant-tomato rotated cropping and arrowhead-tomato rotated cropping were set after continuous cropping of tomatoes for two seasons. Soil nutrients and diversity of fungi in the rhizosphere soils were analyzed. The results showed that， there were obvious differences in soil nutrient contents among different cropping patterns. Compared with continuous cropping， contents of organic matter and nitrogen in tomato rhizosphere soils decreased， while contents of available phosphorus （P）， available potassium （K） and slowly available K in the soils increased extremely significantly， and the richness and diversity of the soil fungi increased. Ascomycota， Basidiomycota and Mortierellomycota were the dominant phyla of all cropping patterns. The genus composition of fungi between two rotation patterns was the most similar， containing biocontrol fungi such as Mortierella and Trichoderma which could inhibit soil-borne diseases. Results of correlation analysis showed that， soil pH value was positively correlated with Chao1 index， while Shannon index and Simpson index were negatively correlated with soil pH value， organic matter content and total nitrogen content， and were positively correlated with soil available P content， available K content and slowly available K content. In conclusion， crop rotation could improve soil fertility， increase the community diversity of soil fungi and maintain the balance of soil microbial community structure. Soil pH value had little effect on fungal community composition， and nitrogen content in the soil was high， which caused reduction of fungal community diversity. Arrowhead-tomato rotation is one of the effective ways in slowing down the occurrence of soil-borne diseases of tomatoes， which has a good application prospect.

Key words：tomato;fungal diversity;soil nutrients;correlation analysis;soil-borne disease

番茄保健功能多、經濟效益高，在中國設施蔬菜中種植面積較大，逐漸成為世界上受歡迎并被廣泛食用的蔬菜之一[1]。近年來，番茄連作在生產中越來越常見，連作會影響土壤理化性狀和微生態系統的平衡[2]，進而導致土壤中的有益和有害菌落比例失衡[3]，引起真菌病害的發生，如尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）會導致枯萎病，輪枝孢菌（Verticillium）會引起黃萎病的發生等。輪作是減少土傳病害發生的有效方法之一。有研究者指出，番茄輪作茄子、大白菜和西葫蘆，能提高土壤中亞硝化螺菌屬（Nitrosospira）、亞硝化球菌屬（Nitrococcus）等有益細菌的豐度，提高土壤中過氧化氫酶的活性[4]，番茄-水稻輪作后顯著降低潛在致病性真菌鐮刀菌屬的含量[5]。已有的報道中，番茄多與旱生蔬菜或水稻輪作，與水生蔬菜輪作的研究不多。慈姑是里下河地區的特色水生蔬菜，含有豐富的淀粉、蛋白質及多種維生素等營養成分。慈姑喜水，是水旱輪作作物的較優選擇，但目前慈姑與番茄輪作栽培的研究鮮有報道，尤其是輪作后對土壤微生物和理化性質的影響未見報道。

作物根際微生境是土壤環境中活性較強的微生境[6]，其中真菌是土壤微生物環境中重要的物質，其多樣性是表現土壤肥力的關鍵指標之一[7]。高通量測序技術能較全面、精準地表達土壤菌群結構[8-9]。為此，本研究用 Illumina MiSeq 高通量測序技術，研究番茄與不同蔬菜輪作對其根際土壤微生物群落組成的影響，探究番茄與同科作物及非同科作物輪作，尤其是與慈姑輪作后番茄土壤微生物菌群結構與土壤養分之間的關系，為深入探討慈姑-番茄輪作減少土傳病害發生的原因及設施番茄可持續健康發展提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗地概況

試驗在江蘇省泰州市農業科學院試驗大棚內進行，土壤pH 7.8，有機質含量25.8 g/kg，全氮含量1.7 g/kg，有效磷含量16.5 mg/kg，速效鉀含量211 mg/kg，緩效鉀含量505 mg/kg。

1.2試驗材料與設計

田間試驗于2018年7月-2020年7月開展，前茬作物為絲瓜，2019年7月前連續種植2茬番茄，2019年8月-2020年1月為試驗蔬菜連（輪）作期，2020年3月-2020年7月為后茬番茄生長期。按常規施肥管理。番茄、茄子和慈姑品種分別為日本粉王、蘇崎4號、刮老烏。試驗設3個處理，T1：番茄-番茄連作，T2：茄子-番茄輪作（同科作物輪作），T3：慈姑-番茄輪作（非同科作物輪作）。番茄于1月20日播種，3月15日定植，5月底-6月初陸續采收，7月上旬采收結束。隨機區組排列，3次重復，每小區面積為14.4 m2，小區之間設田埂隔離，番茄株距和行距均為50 cm，生長期統一追肥管理。

番茄全部采收后，各小區隨機選5株，取完整根部，去除根部周圍雜物，將各處理的3個小區根際周圍土混合后過篩，置于-40 ℃冰箱用于真菌內轉錄間隔區（ITS）檢測分析;另用五點法取樣，取0～20 cm土層土壤，采用四分法混勻后放置在陰涼地點風干，用于檢測土壤理化特征。

1.3測定項目及方法

1.3.1土壤DNA提取和PCR擴增土壤真菌總DNA分離提取使用 Omega 土壤DNA試劑盒（歐米伽生物科技有限公司產品）。使用引物515F（5′-barcode-GTGCCAGCMGCCGCGG）-3′和907R（5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′），其中barcode是每個樣品特有的八堿基序列。對真菌ITS區進行PCR擴增，從2%瓊脂糖凝膠中提取純化PCR產物，并使用QuantiFluor-ST（美國普羅梅加公司產品）進行定量。

1.3.2文庫構建和測序按照Illumina的基因組DNA文庫制備程序，將合并的DNA產品用于構建Illumina的雙末端文庫。在Illumina HiSeq平臺（Nanjing GenePioneer Co. Ltd）上對擴增子文庫進行配對末端測序（2×250）。此過程由南京鐘鼎生物技術有限公司完成。

1.3.3土壤理化特征測定土壤pH值、有機質含量、全氮含量、有效磷含量、有效鉀含量和緩效鉀含量的測定均參照鮑士旦[10]的方法進行。

1.4數據處理與統計分析

真菌ITS分類測序數據：對原始測序數據進行拼接、過濾，獲取有效的數據，從這些有效的數據中對各真菌物種進行物種操作分類單元（OTUs）聚類分析。分析OTUs聚類的結果，確定對應的單個物種的樣本信息在單個樣本內對應物種群落中的樣本豐度和動態分布均衡情況，并對其進行樣本豐度和Alpha多樣性分析;同時通過對OTUs進行多次聚類序列的比對和Beta多樣性分析，探究不同樣本間或不同組間物種群落關系結構的自然相似性。選用Anova、Anosim 和 MRPP 等統計分析方法檢驗樣本物種組成和菌群結構的差異顯著性。序列拼接質控使用 PRINSEQ、pandaseq、Usearch及筆者自行開發的perl程序等軟件完成。

土壤理化特征數據處理與分析采用 SPSS 18.0和Microsoft Excel 2010軟件完成。

2結果與分析

2.1不同種植模式的土壤養分分析

如表1所示， T2處理的土壤pH值與T1、T3處理差異極顯著，T1與T3處理間無顯著差異;各處理間的土壤有機質含量差異極顯著;T1處理的全氮含量最高且與 T2、T3處理間差異極顯著，說明水旱輪作后土壤有機質和全氮含量降低，這可能跟作物需肥量有關。3個處理間有效磷、有效鉀和緩效鉀含量差異均達到極顯著水平，且T3處理的有效磷、有效鉀和緩效鉀含量最高。

2.2不同種植模式間土壤真菌的OTUs及Alpha多樣性分析

由表2可知，供試土壤的覆蓋度為0.999 2～0.999 6，表明該測序深度可以基本覆蓋樣品中的所有物種，可以代表各處理土壤真菌種類等的真實情況。3種不同種植模式的土壤真菌DNA有效序列數中T1與T2、T3處理間差異極顯著， T2、T3處理間差異不顯著。3個處理間的OTU數量差異極顯著，其中T3處理最多。Chao1指數和觀測到的物種數大小均為T3>T2>T1，香農（Shannon）指數和辛普森（Simpson）指數由高到低為T3>T2>T1?？梢?，番茄輪作后其根際土壤真菌群落的多樣性和豐富度均比番茄連作要高，尤其是與非同科作物輪作后。

2.3不同種植模式間土壤真菌屬水平群落結構分析

3種不同種植模式中，真菌群落組成存在一定的差異。在門級上，主要包括子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、被孢霉門（Mortierellomycota）和壺菌門（Chytridiomycota）（圖1）。圖1和圖2顯示，各處理的優勢真菌門不同，T1處理優勢菌群為子囊菌門和擔子菌門，優勢屬有錐蓋傘屬（Conocybe）;T2和T3處理優勢真菌門為子囊菌門、擔子菌門和被孢霉門，其中T2處理優勢屬有被孢霉屬（Mortierella）、枝孢菌屬（Cladosporium），T3處理優勢屬有被孢霉屬、假絲酵母菌屬（Candida）和木霉屬（Trichoderma）。

2.4不同種植模式間土壤真菌物種豐度聚類分析

選取屬水平的Top 20的物種分類繪制聚類熱圖（圖3），結果表明，土壤樣品被分為2類，T2、T3處理聚為一類，表明上述2個處理具有較為相似的土壤真菌群落結構;T1處理為一類，且T2和T3處理的土壤樣品間分枝長度較短，說明2個處理間物種組成和豐度相似?？梢?，與番茄連作相比，輪作可以對土壤真菌群落結構在屬水平上產生影響。通過熱圖分析進一步鑒定真菌群落的相對豐度。比較相似性可知，所有處理的土壤真菌群落結構分為5簇（圖3），說明每個簇內的真菌屬在不同處理中的分布相似。

2.5番茄根際土壤真菌多樣性與土壤養分的相關性分析

對3種種植模式的土壤理化指標及根際土壤真菌的多樣性指數共9個指標的相關性進行分析（表3）。表明，Chao1 指數與土壤pH值、有效磷含量、有效鉀含量和緩效鉀含量呈正相關，相關系數分別為0.013、0.876、0.985、0.938，與有機質含量和全氮含量呈負相關，相關系數分別為-0.934、-0.967;Shannon指數和Simpson指數與土壤的pH值、有機質含量、全氮含量均呈負相關，與土壤有效磷含量、有效鉀含量和緩效鉀含量均呈正相關。

3討論

土壤養分和微生物菌落對作物的生長和發育有著重要的影響。種植模式會影響作物根際土壤的養分含量[11]，作物的根際分泌物對微生物菌群也有一定的影響[12]。本研究結果表明，連作和輪作后的番茄根際土壤養分存在一定的差異，且土壤有效磷含量、有效鉀含量和緩效鉀含量之間均差異極顯著。T1、T2 與 T3處理的有機質含量差異極顯著;T1處理的全氮含量最高，且與T2、 T3處理差異極顯著，說明輪作后土壤有機質和全氮含量降低，這可能跟作物的需肥量有關，建議水旱輪作后適當增施有機肥;金莉[13]認為輪作能較好地提高土壤中養分含量，避免養分失衡，這與本研究結果一致。

在植物生態學中，Chao1 指數、觀測到的物種數和香農指數、辛普森指數分別反映土壤樣品的物種種類數量和多樣性及豐度的均勻性。上述指數越高，說明樣本中的各個物種數量和豐富度越高，物種的資源多樣性越豐富、個體分配越均勻。本研究中，Chao1 指數、觀測物種數和Shannon指數、Simpson指數從高到低均為T3>T2>T1，說明輪作栽培后的番茄根際土壤中真菌的豐富度和多樣性都高于連作的土壤，其中水旱輪作效果更好。這與蘇燕等[14]指出的輪作可有效提高土壤微生物的多樣性，且水旱輪作模式對改善土壤性質及提高土壤微生物活性的效果最顯著的結論相符。

土壤真菌種類繁多、功能多樣，在植物根際土壤中形成一個小型生態系統，對作物生長影響較大。本試驗中，各種植模式的番茄根際土壤微生物主要包括子囊菌門、擔子菌門、被孢霉門和壺菌門4大類。而主要優勢菌群比較穩定，均以子囊菌門的豐度最高，這與劉師豆等[15-17]的研究結果一致。子囊菌門大多數為腐生菌，對土壤中不易降解的有機物有分解作用，可驅動養分循環[18-19]。各處理的真菌優勢屬不同，T1處理優勢屬有錐蓋傘屬;被孢霉屬是T2和T3處理的優勢屬。梨孢菌屬主要引起禾本科植物病害[20];被孢霉屬是一種潛在的生物控制劑，對土壤生態和作物健康有益，具有防治某些植物病原體和蟲害的作用[21]。T1、T2和T3處理土壤中都有鐮刀菌屬和木霉菌屬，其中T3處理中木霉菌屬含量較高。鐮刀菌屬為常見的土傳性病原菌，會造成辣椒[22]、番茄[23]枯萎病和根腐病。木霉菌對作物的土傳病害有生防和殺菌效果，并產生多種對植物有益的生物活性化學物質，提高作物對土傳病害的抗逆性[24]?？梢?，輪作能增加有益真菌的繁殖量和種類，而在水旱輪作過程中，由于栽培作物和栽培方式不同，引起番茄根際土壤的微生物群落的差異，且輪作模式下的番茄根際土壤周圍的有益真菌與其他有害微生物和病原菌之間形成拮抗作用，共同維持了土壤中微生物菌群和土壤結構的均衡，Ren等[25]的研究結論與本觀點一致。屬水平Top 20的物種分類聚類熱圖顯示，T1、T2和T3處理明顯被分為2類，T1處理為一類，T2和T3處理聚為一類，且二者樣品間分枝長度較短。說明，輪作可以改變番茄土壤真菌群落結構。

土壤微生物多樣性與土壤理化特征之間存在密切關系[26-27]。本研究結果表明，Chaol 指數與土壤 pH 值呈正相關，與韋俊等[28]的研究結果一致，但 pH 值對真菌群落組成影響較小，表明 pH 值不是影響番茄根際土壤群落組成的主要因子，這一研究結果與季凌飛等的[29]研究結果一致;與王楠等[16]和Liu等[30]得出的影響土壤真菌的最主要因素是 pH 值的結果不一致，這可能是作物種類和根際分泌物不同導致微生物和土壤理化性質差異造成的。Shannon指數、Simpson指數與土壤 pH 值呈負相關，說明偏酸性的環境適宜真菌生長，這與孫倩等[17]的研究結果一致。Shannon指數、Simpson指數與土壤有機質和全氮含量呈負相關，與土壤有效磷含量、有效鉀含量和緩效鉀含量均呈正相關，說明土壤中的氮含量較高，會使土壤真菌的多樣性大大減少，這與韋俊等[28]的研究結果一致。

4結論

本研究結果表明，輪作能緩解番茄種植過程中的土壤酸化現象，避免土壤養分失衡;還可改變土壤真菌群落結構和豐度，尤其是可以提高抑制土傳病害發生的典型生防真菌屬的種類和豐度，其中與慈姑輪作的效果最好。土壤中氮含量過高時，會明顯降低真菌群落的多樣性指數。本研究測算了番茄連作和輪作（同科作物與非同科作物）模式間根際土壤微生物的種類及相對豐度，探究了根際微生物-土壤養分系統的相互聯系，明確了慈姑與番茄輪作條件下土壤微生物特征及土壤養分的差異，闡明了輪作減少番茄土傳病害發生的原因，為慈姑和番茄健康生產提供了有力支撐。

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（責任編輯：陳海霞）

收稿日期：2021-08-08

基金項目：泰州市科技支撐計劃（農業）項目（TN201923）;江蘇省“青藍工程”優秀教學團隊項目[蘇教師函（2020）10號]

作者簡介：馮翠（1985-），女，山東棗莊人，碩士，助理研究員，主要從事蔬菜栽培及土壤微生物研究。（E-mail）mxaq007@163.com

通訊作者：李成忠，（E-mail）czli@jsahvc.edu.cn