超聲輔助法提取酸棗仁中異牡荊素—吡喃葡萄糖苷工藝優化

宮 麗 劉 瑩 楊婷婷 王 輕 張彥青

(天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津 300134)

酸棗仁是中國常用藥食同源品種之一[1-2]，在酸棗仁湯、棗仁安神方等肝血不足之失眠類的方劑、中成藥處方、食品和保健食品中被廣泛應用[3-4]。酸棗仁黃酮是酸棗仁中的主要活性成分之一[5-7]，具有治療失眠[8]、改善認知能力[9-10]、抗焦慮[11]、抗抑郁[12-15]等多種生物活性，其中，異牡荊素—吡喃葡萄糖苷是酸棗仁黃酮的主要成分之一。異牡荊素—吡喃葡萄糖苷能夠明顯促進淋巴細胞増殖，具有一定的免疫調節作用[16]，在清除ABTS自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基等方面表現出較好的抗氧化活性[17]。此外，異牡荊素—吡喃葡萄糖苷的吸收特性優于酸棗仁中的其他黃酮類物質，如斯皮諾素、當藥素等[18]，顯示出較好的體內生物利用度特性。

目前黃酮類化合物的常見提取方法主要為浸提法、加熱回流法、超聲輔助提取等，由于浸提法耗時太長，加熱回流法又可能因為高溫破壞黃酮類化合物的結構[19-20]，所以超聲輔助提取技術受到越來越多的關注。超聲輔助提取法利用超聲傳播時所產生的機械效應、空化效應和熱效應[21]，可以縮短提取時間，降低操作難度并且增加提取率[22-23]。乙醇加熱回流是當前提取異牡荊素—吡喃葡萄糖苷的主要方法[17]，目前有關超聲波輔助提取酸棗仁中異牡荊素—吡喃葡萄糖苷的研究尚未見報道。研究擬通過超聲輔助提取技術對酸棗仁黃酮單體異牡荊素—吡喃葡萄糖苷進行提取，并運用響應面法優化其提取工藝參數，以期為異牡荊素—吡喃葡萄糖苷的深入開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

脫脂酸棗仁：天津薊縣；

異牡荊素—吡喃葡萄糖苷對照品：純度>95%，自制；

甲酸：色譜純，阿拉丁控股集團有限公司；

乙腈：色譜純，德國Merck公司；

水：色譜純，美國J. T. Baker公司；

乙醇：分析純，美國J. T. Baker Chemicals公司。

1.1.2 主要儀器設備

數控超聲波清洗器：SB25-12 DTD型，寧波新芝生物科技有限公司；

高速萬能粉碎機：FW100型，天津泰斯特儀器有限公司；

高速離心機：LG10-2.4A型，北京醫用離心機廠；

電熱恒溫鼓風干燥箱：DH-101型，天津市中環實驗電爐有限公司；

高效液相色譜儀：安捷倫1100型，安捷倫科技中國有限公司；

電子天平：FA1004Max 100 g 型，上海精科天平有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率測定

(1) 高效液相色譜條件：選擇ODS C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流速為0.5 mL/min；流動相為乙腈—水(含0.1%甲酸)混合液(V乙腈∶V水=18∶72)；柱溫30 ℃；檢測波長335 nm；進樣量8 μL[24]。

(2) 標準曲線繪制：精密稱取適量異牡荊素—吡喃葡萄糖苷對照品，用流動相(V乙腈∶V水=18∶72，不含甲酸)溶解，配制成1 mg/mL的溶液，依次稀釋得10，20，50，100，200，300 μg/mL的對照品溶液。以異牡荊素—吡喃葡萄糖苷溶液濃度為橫坐標，所得峰面積為縱坐標，得標準曲線為y=0.643 4x+15.093，R2=0.999。

(3) 牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率的測定：按式(1)計算牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率[25]。

(1)

式中：

W——異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率，%；

c——對應質量濃度，mg/mL；

V——提取液體積，mL；

D——稀釋倍數；

m——樣品取樣量，mg。

1.2.2 單因素試驗

(1) 超聲功率：固定提取溫度40 ℃、料液比1∶15 (g/mL)、超聲時間50 min，考察超聲功率(100，200，300，400，500 W)對酸棗仁中異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率的影響。

(2) 超聲時間：固定乙醇體積分數60%，提取溫度40 ℃、料液比1∶15 (g/mL)、提取功率300 W，考察超聲時間(30，40，50，60，70 min)對酸棗仁中異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率的影響。

(3) 料液比：固定提取溫度40 ℃、乙醇體積分數60%、提取功率300 W、超聲時間50 min，考察料液比[1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25 (g/mL)]對酸棗仁中異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率的影響。

(4) 乙醇體積分數：固定提取溫度40 ℃、料液比1∶15 (g/mL)、提取功率300 W、超聲時間50 min，考察乙醇體積分數(40%，50%，60%，70%，80%)對酸棗仁中異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率的影響。

(5) 超聲溫度：固定料液比1∶15 (g/mL)、乙醇體積分數60%、提取功率300 W、超聲時間50 min，考察提取溫度(30，40，50，60，70 ℃)對酸棗仁中異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率的影響。

1.2.3 響應面優化試驗 以單因素試驗結果為基礎[26]，選擇超聲功率、料液比、超聲時間和乙醇體積分數為響應因素，以異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率為響應值，采用Design-Expert 8.0.6 進行四因素三水平的響應面試驗以優化異牡荊素—吡喃葡萄糖苷的提取工藝，平行3次。

1.3 數據處理

各指標測定均重復3次，采用Excel 2010進行數據統計處理，使用SPSS 16.0軟件進行顯著性分析，使用Prism 5.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 超聲功率 由圖1(a)可知，異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率隨超聲功率的增大先升高后降低，在超聲功率為400 W時最大，在超聲功率為500 W時下降至0.527%，可能是超聲波空化效應和機械剪切力作用的增強有助于破碎藥材的細胞壁，促進目標物的溶出，而超聲功率過大會導致局部的高溫高壓，破壞異牡荊素—吡喃葡萄糖苷的內部結構從而使提取率降低[27-28]。因此選擇超聲功率300～500 W為佳。

2.1.2 超聲時間 由圖1(b)可知，當超聲時間為60 min時，提取率為0.634%，當超聲時間為70 min時，提取率急劇降低至0.407%，可能是因為超聲時間過短無法使目標成分充分溶出，而超聲時間過長又會破壞異牡荊素—吡喃葡萄糖苷的內部結構[29]，從而使提取率降低。因此，超聲時間選擇50～70 min為宜。

圖1 各因素對異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率的影響

2.1.3 料液比 由圖1(c)可知，異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率隨乙醇體積的不斷增加先升高后降低，當料液比為1∶15 (g/mL)時提取率達到峰值0.604%。這可能是由于料液比的增加使原料與提取液間的接觸面積增大，從而提高溶出率；但料液比過高將稀釋提取液的濃度，且過多的提取液會分散超聲輻射對目標組分的作用，使提取率降低，說明當異牡荊素—吡喃葡萄糖苷濃度達最大值后，料液比的增加反而會使其濃度降低。因此，料液比選擇1∶10～1∶20 (g/mL)為宜。

2.1.4 乙醇體積分數 由圖1(d)可知，異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率隨乙醇體積分數的升高先升高后降低，當乙醇體積分數為70%時提取率最高，這可能與其溶解性有關。當乙醇體積分數較低時，酸棗仁粉末中的異牡荊素—吡喃葡萄糖苷未能完全溶解，隨著乙醇體積分數的增大，異牡荊素—吡喃葡萄糖苷溶出得更加完全，但當乙醇體積分數>70%時可能會破壞異牡荊素—吡喃葡萄糖苷的結構，使提取率降低。故乙醇體積分數選擇60%～80%為宜。

2.1.5 超聲溫度 由圖1(e)可知，異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率隨超聲溫度的升高先升高后降低，當超聲溫度為50 ℃時，提取率最高，可能是因為黃酮類化合物具有一定的熱敏性[26]，適度的溫度有助于目標物的溶出，而溫度過高則會破壞目標物致使提取率下降。因此，超聲溫度選擇40～60 ℃為宜。

2.2 響應面法優化

2.2.1 響應面試驗結果與分析 在單因素試驗的基礎上，選擇超聲功率、超聲時間、料液比和乙醇體積分數為響應因素，以異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率為響應值，根據Box-Behnken中心組合原理設計四因素三水平的響應面試驗優化酸棗仁中異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取工藝參數，試驗因素水平見表1，試驗設計與結果見表2。

表1 響應面試驗因素水平表

表2 響應面試驗設計與結果

2.2.2 模型擬合和顯著性分析 通過Box-Benhnken試驗擬合得出異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取工藝的回歸方程為：

Y=0.71+0.01A+0.013B+0.016C+0.02D-7.5×10-3AB-4.75×10-3AC-2.5×10-3AD+2.5×10-3BC-5.5×10-3BD+5.25×10-3CD-0.062A2-0.032B2-0.042C2-0.016D2。

(2)

由表3可知，回歸模型P值<0.000 1，極顯著；失擬項P值為0.138 4不顯著，說明該試驗設計可靠，模型有意義[30]，可對二次回歸方程響應值進行預測。一次項B、C、D，二次項A2、B2、C2、D2對異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率影響極顯著(P<0.01)，一次項A對異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率影響顯著(P<0.05)，表明各因素及因素之間的交互與響應值并非簡單的線性關系，二次項對響應值的影響也較大，而各因素之間的交互作用對響應值影響相對較小。比較F值可知，各因素對酸棗仁中異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率的影響程度依次是D>C>B>A，該異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率回歸模型的相關系數較高(R2=0.972 8)，模型擬合程度好[31]。因此，可用此模型方程預測異牡荊素—吡喃葡萄糖苷超聲提取的結果。

表3 回歸模型方差分析?

2.2.3 交互效應分析 由圖2可知，隨著各因素在一定范圍的增大，異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取效果先升高后降低，各因素對異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率影響顯著(P<0.05)，但各因素間的交互作用對異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率影響不顯著，與方差分析結果一致。

圖2 兩兩因素交互作用對異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率影響的響應面圖

2.2.4 最佳提取率驗證 由響應面軟件分析得到異牡荊素—吡喃葡萄糖苷的最佳提取工藝參數為超聲功率405 W，超聲時間62.30 min，料液比1∶15.75 (g/mL)，乙醇體積分數76.3%，此條件下預測異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率為0.719%。為便于實際操作，將提取工藝條件修整為超聲功率405 W，超聲時間60 min，料液比1∶16 (g/mL)，乙醇體積分數75%，該條件下實測異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率為0.705%(n=3)，與預測值的相對誤差為2%，表明采用響應面法優化得到的工藝參數基本準確可靠，該試驗模型能較好反映出各因素與異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率之間的關系，具有一定的實用價值。

3 結論

采用超聲波對酸棗仁黃酮單體異牡荊素—吡喃葡萄糖苷進行提取。結果表明，異牡荊素—吡喃葡萄糖苷的最佳提取工藝條件為超聲功率405 W，超聲時間60 min，料液比1∶16 (g/mL)，乙醇體積分數75%，該條件下異牡荊素—吡喃葡萄糖苷提取率為0.705%(n=3)，與預測值(0.719%)接近，相對誤差為2%。后續可對異牡荊素—吡喃葡萄糖苷進行體內外活性研究。