香葉木素對Ⅱ型糖尿病小鼠的降血糖作用

江一峰，周雪雪，2，黃盈盈，張華峰，2*，王紅霞

（1 中俄食品與健康科學國際聯合研究中心 陜西省漢陰縣富有機硒食品科技創新試驗示范站陜西師范大學食品工程與營養科學學院 西安 710119 2 西北瀕危藥材資源開發國家工程實驗室 西安 710119）

糖尿病是威脅人體健康的重要慢性疾病，也是引起死亡的十大病因之一[1-3]。全球糖尿病患者接近4 億，而我國約為1 億，且呈現逐年遞增的趨勢[4-5]。糖尿病以糖代謝紊亂為主要特征，常伴隨氧化應激和脂代謝紊亂，并可能產生肝臟、腎臟等臟器損傷或并發癥[6]。臨床上常用的二甲雙胍、胰島素（INS）、格列美脲等藥物雖然具有明顯的降血糖效果，但是長期使用可能對患者產生副作用[7-8]。從藥食同源植物中獲取天然、高效、安全的降糖因子成為糖尿病相關研究的新方向[1]。

菊花是我國著名的藥食同源植物，具有降血糖、抗氧化、降血壓、抗癌、抑菌、調節腸道菌群等作用[9-12]，在飲料、藥膳、休閑食品加工中具有廣泛用途[9]。本實驗室研究發現，菊花中含有較豐富的香葉木素（diosmetin）、異綠原酸C（isochlorogenic acid C）、木犀草苷（cynaroside）和蒙花苷（buddleo side）[13]。異綠原酸C 具有清除自由基、抗炎等功效[14-15]；木犀草苷具有抗菌、保護神經等功效[16-17]；蒙花苷具有抗氧化、抗炎等功效[18-19]；香葉木素具有抗氧化、抗癌和保護視網膜等功效[20-22]。目前鮮見關于這4 種酚類化合物單體降血糖作用的研究報道。為了揭示菊花降血糖作用的物質基礎，了解香葉木素的降血糖活性，本研究通過體外試驗篩選活性較高的單體，在此基礎上利用高糖、高脂飼料結合鏈脲佐菌素（STZ）誘導的Ⅱ型糖尿病小鼠模型，探究其降血糖作用以及對脂代謝、氧化應激等的效應。

1 試驗材料

4～6 周齡雄性昆明小鼠[SCXK（陜）2012-001，SPF 級]，西安交通大學；普通飼料，西安晶博公司；高糖、高脂飼料（65%小鼠維持飼料、20%蔗糖、10%豬脂肪、2.5%膽固醇、1%膽酸鈉、1%礦物質混合物、0.5%維生素混合物），北京博愛港公司；異綠原酸C（HPLC 級，純度≥98%）、木犀草苷（HPLC級，純度≥98%）、香葉木素（HPLC 級，純度≥98%）、蒙花苷（HPLC 級、純度≥98%）、阿卡波糖（Acarbose，HPLC 級，純度≥98%）、α-淀粉酶（4 000 U/g）、α-葡萄糖苷酶（10 U/mg）、α-D-葡萄糖苷（PNPG），上海源葉公司；INS、糖原、糖化血清蛋白（GSP）、總膽固醇（TC）、總甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）、谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）檢測試劑盒或ELISA 試劑，南京建成生物工程研究所；STZ，美國Sigma 公司；格列美脲，天安公司；二甲雙胍，中美上海施貴寶公司。

2 試驗方法

2.1 分子對接分析

參照周雪雪[1]的方法，選用異綠原酸C、木犀草苷、香葉木素、蒙花苷4 種酚類化合物單體，以阿卡波糖為對照，進行α-葡萄糖苷酶蛋白分子對接分析。

2.2 α-淀粉酶抑制作用分析

參照聶坤倫等[23]的方法分析4 種酚類化合物單體對α-淀粉酶的抑制作用，以阿卡波糖為對照。用Multiskan Go 全波長酶標儀（美國Thermo Electron 公司）測定吸光值。計算各單體對α-淀粉酶的抑制率以及25%抑制質量濃度（IC25）和半抑制質量濃度（IC50）。

2.3 α-葡萄糖苷酶抑制作用分析

參照Thi 等[24]的方法分析4 種酚類化合物單體對α-葡萄糖苷酶的抑制作用，以阿卡波糖為對照。用全波長酶標儀測定吸光度。計算各單體對α-葡萄糖苷酶的抑制率以及25%抑制質量濃度和半抑制質量濃度。

2.4 Ⅱ型糖尿病模型建立與分組處理

取雄性昆明小鼠100 只，用普通飼料喂養1周后，隨機分為正常類群和模型類群。模型類群飼喂高糖、高脂飼料，正常類群仍然飼喂普通飼料[25]。4 周后，所有小鼠禁食（不禁水）12 h，給模型類群、正常類群小鼠分別注射STZ、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。72 h 后，所有小鼠禁食（不禁水）12 h，測定空腹血糖（FBG），結合糖尿病高飲水量等典型癥狀將FBG≥11.1 mmol/L 的小鼠認定為造模成功[26]。對未成模小鼠，繼續補充注射STZ。按照表1對小鼠進行分組處理。

表1 實驗動物分組Table 1 Group of experimental animals

2.5 生理生化指標測定

2.5.1 小鼠攝食量、飲水量、體重和FBG 測定干預（灌胃）試驗期間，除正常組（N 組）外，其余各組進行高糖、高脂飼喂。連續干預30 d，期間每天觀察小鼠的飲水量、攝食量、體征變化、精神狀態、墊料潮濕程度（排尿量變化）等，每隔6 d 測量1次體重和FBG，用平均值繪圖。

2.5.2 葡萄糖耐受量（OGTT）測定 參考Liu 等[27]的方法測定小鼠的OGTT。小鼠禁食（不禁水）12 h后，測定各組小鼠的FBG（0 h）。N 組、模型組（M組）給予生理鹽水，陽性對照組1（P1 組）、陽性對照組2（P2 組）分別給予二甲雙胍、格列美脲，高劑量干預組（D50 組）、中劑量干預組（D30 組）和低劑量干預組（D15 組）分別給予高、中、低劑量的香葉木素。各組小鼠給予葡萄糖后測定0.5，2 h 的血糖值，求得曲線下面積（AUC）。

2.5.3 樣本收集與臟器指數測定 干預試驗結束后，參照周雪雪[1]和Yuan 等[26]的方法進行樣本收集和臟器指數測定。

2.5.4 GSP 含量測定 取-20 ℃凍存的血清樣本，化凍，參照試劑盒說明書測定GSP 含量。

2.5.5 INS 含量測定 取-20 ℃凍存的血清樣本，化凍，參照試劑盒說明書測定INS 含量，計算胰島素抵抗指數（HOMA-IR）[28]。

2.5.6 脂代謝指標測定 取-20 ℃凍存的血清樣本，化凍，測定小鼠血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C含量[29-30]。

2.5.7 肝臟指標測定

2.5.7.1 肝糖原含量測定 取-20 ℃凍存的肝臟組織樣本，化凍，測定肝糖原含量[31]。

2.5.7.2 肝功能相關酶活力測定 取-20 ℃凍存的血清樣本，化凍，測定ALT 和AST 活力[32]。

2.5.8 抗氧化指標測定 取-20 ℃凍存的血清和肝組織樣本，化凍，按照試劑盒說明書測定小鼠血清和肝臟中抗氧化酶（SOD、GSH-Px） 活力、TAOC 與MDA 含量[30，33]。

3 結果與分析

3.1 分子對接試驗

異綠原酸C 能夠與α-葡萄糖苷酶蛋白的氨基酸殘基ASP232、ASP357、GLU603、ASP630 形成分子間氫鍵，與 ASP469、ALA602、GLU603、ASP630 形成疏水作用力，配體與蛋白所形成的復合物結合穩定（圖1a）；木犀草苷能夠與酶蛋白的ASP232、ASN237、MET470、ASN496、SER505、ARG552 形成分子間氫鍵，與ALA231、ILE233、ALA234、MET470、LYS506 形成疏水作用力，但是與MET470 之間產生了一個非特異性排斥力（圖1b）；香葉木素能夠與酶蛋白的ASP232、ASP469、ARG552、ASP630 形成分子間氫鍵，與TRP329、TRP432、MET470、ASP568、PHE601、ALA602、ALA628 形成疏水作用力，配體與蛋白所形成的復合物結合較穩定（圖1c），相互作用能量得分較好（表1）；蒙花苷能夠與酶蛋白的ASP232、ASN237、ASP469、MET470、ASN496、ARG552、ASP568、ASP630 形成分子間氫鍵，與ILE233、ALA234、MET470、LYS506 形成疏水作用力（圖1d）。由表2可知，4 種酚類化合物單體對α-葡萄糖苷酶蛋白均有一定的親和活力，其分子對接能力依次為：異綠原酸C＞香葉木素＞木犀草苷＞蒙花苷。

表2 酚類化合物單體與α-葡萄糖苷酶蛋白的分子對接結果Table 2 Molecular docking results of phenolic compounds to α-glucosidase protein

圖1 酚類化合物單體與α-葡萄糖苷酶的分子對接模式Fig.1 Molecular docking mode of phenolic compounds to α-glucosidase

3.2 酶學試驗

3.2.1 α-淀粉酶抑制活性 如圖2所示，4 種酚類化合物單體對α-淀粉酶的抑制率均隨著其濃度的增大而增加。由表3可得，4 種單體濃度與α-淀粉酶抑制率擬合方程的相關系數（R2）在0.9006～0.9605 之間，反映出較好的量效關系。4 種單體對α-淀粉酶的抑制能力依次為：木犀草苷＞香葉木素＞蒙花苷＞異綠原酸C。

圖2 酚類化合物單體對α-淀粉酶的抑制率Fig.2 Inhibitory rate of phenolic compounds against α-amylase

3.2.2 α-葡萄糖苷酶抑制活性 如圖3所示，4種酚類化合物單體對α-葡萄糖苷酶的抑制率均隨著濃度的增大而增加。4 種單體濃度與α-葡萄糖苷酶抑制率擬合方程的R2在0.9165～0.9626 之間，反映出較好的量效關系（表3）?？梢钥闯?，4 種單體對α-葡萄糖苷酶均表現出抑制活性，但弱于阿卡波糖。不同單體對α-葡萄糖苷酶的抑制能力依次為：香葉木素＞木犀草苷＞異綠原酸C＞蒙花苷。綜合分析4 種單體的分子對接以及α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶試驗結果，選擇香葉木素進行動物實驗，進一步探究其體內降血糖作用。

表3 酚類化合物單體對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性及其量效關系數學模型Table 3 Inhibitory activities of phenolic compounds against α-amylase and α-glucosidase and mathematical model of dose-effect relationship

圖3 酚類化合物單體對α-葡萄糖苷酶的抑制率Fig.3 Inhibitory rate of phenolic compounds againist α-glucosidase

3.3 小鼠攝食量、飲水量與體重變化分析

觀測發現，Ⅱ型糖尿病模型小鼠行動遲緩，精神萎靡，墊料易濕且臭味明顯，而N 組小鼠體型健碩，行動敏捷。干預30 d 后，除D15 組外，其余各干預組小鼠的上述不良狀況均有所緩解。由圖4可知，造模成功后，小鼠攝食量、飲水量增加，體重減輕。干預30 d 后，與M 組相比，D15、D30、D50、P1、P2 組小鼠的攝食量和飲水量皆有所降低；除D15 組外，其余各干預組小鼠體重減輕的趨向也逐漸減緩?？梢?，香葉木素對Ⅱ型糖尿病小鼠高攝食量、高飲水量和低體重的病征具有一定的緩解作用。

圖4 香葉木素對小鼠攝食量、飲水量和體重的影響Fig.4 Effect of diosmetin on food intake，water intake and body weight of mice

3.4 香葉木素對小鼠FBG、HOMA-IR 和INS含量的影響

由表4可知，隨著時間的延長，N 組小鼠的FBG 一直遠低于11.1 mmol/L，而M 組的FBG 則持續上升。D15、D30、D50 組小鼠的FBG 在干預12 d 后開始出現不同程度的下降，在干預12，18，24，30 d 的FBG 均顯著低于M 組（P＜0.05）。D15、D30、D50 組小鼠的FBG 隨著香葉木素濃度的增大而降低，呈現出較好的量效關系。由圖5和圖6可見，與N 組相比，M 組小鼠的INS 含 、HOMA-IR 均極顯著提高（P＜0.01），說明Ⅱ型糖尿病小鼠出現了胰島素抵抗癥狀[34]。干預30 d后，與M 組相比，D15、D30、D50 組小鼠的INS 含量、HOMA-IR 均顯著降低（P＜0.05），并且INS 含量、HOMA-IR 均隨著香葉木素濃度的增大而降低，顯示出較好的劑量依賴性?？梢钥闯?，香葉木素能夠降低Ⅱ型糖尿病小鼠的FBG，緩解其胰島素抵抗癥狀。

圖5 香葉木素對小鼠胰島素含量的影響Fig.5 Effect of diosmetin on insulin content in mice

圖6 香葉木素對小鼠HOMA-IR 的影響Fig.6 Effect of diosmetin on HOMA-IR in mice

表4 香葉木素對Ⅱ型糖尿病小鼠FBG 的影響Table 4 Effect of diosmetin on FBG in type Ⅱdiabetic mice

3.5 香葉木素對小鼠GSP 含量的影響

GSP 可以反映糖尿病患者在過去1～2 周內血糖的控制情況[29]。由圖7可見，M 組小鼠血清中GSP 含量極顯著地高于N 組（P＜0.01）。干預30 d后，與M 組相比，D15 組小鼠的GSP 含量略有下降（P＞0.05），D30、D50、P1、P2 組GSP 含量顯著下降（P＜0.05）。

圖7 香葉木素對小鼠GSP 含量的影響Fig.7 Effect of diosmetin on GSP content in mice

3.6 香葉木素對小鼠OGTT 的影響

OGTT 主要反映機體血糖調節能力和胰島素敏感性[35]。由表5可知，與N 組對比，M 組小鼠的血糖值在給予葡萄糖前（0 h）和給予葡萄糖后（0.5，2 h）均極顯著增高（P＜0.01）；與M 組對比，D30、D50 組小鼠在0.5，2 h 的血糖值皆顯著降低（P＜0.05）；D15 組在0.5 h 的血糖值與M 組相比沒有顯著差別（P＞0.05），而在2 h 的血糖值顯著低于M 組（P＜0.05）。由圖8可見，M 組小鼠的AUC 極顯著高于N 組小鼠（P＜0.01）；D30、D50 組小鼠的AUC 顯著低于M 組（P＜0.05），D15 組的AUC 略低于M 組（P＞0.05）?？梢?，香葉木素可以緩解小鼠OGTT 異常。

表5 香葉木素對Ⅱ型糖尿病小鼠OGTT 的影響Table 5 Effect of diosmetin on OGTT in type Ⅱdiabetic mice

圖8 香葉木素對小鼠AUC 的影響Fig.8 Effect of diosmetin on AUC of mice

3.7 香葉木素對小鼠臟器指數的影響

糖尿病往往會引起肝、腎等臟器的傷害，通常臟器指數增大說明臟器可能出現了損傷[27，32]。由表6可知，與N 組對比，M 組小鼠肝、脾和腎的臟器指數皆顯著提高（P＜0.05）。干預30 d 后，與M 組相比，D30、D50 組小鼠肝、脾和腎的臟器指數皆顯著降低（P＜0.05）；D15 組的腎臟指數與M 組相比無明顯差異（P＞0.05），肝臟、脾臟指數皆顯著低于M 組（P＜0.05）。由此推測，香葉木素具有緩解Ⅱ型糖尿病小鼠肝、脾和腎損傷的作用。

表6 香葉木素對Ⅱ型糖尿病小鼠臟器指數的影響Table 6 Effect of diosmetin on organ index of type Ⅱdiabetic mice

3.8 香葉木素對小鼠脂代謝指標的影響

糖代謝與脂代謝密切關聯，糖尿病患者容易出現脂代謝紊亂，隨著病情加重甚至會引起動脈粥樣硬化[36-37]。由圖9可知，與N 組對比，M 組小鼠TG、TC、LDL-C 含量均極顯著上升（P＜0.01），HDL-C 含量極顯著降低（P＜0.01）。干預30 d 后，與M 組相比，D30、D50 組小鼠血清中TG、TC、LDL-C 含量皆明顯降低（P＜0.05），HDL-C 含量明顯提高（P＜0.05）；D15、D30、D50 組小鼠的TG、TC、LDL-C 含量均隨著香葉木素劑量的增大而降低，HDL-C 含量隨著香葉木素劑量的增大而升高，顯示出較好的量效關系?？梢钥闯?，香葉木素對小鼠脂代謝紊亂表現出較好的緩解作用。

圖9 香葉木素對小鼠脂代謝的影響Fig.9 Effect of diosmetin on lipid metabolism in mice

3.9 香葉木素對小鼠肝糖原的影響

肝糖原的合成與分解可以反映機體對葡萄糖的吸收和利用情況[27]。由圖10可見，與N 組對比，M 組小鼠肝糖原含量極顯著降低（P＜0.01）。干預30 d 后，與M 組對比，D15、D30、D50 組小鼠的肝糖原含量皆明顯提高（P＜0.05）；隨著香葉木素劑量的提升，小鼠肝糖原積累量逐漸增多。

圖10 香葉木素對小鼠肝糖原含量的影響Fig.10 Effect of diosmetin on liver glycogen in mice

3.10 香葉木素對小鼠肝功能的影響

AST 和ALT 是衡量肝功能的重要標志物[1]。由圖11可見，與N 組對比，M 組小鼠血清中AST、ALT 活力極顯著升高（P＜0.01）。干預30 d 后，與M組對比，D15、D30、D50 組小鼠AST、ALT 活力皆明顯下降（P＜0.05）。小鼠ALT、AST 活力隨著香葉木素劑量的增大而減弱，顯示出較好的量效關系。香葉木素可以減弱Ⅱ型糖尿病小鼠血清AST、ALT 活力，降低小鼠肝臟指數（表6），提示其能夠緩解糖尿病小鼠的肝功能損傷。

圖11 香葉木素對小鼠肝功能相關酶活力的影響Fig.11 Effect of diosmetin on enzymes related to liver function in mice

3.11 香葉木素對小鼠抗氧化能力的影響 由圖12、13 可見，與N 組相比，M 組小鼠血清和肝臟中MDA 含量極顯著上升（P＜0.01），T-AOC 以及SOD、GSH-Px 活力極顯著降低（P＜0.01）。30 d 干預后，與M 組對比，D15、D30、D50 組小鼠肝臟和血清中T-AOC 明顯提升（P＜0.05），T-AOC 隨著香葉木素濃度的增大而升高；D30、D50 組小鼠血清和肝臟中MDA 含量均明顯低于M 組（P＜0.05），D15 組小鼠血清和肝臟中MDA 含量略低于M 組（P＞0.05），MDA 含量隨著香葉木素劑量的增大而變少；D30、D50 組小鼠血清和肝臟的抗氧化酶（SOD、GSH-Px）活力皆明顯高于M 組（P＜0.05），D15 組抗氧化酶活力略高于M 組。氧化應激與糖尿病緊密聯系[38]。當機體內血糖濃度過高時，會刺激組織細胞產生大量的活性氧（ROS），可能破壞胰島B 細胞功能，使胰島素分泌不足[38-39]。香葉木素有助于改善小鼠的氧化應激狀態，對于Ⅱ型糖尿病防治具有積極作用。

圖12 香葉木素對小鼠血清氧化應激指標的影響Fig.12 Effect of diosmetin on oxidative stress of serum in mice

圖13 香葉木素對小鼠肝臟氧化應激指標的影響Fig.13 Effect of diosmetin on oxidative stress of liver in mice

4 結論

本研究分析了香葉木素與α-葡萄糖苷酶的分子對接能力及其對α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的抑制活性，在此基礎上通過Ⅱ型糖尿病小鼠模型研究了香葉木素的降血糖活性，并探究了其對脂代謝、氧化應激等的效應。香葉木素干預30 d 后，糖尿病小鼠多食、多飲和體重減輕等病征得到緩解，同時，香葉木素還可降低小鼠的FBG 與GSP含量，緩解OGTT 異常與胰島素抵抗。MDA、TAOC 和SOD 等分析結果證明，香葉木素具有緩解糖尿病氧化應激的作用。TC 和HDL-C 等分析結果發現，香葉木素可以改善小鼠的脂代謝紊亂。肝臟指數和AST、ALT 分析結果顯示，香葉木素可以緩解Ⅱ型糖尿病引起的肝功能受損。綜上，香葉木素對Ⅱ型糖尿病小鼠具有較好的降血糖作用，但其具體機制尚需通過分子生物學實驗等進一步探究。