EDTA-2Na/Fe(Ⅱ)對自養生物體系下硝酸鹽還原過程的影響

張文勃,李曉玲,2*,劉心怡,張佳穎,周俊才,孟 雯,張鵬程

EDTA-2Na/Fe(Ⅱ)對自養生物體系下硝酸鹽還原過程的影響

張文勃1,李曉玲1,2*,劉心怡1,張佳穎1,周俊才1,孟 雯1,張鵬程1

(1.長安大學建筑工程學院,陜西 西安 710061；2.長安大學建筑工程學院,住建部給排水重點實驗室,陜西 西安 710054)

采用厭氧序批式生物膜反應器(ASBBR),以固定濃度的硝酸鹽和硫酸亞鐵為基質,按不同梯度條件添加EDTA-2Na,進行長時間的培養馴化,研究鐵鹽脫氮的啟動過程,同時探究不同EDTA-2Na/Fe(Ⅱ)對鐵自養反硝化過程以及硝酸鹽異化還原為銨(DNRA)的影響.結果表明:經過65d的培養馴化,反應器成功穩定運行.當EDTA-2Na/Fe(Ⅱ)<1.50時,反應器只進行鐵自養反硝化過程, NO3--N去除率最高僅為71.70%;當EDTA-2Na/Fe(Ⅱ)31.50時,反應器同時進行鐵自養反硝化與DNRA過程, NO3--N去除率最高為99.70%.值得注意的是,在EDTA-2Na/Fe(Ⅱ) =1.50時,鐵自養反硝化速率達到最大值1.63mg/(L·h)的同時,DNRA的產氨量也達到最大值9.75mg/L.Visual MINTEQ模擬結果表明:EDTA-2Na與Fe(Ⅱ)的摩爾比會影響進水中EDTA-2Na與Fe(Ⅱ)的存在形態,物質的量比越大,FeEDTA2-濃度越高,Fe(Ⅱ)的生物可利用性越強.通過對不同樣本進行微生物種群分析,發現優勢菌屬有Brucella、Castellaniella、Ochrobactrum、Pseudomonas、Citrobacter,前4種菌屬均與反硝化過程有關,Citrobacter菌屬與DNRA過程有關,且該菌屬只在EDTA-2Na/Fe(Ⅱ) =1.50和1.75兩個條件下出現.上述研究結果可為更深入探究DNRA與反硝化之間的作用關系提供參考.

厭氧序批式生物膜反應器(ASBBR)；鐵自養反硝化；硝酸鹽異化還原為銨(DNRA)；EDTA-2Na

近年來,鐵鹽脫氮技術由于其原料價格低廉、無二次污染等優點受到人們越來越多的關注[1],已有研究[2]在厭氧環境中觀察到以Fe(Ⅱ)為電子供體,將硝酸鹽還原為氮氣的化能自養型細菌.近年來, Robertson等[3]又在澳大利亞河口梯度下發現了可以基于Fe(Ⅱ)進行DNRA過程的細菌,該細菌可以直接利用Fe(Ⅱ)作為電子供體將硝酸鹽轉化為可供其他生物利用的銨鹽.

在自然環境中,Fe(Ⅱ)介導的化能自養型細菌與基于Fe(Ⅱ)進行DNRA過程的細菌存在協同競爭關系[4],其競爭機制主要受溫度、pH值、Fe(Ⅱ)濃度、硝酸鹽濃度及亞硝酸鹽濃度等環境因子影響[5],多數研究采用單一Fe(Ⅱ)作為基質,結果顯示鐵的利用效率很低[6-7],因而,如何提高微生物對含鐵物質的利用率這個問題逐漸受到重視.

EDTA是一種用途廣泛的螯合劑,具有較強的螯合作用和低毒性,能與Fe(Ⅱ)、Fe(III)等不同金屬離子形成穩定的配合物,可以在不損失其螯合性能的情況下有效回收再利用[8],許多研究人員[8-10]在各自的研究中均通過使用EDTA螯合Fe(Ⅱ)改善實驗效果.鑒于此,為了提高Fe(Ⅱ)在水中的保留率和生物利用度,改善Fe(Ⅱ)介導的微生物脫氮效果,本文將在基于Fe(Ⅱ)的自養脫氮體系中添加EDTA-2Na,探究不同EDTA-2Na添加量對鐵自養反硝化以及DNRA過程的影響,同時,定量分析Fe(Ⅱ)與EDTA在反應器中的存在形態,深入分析EDTA對微生物的影響.

1 材料與方法

1.1 實驗裝置

本實驗采用4個ASBBR反應器,均為玻璃燒杯搭建而成,內徑130mm,高度165mm,有效容積2L.反應器內懸掛移動床生物流化床填料(MBBR).反應器使用恒溫磁力攪拌器進行攪拌和溫度控制,轉速控制在350～400r/min,溫度保持在( 30±1)℃.實驗期間反應器應進行避光和密閉處理,防止可進行光合作用的微生物和藻類對實驗結果產生影響[11].在實驗開始前,將取自西安市第四污水處理廠的異養活性污泥在合適的水質條件下進行培養馴化,同時投加生物膜載體進行微生物掛膜,掛膜穩定后的生物膜載體供ASBBR反應器使用.

1.2 實驗用水

ASBBR反應器進水采用人工配制廢水,主要成分分別為NO3--N 40mg/L, Fe(Ⅱ) 480mg/L, KH2PO420.00mg/L, NaHCO3800.00mg/L, CaCl250.00mg/L, EDTA-2Na濃度隨反應階段變化.NO3--N、Fe(Ⅱ)和EDTA-2Na分別由NaNO3、FeSO4·7H2O和EDTA-2Na·2H2O提供,微量元素[12]1mL/L.使用1mol/L HCl和1mol/L NaOH控制進水pH值.實驗用水需提前通入氮氣15min,將溶解氧濃度降至0.05mg/L.

1.3 實驗方法

1.3.1 反應器的啟動與穩定運行 取若干掛膜穩定的生物膜載體,平均分給4個編號為A、B、C、D的ASBBR反應器.各反應器中Fe(Ⅱ)與NO3--N的物質的量比均取3,EDTA-2Na和Fe(Ⅱ)的物質的量比依次為0.75、1.00、1.50、1.75,具體投加量見表1.4個反應器同時連續運行105d,根據運行條件可以分為兩個階段,第一階段主要研究鐵(Ⅱ)介導下的硝酸鹽還原過程的啟動,水力停留時間由96h逐漸縮短至60h ,第二階段為穩定運行階段,水力停留時間控制在60h,兩個階段中進水pH值為(6.50±0.30).

表1 不同EDTA-2Na/Fe(Ⅱ)下的進水負荷

1.3.2 連續測定與取樣分析 各反應器安裝pH值、ORP和N2O探頭,連續測定反應器內pH值、ORP值以及N2O值的變化.每隔一段時間進行取樣,樣品需離心過濾處理,冷藏保存.

1.4 分析項目與方法

1.4.1 常規分析 NH4+-N采用納氏試劑分光光度法;NO2--N采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法;NO3--N采用紫外分光光度法;Fe(Ⅱ)采用鄰菲羅啉分光光度法[13];EDTA采用高效液相色譜法;pH值和DO使用德國Multi 3630IDS數字化便攜多參數水質分析儀監測,氧化還原電位(ORP)使用雷磁PHSJ－3F實驗室ORP計監測,溶解態N2O使用丹麥Unisense微電極系統測得(每10s讀取1個數據).

1.4.2 微生物群落分析 取各反應器穩定運行階段的生物樣品,采用Illumina MiSeq測序平臺對樣品中的微生物進行高通量測序分析,測序實驗流程包括:DNA提取、設計合成引物接頭、PCR擴增、Miseq文庫構建、Miseq測序[14].

1.4.3 計算方法 硝酸鹽去除效率(NRE)評價反應器的脫氮性能,其計算式為(1):

式中:i和e分別為進水和出水NO3--N濃度.

批次實驗中,對NO3--N降解過程進行線性擬合,通過式(2)計算NO3--N的降解速率.

式中:是每批實驗活性污泥的有效體積.

2 結果與討論

2.1 反應器啟動過程分析

圖1 反應器運行階段脫氮性能

如圖1所示,第4d測得各反應器出水NO3--N濃度基本為零,這是因為初始生物膜中攜帶少量有機物,同時大量反硝化菌利用體內有機物進行異養反硝化[15],故該階段稱之為內源代謝期.第9d污泥中的有機物消耗殆盡,出水NO3--N濃度明顯增加.而后進入適應期(10～64d),微生物逐漸適應自養環境,利用Fe(Ⅱ)進行硝酸鹽還原過程,出水NO3--N濃度逐漸減少.

65～105d為穩定運行階段,該階段各反應器出水NO3--N濃度基本保持不變.A,B,C,D4個反應器出水NO3--N最高去除率依次為47.85%,71.70%,99.53%, 99.70%.該階段后期,生物膜載體出現紅褐色附著物,附著量與EDTA-2Na添加量成反比,推測可能是菌體為紅褐色的細菌.

2.2 EDTA-2Na/Fe(Ⅱ)對脫氮過程的影響

2.2.1 EDTA-2Na/Fe(Ⅱ)對反硝化的影響 在穩定階段,不同EDTA-2Na/Fe(Ⅱ)的鐵自養反硝化過程均已占據主導地位,其在一個周期內各種氮素隨時間的變化如圖2所示.在EDTA-2Na/Fe(Ⅱ)等于0.75、1.00、1.50和1.75四種條件下,出水NO3--N濃度均表現為先快速減小然后緩慢減小最后趨于穩定,NO3--N的最大降解速率依次為0.73,0.76, 1.63,1.62mg/(L·h),NO3--N最高去除率逐漸增大, 由此說明在一定范圍內, EDTA-2Na/Fe(Ⅱ)增大有利于NO3--N的去除,EDTA-2Na/Fe(Ⅱ)=1.75為 NO3--N完全轉化為N2的最優比例.

如圖2所示,當EDTA-2Na/Fe(Ⅱ)等于0.75、1.00、1.50和1.75時,NO2--N的最大積累量依次為3.64,4.70,19.60,27.35mg/L,尤其是當EDTA- 2Na/Fe (Ⅱ)從1.50增加到1.75時,NO3--N的降解速率保持不變, 但NO2--N的最大積累量從19.60增加至27.35mg/L,這說明EDTA-2Na的加入會導致反應過程中NO2--N大量積累.在亞硝酸鹽反硝化過程中, NO2--N首先轉化為NO,然后轉化為N2O,最后轉化為N2[16].觀察圖2(c)(d)發現, EDTA-2Na導致NO2--N大量積累的同時,也會導致N2O大量積累.

2.2.2 EDTA-2Na/Fe(Ⅱ)對DNRA的影響 如圖2(a)(b)所示,當EDTA-2Na/Fe(Ⅱ)等于0.75與1.00時,整個脫氮階段反應器出水均未檢測到NH4+-N,當增加EDTA-2Na/Fe(Ⅱ)為1.50時,發現在12～30h時反應器出水開始快速積累NH4+-N,積累量高達9.747mg/L,說明當EDTA-2Na/Fe(Ⅱ)=1.50時,反應體系中Fe(Ⅱ)的生物可利用性以及Fe(Ⅱ)與電子供體NO3--N和NO2--N的比例均有利于DNRA過程發生,然而當繼續增加EDTA-2Na/Fe(Ⅱ)為1.75時,卻發現NH4+-N積累量降至4.08mg/L,這與Li等[9]在研究EDTA-2Na對厭氧氨氧化過程的影響時發現的現象類似.Roberts等[17]認為添加高含量的Fe(Ⅱ)時會大大抑制反硝化作用,促進DNRA過程,因此理論上,EDTA-2Na越多,作為電子供體的可生物利用的Fe(Ⅱ)就會越多,DNRA現象越顯著,然而本實驗結果并不如此,推測可能是因為:過多的EDTA-2Na可能會產生許多在相關EDTA離子中具有最強螯合能力的EDTA4-,根據Henneken等[18]的研究,EDTA4-會對微生物的脂多糖產生負面作用,是對微生物最具毒性的EDTA離子.

表2 不同EDTA-2Na/Fe(Ⅱ)下EDTA與Fe(Ⅱ)存在形態模擬

2.3 Visual MINTEQ分析

表2中是不同EDTA-2Na/Fe(Ⅱ)下通過Visual MINTEQ 3.1模擬的EDTA和Fe(Ⅱ)主要存在形態及其濃度變化.在比例為0和0.75的條件下,非EDTA螯合鐵(Fe(OH)2、Fe(OH)3-、FeOH+和FeSO4)的濃度明顯高于其他比例,隨著EDTA-2Na/Fe(Ⅱ)的增加,鐵與EDTA的絡合反應將伴隨一系列復雜的副反應,各類非EDTA螯合鐵的形成會阻礙絡合反應的進行,同時絡合反應的產物FeEDTA2-也會發生各種副反應,如酸性絡合物FeHEDTA-和堿性絡合物FeOHEDTA3-的形成.如表2所示,非EDTA螯合鐵的濃度在比例為1.5和1.75時相差不大,在比例為1.0時比前者大102左右.此外,FeEDTA2-、FeHEDTA-和FeOHEDTA3-的濃度均與EDTA- 2Na/Fe(Ⅱ)成正比關系,說明EDTA-2Na增加有利于EDTA與Fe(Ⅱ)絡合.EDTA4-、H2EDTA2-和HEDTA3-的濃度在比例為1.5和1.75之間增加了近1倍,據報道[18],當EDTA濃度高于9.6mmol/L時,微生物的生長速率會下降,這印證了2.2.2中的推測.

2.4 不同EDTA-2Na/Fe(Ⅱ)下pH值變化特征

圖3 不同EDTA-2Na/Fe(Ⅱ)下pH值的變化

由圖3可知,4組不同EDTA-2Na/Fe(Ⅱ)實驗的初始pH值皆控制在(6.50±0.30),因為Fe(Ⅱ)在偏酸性環境下更容易與EDTA-2Na形成螯合物.根據反應式(3)可知,鐵自養反硝化是一個產酸的過程[19],因此理論上pH值是隨著反應進行逐漸減小,然而圖3中4種條件下pH值均為緩慢增加,并且當EDTA- 2Na/Fe(Ⅱ)=1.75時,pH值的增加幅度變大,說明這種現象很大可能是EDTA-2Na引起的.因為EDTA- 2Na的加入導致反應最終產物由Fe(OH)3變為可溶性的FeEDTA-,值得注意的是,此變化減小了Fe(OH)3附著微生物細胞表面產生的鈍化影響,促進了細胞對Fe(Ⅱ)的吸收.考慮到反應產物為可溶性的FeEDTA-,故可加入單質鐵使其還原為FeEDTA2-作為反應物循環利用.

2.5 不同EDTA-2Na/Fe(Ⅱ)下ORP的變化特征

如圖4所示, 0～12h內各反應器ORP基本一致,且都不斷增加,表明在此階段各反應器中正在進行硝酸鹽還原過程,Fe(Ⅱ)正在被快速利用.在EDTA-2Na/Fe(Ⅱ)等于0.75和1.00的條件下,12～ 60h時ORP繼續增加,因為根據圖2(a)(b)所示,該時間段內系統只進行鐵自養反硝化過程,NO3--N被還原為N2.同時由于EDTA-2Na添加量不足, Fe(Ⅱ)會隨著pH值的增加逐漸形成氫氧

圖4 不同EDTA-2Na/Fe(Ⅱ)下ORP的變化

化亞鐵沉淀,因此, ORP總體上呈現上升態勢.在EDTA-2Na/Fe(Ⅱ)等于1.50的條件下,12～60h時ORP由-81mV快速減小至-160mV,表現與前者截然不同,因為根據圖2(c)所示,在該時間段內系統正在進行DNRA過程,NO3--N被異化還原成NH4+-N,反應器ORP快速減小.同樣,在EDTA-2Na/Fe(Ⅱ)等于1.75的條件下,30～60h內系統亦進行DNRA過程,導致ORP由-24mV緩慢減小至-53mV,由此可見,ORP對系統的反應進程和反應類型均有一定的指示作用.劉雙等[20]和張鵬程等[21]在研究COD:N:S對DNRA過程的影響時發現,只有當初始ORP在-400mV以下時,才有明顯的DNRA現象,本文中當初始ORP等于-160mV時系統內出現DNRA現象,表明EDTA-2Na可以使得DNRA過程在較高的ORP環境下發生.

2.6 微生物群落分析

提取A、B、C、D號反應器穩定后微生物樣品的DNA,采用16SrRNA高通量測序技術,在屬水平上對微生物進行群落結構分析.不同EDTA-2Na/ Fe(Ⅱ)下微生物群落豐度變化如圖5所示,4種不同條件下樣本中微生物種群主要以Brucella、Castellaniella、Ochrobactrum、Pseudomonas為主,根據高峰等[22]和駱靈喜等[23]研究發現,這4種菌屬都具有與反硝化過程有關的、和功能基因, Brucella菌屬在EDTA-2Na/Fe(Ⅱ)=0.75、1.00、1.50、1.75下所占微生物比重依次為38.02%、24.15%、76.79%、47.72%,表明該菌屬在鐵自養反硝化過程起主導作用,且EDTA-2Na/ Fe(Ⅱ)=1.50的條件最適合其生存.

另外, Pseudomona在EDTA-2Na/Fe(Ⅱ)=0.75、1.00、1.50、1.75下所占微生物比重分別為9.54%、2.88%、0、0,由此可見隨著EDTA-2Na添加量的增加,對該菌屬活性的抑制持續增強.Ochrobactrum與Castellaniella菌屬在EDTA-2Na/ Fe(Ⅱ)等于0.75與1.00條件下未發現,在EDTA-2Na/ Fe(Ⅱ)=1.50條件下占微生物比重分別為0.11%、7.91%,在EDTA- 2Na/ Fe(Ⅱ)等于1.75條件下占微生物比重分別為11.67%、30.36%,表明EDTA-2Na添加量越大,這兩種菌屬占比越大,對鐵自養反硝化的貢獻越大.

在EDTA-2Na/Fe(Ⅱ)=1.50和1.75時, Citrobacter菌屬占比分別為4.10%、0.73%,根據李倩霞等[24]研究,Citrobacter菌屬具有與DNRA過程有關的功能基因,這也印證了圖2(c)、(d)中NH4+-N的積累與Citrobacter菌屬進行DNRA過程有關.

圖5 微生物在屬級水平上的相對豐度

A～D組為反應器編號,Origin為反應器初始污泥

3 結論

3.1 EDTA-2Na/Fe(Ⅱ)增大有利于FeEDTA2-的形成,提高Fe(Ⅱ)的生物可利用性,提高NO3--N去除率,但當該比例從1.5增至1.75時,反應副產物EDTA4-對微生物抑制嚴重, NO3--N去除率逐漸降低.

3.2 ORP對系統的反應進程和反應類型均有一定的指示作用.當發生反硝化過程時ORP會逐漸升高,而發生DNRA過程時ORP會逐漸降低. EDTA-2Na可降低DNRA發生所需ORP,提高DNRA在較高ORP條件下的出現幾率.

3.3 系統優勢菌屬主要有Brucella、Castellaniella、Ochrobactrum、Pseudomonas、Citrobacter,其中前4種細菌的存在表明反應體系中存在鐵自養反硝化,而后一種細菌則與DNRA過程有關.

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Effect of EDTA-2Na/Fe(Ⅱ) on nitrate reduction in autotrophic biological system.

ZHANG Wen-bo1, LI Xiao-ling1,2*, LIU Xin-yi1, ZHANG Jia-ying1, ZHOU Jun-cai1, MENG Wen1, ZHANG Peng-cheng1

(1.School of Civil Engineering, Chang’an University, Xi’an 710061, China；2.Key Laboratory of Water Supply & Sewage Engineering, Ministry of Housing and Urban-Rural Development, School of Civil Engineering, Chang’an University, Xi’an 710054, China)., 2022,42(7)：3149～3155

The initiation of iron mediated denitrification was studied in an anaerobic sequenced batch biofilm reactor (ASBBR) with a fixed concentration of nitrate and ferrous sulfate, supplemented with EDTA-2Na according to different gradient conditions for a long period of cultivation domestication. Meanwhile, the effects of different EDTA-2Na/Fe(Ⅱ) on iron autotrophic denitrification process and the dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) were also explored in this study. The results showed that after 65days of cultivation and domestication, the reactor operated successfully and stably, and the removal rate of NO3--N was up to 99.70%. When EDTA-2Na/Fe(Ⅱ) < 1.50, only iron autotrophic denitrification was performed with the highest removal rate of NO3--N of 71.70%; When EDTA-2Na/Fe(Ⅱ)31.50, iron autotrophic denitrification and DNRA were carried out simultaneously in the reactor, and the highest removal rate of NO3--N was 99.70%. It was worth noting that when EDTA-2Na/Fe(Ⅱ)=1.50, the iron autotrophic denitrification rate reached the maximum value of 1.63mg/(L·h), and the ammonia production of DNRA also reached the maximum value of 9.75mg/L. Visual MINTEQ simulation results showed that the molar ratio of EDTA-2Na to Fe (Ⅱ) affected the existing forms of EDTA-2Na and Fe (Ⅱ) in the influent. The larger the molar ratio, the higher the concentration of FeEDTA2-and the stronger the bioavailability of Fe (Ⅱ). Through microbial population analysis, it was found that the dominant bacteria were Brucella, Castellaniella, Ochrobactrum, Pseudomonas as well as Citrobacter. Among them the first four bacteria were related to denitrification process, while Citrobacter was related to DNRA process and was only appeared under the conditions of EDTA-2Na/Fe(Ⅱ)=1.50 and 1.75 in this research. Therefore, the above results could throw light on further exploring the relationship between DNRA and denitrification.

ASBBR；iron autotrophic denitrification；dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA)；EDTA-2Na

X703

A

1000-6923(2022)07-3149-07

張文勃(1997-),男,陜西寶雞人,長安大學建筑工程學院碩士研究生,主要研究方向為污水脫氮及污泥資源化.發表論文1篇.

2021-12-20

陜西省自然科學基金(2019JQ-686);中央高?；?300102282104)

* 責任作者, 副教授, lixiaoling20030327@126.com