基于絲素蛋白微球的可注射膠體凝膠的制備

錢坤煜, 薛敬哲, 陳 勝, 陸 楊

(合肥工業大學 化學與化工學院,安徽 合肥 230009)

由生物高分子制備的微球是一種可負載藥物和實現藥物緩釋的載體[1-2]。絲素蛋白提取自桑蠶蠶繭,與其他材料相比具有炎癥反應低、生物相容性好[3]、機械性能優越等優點[4]?；诮z素蛋白制備的微球可以高效地負載生物活性分子,已經廣泛用于藥物緩釋[5]、酶固定化[6]等領域。絲素蛋白微球(silk fibroin microspheres,SFMs)的合成方法主要有乳化法[7]、自組裝法[8]、微流控技術[9]等。與其他合成方法相比,乳化法裝置較簡單,無需有毒溶劑,且有利于保持所負載生物分子的活性。在最近的報道中,絲素蛋白水溶液可以在聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)乳化作用下快速形成微球,并實現微球尺寸的調控[7]。但是該乳化法得到的產物粒徑較大,基于該方法進行改進優化有望實現較小尺寸的絲素蛋白微球的可控制備。

水凝膠目前是一種受到廣泛關注的生物材料,已經廣泛應用于組織工程、腫瘤治療等生物醫學領域。絲素蛋白可以通過升溫、調節pH值、加入化學交聯劑等方法制備成水凝膠,但是所制備凝膠的注射性較差[3]。與常規的聚合物凝膠相比,膠體凝膠是一種具有優異的可注射性的生物材料,具有良好的黏彈性。膠體凝膠是由分散的膠體粒子組成的,膠體粒子之間通過可逆的、非共價交聯的作用力自組裝形成非均相微粒網絡。功能性的微納米粒子作為構筑單元可以制備出具有多種功能性的可注射性膠體凝膠[10],為絲素蛋白凝膠的制備提供新方案。本文基于前期對膠體凝膠和絲素蛋白的研究,使用PEG乳化后再冷凍的改進方法,并通過調節PEG和絲素蛋白的質量濃度實現了250～400 nm尺寸的絲素蛋白微球的制備。進一步通過與帶有相反電荷的明膠粒子在中性pH值條件下混合,利用靜電作用力交聯形成具有優異的可注射性的絲素蛋白膠體凝膠。

1 實驗部分

1.1 主要試劑與儀器

無水碳酸鈉購自國藥集團;溴化鋰,聚乙二醇(20、10、4 kDa)購自Aladdin。

采用卡爾蔡司Merlin Compact場發射掃描電子顯微鏡(field emission scanning electron microscope,FESEM)分析樣品的形貌結構;采用馬爾文ZS90型Zeta電位儀進行電位分析;采用Instron5695型萬能力學試驗機進行注射性評價。

1.2 實驗過程

1.2.1 絲素蛋白溶液的制備

無水碳酸鈉對蠶繭脫膠處理后,使用溴化鋰溶液(9.3 mol/L)溶解干燥的蠶絲,并通過去離子水透析除雜獲得絲素蛋白水溶液。微球的合成需要質量濃度為120 g/L的絲素蛋白溶液,因此需要將上述絲素蛋白溶液裝入透析袋(分子量3 500),在PEG溶液(10 kDa,100 g/L)中透析濃縮。透析袋內絲素蛋白溶液體積減少至1/2左右時取出,即獲得高質量濃度的絲素蛋白溶液。絲素蛋白溶液在4 ℃ 冰箱中保存,并利用干燥稱重法測定準確質量濃度。

1.2.2 絲素蛋白微球的可控制備

采用改進的PEG乳化法制備絲素蛋白微球。取 2 mL一定質量濃度的絲素蛋白溶液放置在磁力攪拌器上,緩慢攪拌(100 r/min)的同時滴加等體積的PEG溶液進行乳化?；旌虾笤贁嚢?0 s左右,待其充分混勻后放入冰箱冷凍室處理48 h。冷凍處理結束后,將小玻璃瓶取出在室溫下解凍,并離心洗滌3次即可獲得絲素蛋白微球。研究PEG溶液質量濃度對絲素蛋白的調控時,絲素蛋白溶液質量濃度為60 g/L,PEG分子量為10 kDa,分別配制質量濃度為200、300、500 g/L的3組PEG溶液進行合成。研究絲素蛋白溶液質量濃度對絲素蛋白微球的調控時,PEG分子量為10 kDa,質量濃度為300 g/L,分別使用質量濃度為20、60、80、120 g/L的4組絲素蛋白溶液進行合成。通過FESEM對各組微球的形貌和尺寸進行觀察。

1.2.3 絲素蛋白微球明膠粒子膠體凝膠的合成

根據文獻[11]報道的兩步去溶劑法制備明膠粒子。分別稱取一定量的絲素蛋白微球凍干粉末和明膠粒子凍干粉末,分散在去離子水中配制成質量濃度為100、150、200 g/L的水溶液。使用Malvern Zetasizer Nano ZS90 Zeta電位分析儀對不同pH值下絲素蛋白微球和明膠粒子水溶液的Zeta電位進行測試。將1 mL上述制備的絲素蛋白微球溶液與等體積、等質量濃度的明膠粒子溶液混合,使用渦旋混合機充分混勻即獲得膠體凝膠。使用萬能力學實驗機搭載自制支架對絲素蛋白微球明膠粒子膠體凝膠的可注射性進行定量測試[12]。將合成好的膠體凝膠放在冷凍干燥機(Labconco, FreeZone6)中凍干,通過場發射掃描電子顯微鏡對凍干的樣品微觀形貌進行觀察。

2 結果與討論

2.1 絲素蛋白微球的調控和形貌表征

2.1.1 PEG質量濃度對絲素蛋白微球的調控

在乳化法制備絲蛋白微球的過程中,PEG溶液可以作為乳化劑。當PEG溶液滴入緩慢攪拌的絲素蛋白溶液中時,溶液會逐漸變白,即乳化的過程。當絲素蛋白溶液質量濃度為60 g/L,冷凍處理的時間為48 h,PEG分子量為10 kDa時,不同PEG溶液質量濃度下所得的產物的FESEM圖像如圖1所示。

由圖1可知，當PEG溶液質量濃度較低時(200 g/L)制備出的是粘連的凝膠;當PEG溶液質量濃度達到300 g/L時,逐漸開始形成微球,尺寸為400～600 nm。但是球與球中間存在一些絲狀物粘連,可能是由于乳化不夠徹底;當PEG溶液質量濃度達到500 g/L時,合成的微球尺寸較小,為250～400 nm,且大小比較均勻。由上述實驗結果可以得出如下結論:在一定的質量濃度范圍內,PEG溶液的質量濃度越高,乳化的效果越好,有利于形成微球;PEG質量濃度太低則無法獲得單分散的微球結構。在進一步研究絲素蛋白溶液質量濃度對微球形貌和尺寸的影響時,選擇PEG溶液的質量濃度為500 g/L。

圖1 不同PEG溶液質量濃度下合成的絲素蛋白微球的FESEM圖像

2.1.2 絲素蛋白質量濃度對絲素蛋白微球的調控

不同絲素蛋白溶液質量濃度下，合成的絲素蛋白微球的FESEM圖像如圖2所示。

圖2 不同溶液質量濃度下合成的絲素蛋白微球的FESEM圖像

作為微球生長合成過程中的前驅體溶液,絲素蛋白溶液的質量濃度對合成的微球形貌與尺寸有明顯影響。

當研究絲素蛋白質量濃度的影響時,選取的PEG(10 kDa)溶液的質量濃度為500 g/L,冷凍處理的時間為48 h。當絲素蛋白溶液質量濃度較低時(20 g/L),無法使絲素蛋白溶液形成微球(圖2a),此時形成的是相互交聯的絲素蛋白網絡;當質量濃度達到60 g/L時,形成單分散的絲素蛋白微球(圖2b),尺寸為250 ～ 400 nm;當絲素蛋白溶液質量濃度達到80 g/L時,微球的尺寸逐漸開始變大(圖2c),大部分絲素蛋白微球的尺寸為500～800 nm;當絲素蛋白的質量濃度達到120 g/L時,所合成的微球尺寸已經達到微米級(圖2d),為1 ～ 2 μm,且表面較光滑,但是尺寸分布非常不均勻。

由上述實驗結果可以得出如下結論:絲素蛋白質量濃度過低時無法形成微球,而隨著絲素蛋白溶液質量濃度的增加,乳化效果更好,所合成的微球的尺寸顯著增加,表面也更加光滑。

2.2 絲素蛋白微球和明膠粒子的電位分析

當2種帶電粒子帶有相反的電荷時,在合適的條件下進行混合，可以在靜電作用力下形成穩定的膠體凝膠。不同pH值條件下粒子的表面電荷會發生改變,在pH值為5～10的范圍內絲素蛋白微球和明膠粒子的Zeta電位值結果如圖3所示。由圖3可知，絲素蛋白微球(圖1c中所制備的250～400 nm SFMs)在pH值為6～10的范圍內帶有較強的負電荷;明膠粒子在pH值為9～10之間發生了電位翻轉,由負電荷轉變成正電荷,且電位值隨著pH值的下降顯著增長。在溶液pH值為5 ～ 9的范圍內,絲素蛋白微球和明膠粒子帶有相反的電荷。

圖3 不同pH值下絲素蛋白微球和明膠粒子的Zeta電位值

2.3 絲素蛋白微球明膠粒子膠體凝膠的合成

基于對絲素蛋白微球和明膠2種粒子Zeta電位的測量,并且考慮到所制備的凝膠的生物用途,選擇在中性pH值條件下將分別帶相反電荷的2種粒子混合。此時,絲素蛋白微球表面為負電荷,明膠粒子所帶的是正電荷,2種粒子在靜電作用力下可以形成穩定的顆粒凝膠網絡。其合成過程如圖4所示,需將2種粒子的水溶液渦旋混勻,最終形成凝膠。

絲素蛋白微球-明膠粒子膠體凝膠合成實物及其FESEM圖像如圖5所示。

由圖5a可以看出，當2種粒子水溶液剛混合時,此時由于2種膠體粒子還沒有混合均勻,仍具有流動性。

混合溶液經過渦旋均勻之后所合成的產物如圖5b、圖5c所示,從圖5b、圖5c可以看出，倒置或者斜置時能長時間保持形態,明顯失去了流動性,從而證明已經成功制備出膠體凝膠。

凍干凝膠在FESEM下的微觀形貌如圖5d所示,由圖5d可知凝膠結構是由膠體粒子交聯形成的。

圖4 絲素蛋白微球-明膠粒子膠體凝膠合成過程

圖5 絲素蛋白微球-明膠粒子膠體凝膠合成實物和FESEM圖像

2.4 膠體凝膠的注射性評價

絲素蛋白微球-明膠粒子膠體凝膠的注射性評價結果如圖6所示。

圖6c～圖6e所示為粒子凝膠制備時，固體顆粒在水溶液中質量濃度分別為100、150、200 g/L的注射率-荷載關系。因為由微球和明膠粒子組成的膠體凝膠相對于傳統的聚合物網絡凝膠體系具有顯著的剪切變稀的優勢(圖6a),所以該絲蛋白膠體凝膠可以從注射器中推注出來,即具有良好的可注射性(圖6b)。

為了進行定量表征,將絲蛋白膠體凝膠移入1 mL注射器中,然后將注射器固定在自制的載樣支架上。注射器的上端緊貼在Instron萬能力學試驗機的上壓盤,確保啟動壓縮模式測試時凝膠可以從注射器中被勻速擠壓出,并測試擠出過程中的壓力,可以反饋膠體凝膠的注射過程。100、150、200 g/L 3個質量濃度的膠體凝膠從注射器中全部擠出前所需要施加的注射力基本保持恒定,未出現顯著的相分離和堵塞(圖6c～圖6e),都表現出良好的可注射性。

圖6 絲素蛋白微球-明膠粒子膠體凝膠的注射性評價

3 結 論

本文采用改良的PEG乳化法合成了一系列不同尺寸的絲素蛋白微球。FESEM表征結果表明,通過調節絲素蛋白溶液質量濃度和PEG溶液質量濃度可以實現對絲素蛋白微球形貌與尺寸可控合成。制備小尺寸的絲素蛋白微球的優化合成條件為60 g/L的絲素蛋白溶液質量濃度和500 g/L的PEG(10 kDa)溶液質量濃度,冷凍處理的時間為48 h。在中性pH值溶液中帶有正電荷的明膠粒子和帶有負電荷的絲素蛋白溶液混合均勻后通過靜電作用力形成可注射的膠體凝膠。

同時,絲素蛋白和明膠都是良好的藥物載體,在構筑單元膠體粒子上通過物理吸附[10]負載抗腫瘤藥物,可以制備出載藥的膠體凝膠。因為具有良好的可注射性和體系可擴展性,所以該粒子凝膠有望用于腫瘤微環境的響應性藥物釋放。