肉桂精油抑制腸出血性大腸桿菌O157∶H7活性研究

費瑩瑩，張珍，陳雪琴，李雯

(甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州，730070)

腸出血性大腸桿菌O157∶H7(EnterohemorrhagicEscherichiacoli157∶H7, EHEC O157)是全球范圍內食物中毒及引發傳染病重要原因之一，可引發出血性結腸炎(hemorrhagic enteritis，HC)、溶血性尿毒綜合癥(heomlytic uremic syndrome，HUS)以及血小板減少性紫癜(thrombocytopenia purpura，TTP)等嚴重病癥，它能夠產生大量的毒力因子，增強宿主定殖能力，使其菌體可以快速地定殖并且在表面進行傳播[1-3]。由于EHEC O157病情兇險且死亡率高，已引起各國政府、世界衛生組織以及研機機構的高度重視，成為全球性的公共衛生問題[4-5]。

肉桂精油(cinnamon essential oil)其主成分為肉桂醛、反式肉桂醛、萜品烯、β-欖香烯等，這些成分具有良好的抗菌效果。許國娟等[6]研究表明將肉桂醛封裝在水包油納米乳液中，發現制備的納米乳劑對指狀青霉有抑制作用，對柑橘類水果采后的貨架期也有影響；崔喬等[7]以肉桂醛為研究對象添加在羔羊飼料中，研究發現飼糧中添加適量的肉桂醛在羔羊生產中具有積極的意義，可以提高平均日增重，降低料重比，促進飼糧營養物質的消化利用以及羔羊瘤胃中瘤胃微生物蛋白的合成，并可提高羔羊對能量及氮的利用率。有研究表明山蒼子精油或檸檬醛與其他食用精油結合使用，制備得到的復合油可以對新鮮肉制品以及果蔬起到很好的防腐保鮮效果[8-10]。

本研究擬以探究肉桂精油對EHEC O157的呼吸作用的影響，初步明確肉桂精油的作用位點，希望可以減少由EHEC O157引起的衛生安全事件，同時為天然抗菌劑的開發提供部分有效的理論依據[11-12]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

肉桂精油購于上海源葉生物公司;EHEC O157取自甘肅省疾控中心。

1.2 試驗試劑

無水乙醇、胰酪胨大豆肉湯(TSB-YE)、LB肉湯、LB瓊脂、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、吐溫-80、氯化鉀、氯化鈉、磷酸氫二鈉、硫酸鎂、β-巰基乙醇、正十六烷(均為分析純)、BCA法蛋白含量測定試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量試劑盒、琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase，SDH)活性檢測試劑盒，上海優選生物科技有限公司。

1.3 儀器與設備

DSX-280B手提式壓力蒸汽滅菌器，上海申安有限公司；THZ-83A水浴恒溫振蕩器，金壇市江南儀器廠；JY92-ⅡDN超聲波細胞粉碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；H-1850R臺式高速冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；UV-2550紫外可見分光光度計，日本Shimadzu公司；SCIENTZ-10 ND恒溫攪拌水浴鍋，寧波新芝凍干設備股份有限公司；FA1004分析天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；雷磁PHS-25型PH計，上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 肉桂精油主要化學組分和含量

因為肉桂種植廣泛且精油提取方式眾多，不同來源的肉桂在主要組成成分上存在一定差異。因此在對肉桂精油對EHEC O157的抗菌活性及抗菌機制進行研究前，本課題對試驗所用肉桂精油主要組分進行了分離鑒定。

1.4.2 最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)和最小抑菌圈

本試驗采用雙層瓊脂孔穴擴散法[13]測定肉桂精油對EHEC O157的MIC，以EHEC O157為靶標菌，將靶標菌接種到LB液體培養基中，37 ℃振動培養24 h，使菌懸液濃度達到OD600=2.0，備用。將滅菌過的LB固體培養基15 mL傾倒至滅菌過干燥的培養皿中，等凝固形成底層并放置無菌牛津杯，吸取200 μL的靶標菌液加入溫度不燙手且未凝固的無菌LB固體培養基中，振蕩搖勻，傾倒25 mL至平皿中，待凝固形成上層，取出牛津杯形成有孔穴的培養平板，在已形成的孔穴中加入肉桂精油。將培養平板至于37 ℃的培養箱中恒溫培養24 h，觀察肉桂精油的抑菌效果。

1.4.3 細胞內核酸與蛋白質的泄漏

參照HUANG等[14]的測定方法，對肉桂精油處理后的細胞內大分子物質泄漏進行測定。取處于生長對數期的EHEC O157，6 000 r/min離心10 min，菌體沉淀用無菌PBS進行清洗3次以上，得到干凈的菌體沉淀,用無菌PBS(0.03 mol/L，pH 7.2)重懸至OD600=0.8。肉桂精油用無水乙醇溶解，加入菌懸液中使肉桂精油質量濃度梯度分別為0.000 2、0.000 4、0.000 8 g/L，添加等量無水乙醇作為空白對照，37 ℃恒溫振蕩培養，期間每隔2 h分別測1次OD260nm值和OD280nm值。

1.4.4 BCA法蛋白定量測試盒測定蛋白含量

采用BCA法蛋白定量測試盒進行蛋白含量的測定[15]。取處于對數生長期的EHEC O157菌液5 mL，4 000 r/min離心10 min，菌體沉淀用無菌PBS進行清洗，得到的菌體沉淀重懸于無菌LB培養基中，使菌體濃度達到OD600nm=2.0。將重懸后的菌懸液分為2組，試驗組肉桂精油用無水乙醇溶解，加入菌懸液中使肉桂精油濃度梯度分別為1/2MIC、MIC，對照組加入無水乙醇，所有樣品在37 ℃培養4 h。取1 mL菌懸液，4 ℃ 4 000 r/min離心10 min，沉淀用無菌PBS清洗3次以上，得到的菌體沉淀重懸于無菌PBS中，冰浴破胞(300 W，10 min，間隔1.1 s)待測。根據BCA蛋白定量測試盒方法，用酶標儀在526 nm處測吸光度值并記錄。

1.4.5 堿性蛋白酶活性測定[16]

參照堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)試劑盒的方法，菌體前處理與蛋白定量測定相同，菌懸液培養4 h后，4 ℃ 6 000 r/min離心10 min去上清液，得到的下層沉淀細胞懸于500 μL熱雙蒸水中，置于沸水浴中10 min加熱破胞，將上述處理好的菌懸液用渦旋振蕩器充分混勻。根據AKP試劑盒的方法，用酶標儀在520 nm處測吸光度值并記錄。AKP存在細菌壁和細胞膜之間，如果其活性受到抑制，可以間接地證明細胞壁受損傷。

1.4.6 SDH活性測定[17]

參照SDH活性試劑盒的方法，菌體前處理與堿性蛋白酶測定處理方法相同，各組樣品經過超聲破胞后，最后按照試劑盒上的方法，用酶標儀在600 nm處測吸光度值并記錄。

1.5 數據處理與分析

使用IBM SPSS Statistics 22和Origin 2018軟件對實驗數據進行統計學處理與作圖分析，誤差線表示為平均值±標準差(SD)。所有試驗均重復3次取平均值。

2 結果與分析

2.1 肉桂精油主要化學組分及含量

肉桂精油進行GC-MS分析，對前7種化合物進行了鑒定(表1)，這7種化合物包含醛類(肉桂醛50.17%，枯茗醛1.238%)；烯類[(-)-α-蓽橙茄油烯16.57%，β-欖香烯9.39%，α-衣蘭油烯5.22%，(+)-環苜蓿烯2.11%]以及酚類化合物(小茴香酚1.61%)，占肉桂精油總成分的86.308%。在肉桂精油組分中占比最大的是肉桂醛，已被證明具有較強的抗菌活性，在食品及醫學等領域具有廣泛的應用。除此之外，研究發現烯類化合物可以改變細胞表面電荷[18]，抑制微生物的生長。因此可以推測肉桂精油的抗菌活性來源于多種組分之間的協同抗菌，對闡明其抗菌機制具有重要意義[18]。

表1 肉桂精油主要化學組分及含量Table 1 Main chemical components and contents of cinnamon essential oil

2.2 MIC和最小抑菌圈

肉桂精油對EHEC O157的生長有影響，如圖1所示，其中A為空白對照組，B為肉桂精油處理組，從圖1-B可看出肉桂精油對EHEC O157有一定的抑制作用，通過測量可知所形成的抑菌圈的最小直徑為20 mm，相對應肉桂精油的MIC值為0.000 4 g/L。

A-CK組；B-處理組圖1 肉桂精油對EHEC O157的抑制作用Fig.1 Inhibition of cinnamon essential oil on EHEC O157

2.3 EHEC O157胞內大分子物質泄露的分析

由圖2可知，肉桂精油處理組的OD260nm和OD280nm值均顯著增大，這說明肉桂精油會影響EHEC O157細胞膜通透性，致使胞內大分子核酸和蛋白質泄漏，與空白組對比，1/2MIC濃度的肉桂精油處理2 h后，核酸泄漏量(OD260nm值)和蛋白質泄漏(OD280nm值)分別提高了3.88、1.25倍。核酸及蛋白質的泄漏量都與精油的添加量呈正相關，并且隨著精油添加量的增加，OD260nm值和OD280nm值都明顯增大。當肉桂精油處理菌液至8 h時，對照空白組，3個不同濃度處理組(1/2MIC、MIC、2MIC)，核酸泄漏量分別增加了1.87、3.1.3、3.67倍；蛋白質泄漏分別增加了1.41、2.10、2.57倍。進一步證明，當肉桂精油處理EHEC O157時，能夠作用于細胞膜，從而破壞EHEC O157細胞內環境的穩定，導致胞內大分子物質核酸和蛋白質的泄漏，最終引起菌體衰敗死亡[19]。

A-核酸；B-蛋白質圖2 肉桂精油對EHEC O157胞內大分子物質泄漏的影響Fig.2 Effects of cinnamon essential oil on intracellular macromolecule leakage of EHEC O157

2.4 肉桂精油對EHEC O157蛋白合成能力的影響

蛋白質是菌體維持正常生命活動所需的必要物質基礎，如果菌體合成蛋白的能力受到抑制，就會影響正常生命代謝活動，最終會導致菌體的衰敗死亡。如圖3所示，隨著肉桂精油濃度的增加和處理時間的延長，菌體合成蛋白的能力受到比較明顯的抑制，例如，當精油濃度為1/2MIC且處理時長到4 h時，對照空白組，菌液中蛋白的含量下降為(1.07±0.02)μg/mL，與此同時，MIC處理組菌液中蛋白質含量下降為(0.68±0.02)μg/mL。這可以證明，經過肉桂精油處理的EHEC O157胞內可溶性蛋白的含量會降低。因此，肉桂精油能夠影響EHEC O157蛋白質合成能力，從而抑制菌體生長[20]。

圖3 肉桂精油對EHEC O157蛋白合成能力的影響Fig.3 Effects of cinnamon essential oil on EHEC O157 protein synthesis注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.5 肉桂精油對AKP活性的影響

大腸菌屬的AKP是非特異性的磷酸單酯酶，可以催化磷酸單酯水解為磷酸、醇和酚類等化合物，存在于細菌的細胞壁和細胞膜之間，若菌體細胞壁遭到破壞，AKP的活性也會相應的受到抑制[21]。如圖4所示，精油孵育4 h后，隨著菌體生長，空白組AKP的活性增加了2.159倍；而當菌體受到肉桂精油處理后，孵育4 h后，1/2MIC和MIC組的AKP的活性變為77.23%和52.07%，這說明菌體胞內酶堿性磷酸酶AKP活性受到了一定程度的抑制。

圖4 肉桂精油對EHEC O157 AKP活性的影響Fig.4 Effects of cinnamon essential oil on EHEC O157 AKP enzyme activity

2.6 肉桂精油對SDH活性的影響

SDH，是三羧酸 (tricarboxylic acid, TCA)循環中唯一一個整合在細胞膜上的多亞基酶。在TCA循環中，為線粒體需氧和產能提供電子，是線粒體的一種標志酶[22]。如圖5所示，在肉桂精油濃度從0增加至3/8MIC，菌液可檢測到SDH活性明顯呈上升趨勢，并在肉桂精油濃度為3/8MIC時達到峰值，此后，隨著肉桂精油濃度的增加，SDH在菌液中的活性逐漸降低，當精油濃度達到MIC時，菌液中可測到的SDH活性相對于最高活性降低了65.3%。這說明肉桂精油對EHEC O157的呼吸作用有一定的抑制作用，能夠破壞菌體正常的TCA循環，中斷部分呼吸鏈的電子傳遞。

圖5 肉桂精油對EHEC O157 SDH活性的影響Fig.5 Effects of cinnamon essential oil on EHEC O157 SDH activity

3 結論

研究顯示，肉桂精油對EHEC O157 MIC為0.000 4 g/L。肉桂精油能明顯抑制EHEC O157的生長，破壞細胞膜結構,增加細胞膜的通透性,導致細菌死亡。肉桂精油存在情況下，能有效干擾EHEC O157蛋白質的合成能力，影響細胞膜與細胞壁之間的結構的穩定性，破壞菌體正常的TCA循環，中斷部分呼吸鏈的電子傳遞。研究為植物精油應用于生物抑菌劑提供了依據,對保障食品安全具有重要意義。