雪菊乙醇提取物對丙烯酰胺所致肝損傷的保護作用

高娟娟，李爽，馬瑞，邵蕾，謝艾迪，王禎，趙怡，黎鈺欣，韓海霞

（新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊 830052）

丙烯酰胺（acrylamide，ACR）由高脂肪、高淀粉食品在高溫加工過程發生美拉德反應而產生[1]。目前，ACR的神經毒性、遺傳毒性、免疫毒性、肝毒性及潛在致癌性已被證實[2,3]。早在1994年，ACR就被國際癌癥研究機構認定為“2A類可能致癌物”[4]。然而，在某些食品加工過程中不可避免地產生ACR，并隨食物一起被人們食用。因此尋找可拮抗ACR毒性的天然產物具有重要意義。有研究結果顯示，一些天然抗氧化劑可拮抗ACR誘發的神經、肝臟、腸組織細胞毒性，如靈芝多糖、藍莓花色苷、山藥多糖、原花青素、矢車菊-3-葡萄糖、水飛薊素、發酵火麻仁蛋白粉等，其機制均與抗氧化應激有關[5-13]。由此可見，利用天然抗氧化劑拮抗ACR引起的體內氧化應激損傷，是拮抗食源性ACR的重要途徑。

雪菊（Coreopsis tinctoriaNutt.），學名兩色金雞菊、蛇目菊，為菊科金雞菊屬多年生草本植物的干燥頭狀花序，可作為藥食兩用類原料用于食品和藥物的開發與應用。研究發現，雪菊富含總黃酮、蛋白質、酚類等多種活性物質，具有抗炎、降脂、降壓、降糖、抗凝血、抗氧化、抗病毒等生理活性[14]。研究表明雪菊乙醇提取物具有較強的抗氧化活性，其中所含的奧卡寧和異奧卡寧對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除率的EC50分別為6.2、10.6 μmoL/L，遠遠高于維生素C等陽性對照物[15]，且有研究表明雪菊中原花青素對CCl4所致小鼠急性肝損傷有一定保護作用[16]。具有強抗氧化活性的雪菊乙醇提取物是否對ACR所致肝損傷有保護作用值得探討。因此，本實驗利用ACR誘導人肝癌HepG2細胞毒性，建立細胞損傷模型，采用MTT法檢測雪菊乙醇提取物對ACR致HepG2細胞損傷模型存活率的影響，同時，利用ACR誘導小鼠肝損傷，探討雪菊乙醇提取物對ACR誘導小鼠肝損傷的保護作用及機制。本研究為雪菊對ACR致肝損傷的保護作用的進一步研究以及雪菊利用價值的深度開發提供一定的理論依據。

1 材料、儀器與方法

1.1 材料與試劑

雪菊購于新疆烏魯木齊北園春干果市場，源于和田皮山縣，由新疆農業大學食品科學與藥學學院朱金芳教授鑒定。

清潔級ICR雄性小鼠，購于新疆醫科大學實驗動物中心，許可證號：SYXK（新）2018-0003，體重18～22 g，實驗室條件下適應性喂養4 d后，用于正式實驗。

人肝癌細胞株HepG2，由新疆農業大學細胞與分子實驗室包曉瑋教授提供；胎牛血清，美國Hyclone公司；N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC），上海源葉生物科技有限公司；丙烯酰胺，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；雙抗（青霉素和鏈霉素）、2",7"-二氫二氯熒光素二乙酸酯（2",7"-Dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）、色譜甲醇、色譜乙腈，美國Sigma公司；噻唑藍（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）、細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒、谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙二醛（malondialdelyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶活性（glutathione peroxidase，GSH-Px）及BCA蛋白濃度測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器設備

SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺，中國蘇州凈化設備有限公司；ZWY-200D型恒溫培養振蕩器，上海智能分許儀器制造有限公司；BIONOON-VAC3型低溫冷凍濃縮機，上海般諾生物科技有限公司；AE-31型數碼倒置顯微鏡，中國廈門麥克奧迪公司；AL204-IC型電子天平，梅特勒-托多利儀器有限公司；Shellab型二氧化碳培養箱，美國希爾頓公司；xMarkTM型酶標儀，伯樂生命醫學產品有限公司廠；SF-GL-16A型高速離心機，上海菲恰爾分析儀器有限公司；KQ-250DE型超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 雪菊乙醇提取物的制備

準確稱取500 g雪菊，于40 ℃干燥4 h。加10 L 70%乙醇，常溫浸泡2 h，過濾，濾渣再加7.5 L 70%乙醇浸提兩次，三次濾液合并后真空濃縮，濃縮液經冷凍干燥后得雪菊乙醇提取物。參考文獻方法[17]測得其中總黃酮含量為18.3%。

1.3.2 雪菊乙醇提取物對ACR致HepG2細胞損傷的保護作用

1.3.2.1 細胞培養、預處理及分組

按參考文獻[7]方法并稍加改動，細胞預處理及分組如下：空白組（正常培養的HepG2細胞）；ACR損傷模型組（ACR組，HepG2細胞經ACR溶液孵育24 h）；陽性藥對照組（NAC組，即HepG2細胞先用NAC溶液孵育6 h，再用ACR溶液孵育24 h）；雪菊低、中、高濃度組（HepG2細胞先用不同濃度的雪菊溶液孵育6 h，再用ACR溶液孵育24 h）。

1.3.2.2 ACR致HepG2細胞損傷模型的建立

按參考文獻[7,13]并稍加改動，將處于對數生長期的HepG2細胞接種于96孔板，細胞密度為1×104cells/mL，過夜培養，分別向孔中加入用不含血清培養基配置的不同濃度的ACR溶液（1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 mmol/L）100 μL作為ACR組，每個濃度平行3個孔，同時，留3個孔加100 μL不含血清的培養基作為空白組（不加ACR溶液的細胞），37 ℃孵育24 h后，各孔加MTT溶液20 μL繼續孵育4 h后，吸出各孔溶液并棄去，加DMSO 150 μL，避光條件下震蕩10 min（100 r/min），用酶標儀在570 nm處測定不同濃度模型組和空白組的OD值，將OD值代入公式（1）計算各組細胞存活率，根據細胞存活程度確定建立HepG2細胞損傷模型的ACR濃度。

式中：

OD1——添加了不同濃度ACR溶液的各孔吸光度值；

OD2——空白對照組的吸光度值。

1.3.2.3 雪菊乙醇提取物對HepG2細胞增殖的影響

將處于對數生長期的HepG2細胞接種于96孔板，細胞密度為1×104cells/mL，過夜培養，分別向孔中加入用不含血清培養基配置的不同濃度的雪菊乙醇提取物溶液（0.125、0.25、0.50、1.00、2.00 mg/mL）作為實驗組，每個濃度平行3個孔，同時，留3個孔加100 μL不含血清的培養基作為空白組（不加雪菊乙醇提取物），37 ℃孵育24 h后，按“1.3.2.2”項下MTT法測定不同濃度雪菊乙醇提取物實驗組和空白組的OD值，并按公式（2）計算細胞存活率，根據細胞存活程度確定加入的雪菊乙醇提取物濃度。

式中：

OD3——添加了不同濃度雪菊乙醇提取物溶液的各孔吸光度值；

OD4——空白對照組的吸光度值。

1.3.2.4 雪菊乙醇提取物對ACR所致HepG2細胞損傷模型存活率的影響

按“1.3.2.1”項下方法培養細胞以及進行細胞預處理和分組后，按“1.3.2.3”項下方法操作，采用MTT法測定空白組、ACR組、NAC組（濃度1.50 mg/mL）和雪菊乙醇提取物低、中、高濃度組（0.50、1.00、2.00 mg/mL）的OD值，并按公式（3）計算細胞存活率，根據細胞存活率考察雪菊乙醇提取物對ACR誘導HepG2細胞毒性的保護作用。

式中：

OD5——ACR組、NAC組和雪菊低、中、高濃度組的吸光度值；

OD6——空白對照組的吸光度值。

1.3.2.5 雪菊乙醇提取物對ACR所致HepG2細胞損傷下氧化應激生物標志物的影響

按細胞密度為5×104cells/mL將HepG2細胞接種于12孔板，每孔1 mL，置于培養箱（37 ℃、5% CO2）中培養24 h后，按“1.3.2.1”項下方法進行細胞預處理和分組，得到空白組、ACR組、NAC組（1.50 mg/mL）和雪菊低、中、高濃度組（0.50、1.00、2.00 mg/mL），各組37 ℃孵育24 h后，移去培養基，用不含血清的培養基清洗3次，避光條件下每孔加入以不含血清的培養基配制的DCFH-DA溶液1 mL，濃度為10.00 μmol/L，避光孵育30 min后，移去孔中溶液，用不含血清的培養基充分清洗3次，再向各孔加RIPA緩沖液，反復吹打均勻后，收集細胞懸浮液，離心15 min（13000 r/min），收集上清液后，采用酶標儀檢測熒光強度，用BCA法測定每孔裂解液中蛋白總量，以每孔蛋白總量校正熒光強度，以各組熒光強度與空白對照組熒光強度比值考察細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）相對水平。

按上述方法，除不加熒光探針DCFH-DA外，同法操作如培養細胞、各組預處理與孵育、細胞裂解、收集細胞、離心后，按MDA、CAT、SOD和GSH-Px試劑盒操作說明測定MDA、CAT、SOD和GSH-Px，用BCA法測定每孔裂解液中蛋白總量，以每孔蛋白總量校正各指標值。

1.3.3 雪菊乙醇提取物對ACR所致小鼠肝損傷的保護作用

1.3.3.1 動物分組及給藥方法

健康ICR小鼠分為6組，每組10只，分別為空白組（灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉）、ACR模型組（灌胃25 mg/kg ACR）、雪菊低劑量組（灌胃25 mg/kg ACR+0.25 g/kg雪菊乙醇提取物）、雪菊中劑量組（灌胃25 mg/kg ACR+0.5 g/kg雪菊乙醇提取物）、雪菊高劑量組（灌胃25 mg/kg ACR+1.0 g/kg雪菊乙醇提取物）、陽性藥對照組（NAC組，灌胃25 mg/kg ACR+320 mg/kg NAC）。連續給藥28 d。

1.3.3.2 樣品采集與處理

實驗結束前禁食不禁水12 h，摘眼球取血，常規分離制備血清，備用。同時快速剝離肝臟，稱重記錄，-80 ℃保存備用。

1.3.3.3 雪菊乙醇提取物對ACR所致小鼠肝損傷保護作用的指標測定

參照試劑盒說明書測定小鼠血清ALT、AST活力。肝臟組織勻漿后,參照試劑盒說明書檢測MDA含量，SOD、GSH-Px活性。

1.3.3.4 HE染色法觀察肝臟組織病理變化

將新鮮的肝臟組織取出后立即浸沒在組織固定液內24 h，無水乙醇脫水后，石蠟包埋并進行切片，HE常規染色，顯微鏡觀察肝臟組織的病理學變化。

1.3.4 數據處理

運用GraphPad Prism 5.0對實驗數據進行單因素方差分析（One-way ANOVA），圖表采用GraphPad Prism 5.0繪制，結果以平均值±標準誤差（Mean±SD）表示。

2 結果與討論

2.1 雪菊乙醇提取物對ACR所致HepG2細胞損傷的保護作用

2.1.1 不同濃度ACR對HepG2細胞存活率的影響

HepG2細胞經1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 mmol/L的ACR孵育24 h后，細胞存活率結果如圖1所示。由圖可知，與空白組相比，當ACR濃度為0.25～20.00 mmol/L時，均對細胞產生毒性，且隨著濃度的增加，HepG2細胞存活率明顯降低，尤其經5.00、10.00 mmol/L ACR處理以后，細胞死亡達41.33%、53.97%（p＜0.001）。經計算，0.125～20.00 mmol/L濃度范圍內，ACR處理24 h致HepG2細胞損傷的半數致死劑量（median lethal dose，LD50）為8.00 mmol/L，對比李亮等[8]研究ACR對HepG2細胞的毒性作用選用劑量，故本實驗選用8.00 mmol/L ACR誘導HepG2細胞建立細胞損傷模型。

圖1 ACR對HepG2細胞存活率的影響 Fig.1 Effect of ACR on the survival rate of HepG2 cell

2.1.2 不同濃度雪菊乙醇提取物對HepG2細胞增殖的影響

本實驗以雪菊乙醇提取物為研究對象，利用MTT法檢測其對HepG2細胞增殖的影響，結果如圖2所示。與空白組相比，HepG2細胞在不同濃度（0.125、0.25、0.50、1.00、2.00 mg/mL）雪菊乙醇提取物的作用下，其存活率并未受到影響（p＞0.05），表明雪菊乙醇提取物在此范圍內未對HepG2細胞產生細胞損傷，屬于安全濃度范圍，因此，選擇0.50、1.00、2.00 mg/mL分別為雪菊乙醇提取物的低、中、高濃度，評價其對ACR誘導HepG2細胞損傷的保護作用。

圖2 雪菊乙醇提取物對HepG2細胞存活率的影響 Fig.2 Effect of C. tinctoria ethanol extract on the survival rate of HepG2 cells

2.1.3 雪菊乙醇提取物對ACR所致HepG2細胞損傷的保護作用

由表2可知，各組細胞經ACR處理4、8、16、24 h后，與空白組相比，HepG2細胞的存活率明顯下降（p＜0.05），四個時間段下細胞損傷率分別為11.20%、39.70%、46.70%、51.37%，提示隨著與ACR共同孵育時間的延長，HepG2細胞的損傷率也逐漸增加，尤其孵育24 h時，損傷率達到50%以上。而NAC（1.50 mg/mL）對HepG2細胞預處理8 h，細胞存活率達到70.67%，對ACR所致細胞損傷表現出明顯的保護作用（p＜0.05），當預處理達16 h，可使細胞存活率增加20.37%，雪菊乙醇提取物高濃度組（2.00 mg/mL）預處理4 h起，即可使細胞存活率達到98.77%，對ACR所致細胞損傷表現出較為明顯的保護作用（p＜0.05），且隨著時間的延長，雪菊乙醇提取物中濃度（1.00 mg/mL）和高濃度（2.00 mg/mL）也逐漸表現出更加明顯的保護作用（p＜0.01）。ACR孵育24 h，ACR組HepG2細胞存活率降至48.63%，而雪菊乙醇提取物中、高濃度組使細胞存活率分別維持在60.37%、61.43%。郝瑞芳等[18]研究表明ACR對HepG2細胞的損傷作用與ACR濃度和孵育時間呈正相關性，用ACR對HepG2細胞孵育0～12 h，細胞存活率也隨孵育時間的延長而逐漸下降，本實驗結果和“3.1.1”實驗結果也表明隨著ACR濃度和孵育時間的增加，細胞損傷率也呈上升趨勢，與郝瑞芳等的結果一致。而雪菊乙醇提取物中、高濃度組可使細胞存活率明顯提高，且隨著孵育時間的增加，細胞存活率相比于ACR組，可增加10%～15%，表明雪菊乙醇提取物對ACR誘導的HepG2細胞損傷具有一定保護作用。有文獻表明[19]，黃酮類化合物對ACR的毒性有干預作用，沈洋等[20]證明黃酮類化合物楊梅素對ACR所致小腸上皮細胞的毒性有保護作用。雪菊總黃酮含量高，約為11%～21%[21]，本文制得的雪菊乙醇提取物中總黃酮含量為18.3%，提示雪菊乙醇提取物對ACR所致HepG2細胞損傷的保護作用可能與其中黃酮類化合物有關。另外，也有文獻報道，ACR通過氧化應激損傷產生細胞毒性[8,11]，雪菊提取物對細胞損傷的保護作用是否與阻斷ACR引起的氧化損傷有關，有待進一步研究。

2.1.4 氧化指標的測定

2.1.4.1 ROS相對水平

當細胞內ROS積累到一定水平，可導致細胞發生氧化應激現象，導致細胞氧化損傷，因此，考察細胞是否發生了氧化損傷的首要指標就是檢測細胞內ROS水平[22]。ROS相對水平采用熒光探針DCFH-DA法測定，結果如圖3所示。由圖3可知，與空白組相比，ACR可引起細胞內ROS相對水平顯著增加（p＜0.001）。與ACR組相比，陽性藥NAC顯著降低HepG2細胞內ROS相對水平（p＜0.001），雪菊乙醇提取物中濃度（1.00 mg/mL）、高濃度（2.00 mg/mL）尤其高濃度能夠使HepG2細胞內ROS相對水平顯著降低57.67%（p＜0.01）。曹菲薇等[23]研究表明阿膠可通過抑制ROS的生成發揮對ACR誘導的斑馬魚胚胎損傷的保護作用。沈洋[20]實驗也表明ACR使Caco-2細胞內ROS熒光強度急劇增加，而給予楊梅素處理，ROS熒光強度降低58%。本實驗結果也證明ACR會刺激HepG2細胞內ROS大量增加，而雪菊乙醇提取物可大量減少因ACR導致的胞內ROS產生和積聚，提示雪菊乙醇提取物可能通過阻斷ACR致胞內ROS水平的升高而發揮HepG2細胞保護作用。

圖3 雪菊乙醇提取物對ACR所致HepG2細胞損傷下ROS相對水平的影響 Fig.3 Effect of C. tinctoria ethanol extract on ROS relative levels in ACR - induced HepG2 cell

表1 雪菊乙醇提取物對ACR所致HepG2細胞損傷的保護作用 Table 1 Protective effects of C. tinctoria ethanol extract on ACR - induced HepG2 cell

2.1.4.2 MDA、CAT、SOD和GSH-Px的測定

測定細胞內MDA含量，是為考察機體脂質過氧化程度，從而間接評價細胞氧化損傷程度。CAT、SOD和GSH-Px是重要的抗氧化酶，因此，通過測定酶活力，可評價化合物的抗氧化能力[24]。雪菊乙醇提取物對ACR所致HepG2細胞損傷后細胞內MDA含量，CAT、SOD和GSH-Px活力的影響結果見圖4。由圖4可知，與空白組相比，ACR使HepG2細胞內MDA含量顯著上升（p＜0.001），CAT、SOD和GSH-Px活力顯著降低（p＜0.001）。與ACR組相比，NAC和雪菊乙醇提取物均降低HepG2細胞內MDA含量，提高CAT、SOD和GSH-Px水平。雪菊乙醇提取物中濃度（1.00 mg/mL）、高濃度（2.00 mg/mL）尤其高濃度能夠使HepG2細胞內MAD由8.38 nmol/mg降低到3.70 nmol/mg（p＜0.001），CAT、SOD和GSH-Px分別由4.73、8.07、10.64 U/mg升高到9.41、18.55、24.45 U/mg（p＜0.001），且雪菊乙醇提取物對四種酶水平的影響呈劑量依賴關系。呂玲珠[9]研究結果表明藍莓花色苷能有效恢復ACR導致的HepG2細胞損傷，通過降低MDA含量、升高SOD，CAT酶活性抑制ACR對HepG2細胞的氧化損傷作用。蔡小華等[25]實驗發現辣木葉水提物也通過降低HepG2細胞內MDA水平，提高GSH-Px和SOD等酶類的活力發揮對H2O2導致HepG2細胞損傷的保護作用。本實驗結果也表明雪菊乙醇提取物可降低HepG2細胞內MDA含量，提高CAT、SOD和GSH-Px等酶活力，提示雪菊乙醇提取物可能通過抗氧化機制發揮ACR致HepG2細胞損傷的保護作用。

圖4 雪菊乙醇提取物對ACR致HepG2細胞損傷下MDA(a)、CAT（b）、SOD（c）和GSH-Px（d）水平的影響 Fig.4 Effect of C. tinctoria ethanol extract on MDA (a), CAT (b), SOD (c) and GSH-Px (d) levels in ACR – induced HepG2 cell

2.2 雪菊乙醇提取物對ACR所致小鼠肝損傷的保護作用

2.2.1 小鼠體重變化

在適應性喂養期間，小鼠精神狀態好、行動自如、進食量正常、毛發有光澤、無死亡現象。灌胃ACR造模后，小鼠出現精神不佳、活動減少、進食量減少、毛發粗糙等不良現象，推測可能是由于肝臟受到ACR損傷，肝功能不正常，導致小鼠體內代謝紊亂。雪菊提取物低、中、高劑量（0.25、0.50、1.00 g/kg）均可改善ACR引起的上述行為和體征。同時，每隔3 d測定各組小鼠體重，結果見圖5。小鼠喂養28 d，空白組小鼠體重一直呈現增長的現象，體重變化率為28.93%，而ACR組小鼠體重呈先下降后增長趨勢，體重變化率為10.25%，與空白組比較，有顯著差異（p＜0.001）。與ACR組相比，NAC和雪菊乙醇提取物低、中、高劑量可明顯改善ACR引起的體重減少現象（p＜0.01，p＜0.01），從第7 d開始，小鼠體重一直呈明顯上升趨勢，至第28 d，NAC組和雪菊乙醇提取物低、中、高劑量組小鼠體重分別升高了27.45%、22.27%、25.86%、22.74%。李變麗等[26]研究發現鎘致小鼠肝損傷使小鼠的體質量呈下降趨勢，桑葚多糖使小鼠體質量下降的情況有所改善。本實驗結果也表明雪菊乙醇提取物低、中、高劑量組可明顯改善ACR引起的體重減少現象。

圖5 雪菊乙醇提取物對ACR致毒小鼠體重的影響 Fig.5 Effect of C. tinctoria ethanol extract on body weight of ACR induced mice

2.2.2 血清ALT、AST

肝功能受損時，肝組織中ALT、AST等轉氨酶進入到血液當中，導致血清中ALT、AST活力相對增加。因此，可通過檢測血清中ALT、AST活力初步判斷肝功能狀況[27]。如圖6所示，ACR組小鼠血清中ALT、AST活力明顯高于空白組，分別由17.43、21.23 U/L升高至45.19、68.02 U/L，表明肝功能受到影響，造模成功。與ACR組比較，NAC組和雪菊乙醇提取物中、高劑量組（0.50、1.00 g/kg）ALT、AST活力顯著下降（p＜0.01），尤其是雪菊乙醇提取物高劑量組使ALT、AST活力分別下降了16.36、38.06 U/L。有研究結果表明昆侖雪菊原花青素[16]和蒲公英總黃酮[28]都能夠降低四氯化碳致肝損傷小鼠血清中ALT、AST活力，對CCl4致肝損傷具有一定的保護作用。本實驗結果也表明雪菊乙醇提取物能降低ACR所致肝損傷小鼠血清中的ALT、AST活力，表明雪菊乙醇提取物對ACR所致小鼠肝功能損傷有保護作用。

圖6 雪菊乙醇提取物對ACR致毒小鼠血清ALT(a)、AST(b)的影響 Fig.6 Effects of C. tinctoria ethanol extract on serum ALT (a) and AST (b) of ACR induced mice

2.2.3 小鼠肝組織病理切片觀察

對肝臟組織的病理學切片進行HE染色可以清晰地反映肝臟病理變化情況。如圖7所示，空白組小鼠肝組織中肝小葉具有結構完整，肝細胞結構完整，排列整齊，細胞核大小正常、清晰可見；ACR組小鼠肝細胞破裂、排列紊亂，細胞核出現破裂、腫脹現象，部分細胞核消失；與ACR組相比，NAC組和雪菊乙醇提取物各劑量組小鼠肝細胞排列整齊，肝小葉結構完整，細胞核無明顯的破裂、腫脹現象，損傷程度明顯減弱。王莉等[27]實驗發現黑枸杞多糖對ACR致大鼠肝損傷的肝組織病變情況得到很好的改善，黑枸杞多糖能夠改善ACR染毒大鼠的肝損傷。本實驗結果顯示雪菊乙醇提取物低、中、高劑量組小鼠肝組織的損傷程度均有減輕，其中以高劑量組最為明顯，肝組織結構清晰、無明顯損傷，與NAC組的效果相似，表明雪菊乙醇提取物可減輕ACR所致的肝臟組織損傷，起到保護肝臟的作用。

圖7 ACR致毒小鼠肝臟病理切片（HE,100×） Fig.7 Pathological sections of liver of ACR - induced mice (HE, 100×)

2.2.4 小鼠肝臟MDA、SOD、GSH-Px的測定

由圖8可知，與空白組相比，ACR使小鼠肝臟中MDA含量顯著上升（p＜0.001），SOD、GSH-Px活力顯著降低（p＜0.001），而NAC組和雪菊乙醇提取物低、中、高劑量（0.25、0.50、1.00 g/kg）均能使小鼠肝臟內MDA含量顯著降低（p＜0.01），SOD、GSH-Px活力顯著上升（p＜0.01），雪菊乙醇提取物高劑量使MDA含量由7.21 nmol/mg降低到5.35 nmol/mg，SOD、GSH-Px由104.71、575.50 U/mg升高到161.44、905.94 U/mg，且雪菊乙醇提取物對MDA含量，SOD、GSH-Px活力的影響呈劑量依賴關系。有研究表明[29-31]，白藜蘆醇、藏紅花素、橙皮素等天然抗氧化劑均可緩解ACR對鼠的肝損傷，其機制與降低MDA，提高SOD、GSH-Px抗氧化酶活性有關。研究表明雪菊提取物具有較強的抗氧化活性[15]，且本文“2.2.2”和“2.2.3”實驗結果證明雪菊乙醇提取物可緩解ACR對小鼠的肝損傷，本節小鼠肝臟MDA、SOD、GSH-Px的測定結果提示，雪菊乙醇提取物可能通過抗氧化機制對ACR所致的小鼠肝損傷發揮保護作用。

圖8 雪菊乙醇提取物對ACR致毒小鼠肝臟MDA（a）、SOD（b）、GSH-Px（c）水平的影響 Fig.8 Effect of C. tinctoria ethanol extract on MDA (a), SOD (b) and GSH-Px (c) level of liver injury in induced - ACR mice

3 結論

3.1 本文研究雪菊乙醇提取物對ACR所致HepG2細胞損傷及小鼠肝損傷的保護作用。HepG2細胞經ACR處理后，存活率下降為48.63%，而雪菊乙醇提取物可使細胞存活率上升至61.43%。雪菊乙醇提取物能夠顯著抑制細胞內ROS相對水平和MDA含量，顯著增高SOD、CAT、GSH-Px活性。動物實驗結果表明，雪菊乙醇提取物可拮抗ACR引起的小鼠體重增長緩慢現象，能降低小鼠血清ALT、AST活力，降低肝臟MDA含量，提高肝臟SOD和GSH-Px活性；小鼠肝組織HE染色結果顯示，雪菊乙醇提取物各劑量不同程度地改善小鼠肝小葉結構和肝細胞形態，減輕小鼠肝損傷，對肝組織有顯著的保護作用。

3.2 綜上所述，雪菊乙醇提取物對ACR誘導的HepG2細胞損傷及小鼠肝損傷均具有保護作用，此作用可能與抗氧化機制有關，本研究將對雪菊提取物在食源性ACR防治應用方面提供一定的理論依據。