屎腸球菌132膽鹽水解酶基因的克隆表達與酶學特性

楊玲雙，謝新強，李瀅，張菊梅，丁郁，吳清平*，王涓

（1.華南農業大學食品學院，廣東廣州 510642）（2.廣東省科學院微生物研究所，廣東省微生物安全與健康重點實驗室，華南應用微生物國家重點實驗室，廣東廣州 510075）

甘氨酸或?；撬峤Y合膽汁酸被稱為膽鹽[1]，是哺乳動物消化脂質所必需的。膽鹽水解酶（bile salt hydrolase，BSH），也稱為結合BSH（conjugated bile salt hydrolase，CBSH）、結合膽汁酸水解酶（conjugated bile acid hydrolase，CBAH）和膽酰甘氨酸水解酶（cholylglycine hydrolase，CGH），屬于N端親核水解酶家族[2]，是一種催化甘氨酸/?；撬峤Y合膽汁酸水解為去結合膽汁酸和氨基酸殘基的酶[3]。BSH主要來源于梭菌（Clostridium）、擬桿菌（Bacteroides）、乳桿菌（Lactobacillus）、李斯特菌（Listeria）、腸球菌（Enterococcus）、雙歧桿菌（Bifidobacterium）等[4]。具有BSH活性的微生物能耐受膽汁、在胃腸道定殖、維持宿主代謝和能量獲取的能力[5]。BSH酶能將結合膽鹽水解成去結合形式和釋放游離氨基酸，而去結合膽鹽的可溶性較差，不被腸細胞吸收而隨糞便排出體外；另一方面則是促進膽汁酸合成，因膽固醇為膽汁酸的前體，故能降低血清膽固醇[6]。益生菌對膽鹽的水解能力經常被列入益生菌菌株篩選的標準之一，但不同微生物的BSHs具有不同的蛋白結構和底物特異性，潛在BSH抑制劑的鑒定依賴于BSH的晶體結構的可用性[7,8]。不同種屬之間BSH的亞基組成、大小、最適溫度、pH均存在差異性，但BSH有6個嚴格的保守催化位點，其中Cys2埋藏在所有Ntn酶保守的αββα核心中形成活性位點，另外還有5個重要的催化殘基（Arg18、Asp21、Asn82、Asn175、Arg228）[9]。乳桿菌和雙歧桿菌作為有益微生物的代表，其BSH酶被廣泛研究，比如植物乳桿菌WCFS1發現有4個bsh基因[10]，約氏乳桿菌PF01發現3個bsh基因[11]，嗜酸乳桿菌NCFM發現2個bsh基因，且均顯示不同的底物特異性[12]。在唾液乳桿菌JCM1046和UCC118中也發現了2個bsh基因，其中第二個基因在分類水平上被重新編碼為青霉素V?；福≒VA）[13]。屎腸球菌廣泛存在禽類腸道中，是腸道中重要的菌類，因其能產生乳酸，故歸屬于乳酸菌。近年來，益生屎腸球菌越來越受到關注，益生腸球菌對維持平衡起到關鍵作用，近年來廣泛應用在幼齡動物的腸道保健和疾病防疫上[14]。屎腸球菌還能產生抗菌肽，抑制致病菌的生長，在食品中添加能延長食品保質期等功能，但對其BSH研究相對較少。本團隊前期對屎腸球菌132全基因組序列注釋結果發現，屎腸球菌132含有膽酰甘氨酸水解酶（EC 3.5.1.24）基因。并且在體內能降低SD大鼠體重、血清膽固醇、甘油三酯、緩解肝損傷[15]。有綜述報道抑制腸道BSH活性會增加脂質代謝和獲取能量，從而提高飼料動物的生長性能和飼料效率[16]，故對BSH研究具有重要意義。本研究對屎腸球菌132bsh基因進行異源表達純化，探究不同底物、pH、以及溫度對酶活力的影響，為進一步研究屎腸球菌相關膽鹽水解酶以及潛在降膽固醇機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質粒

屎腸球菌132（Enterococcus faeciumstrain 132）、大腸桿菌ATCC 8739（Escherichia coliATCC 8739）、pET-28a (+)質粒由廣東省微生物研究所微生物安全與健康發展中心團隊保藏提供。DH5α、BL21大腸桿菌感受態細胞購自生工生物工程（上海）有限公司。

1.1.2 培養基

MRS（de Man，Rogosa and Sharpe）固體和液體培養基、LB（Luria-Bertani）固體和液體培養基，購自廣東環凱微生物科技有限公司；

發酵培養基：35 g/L胰蛋白胨、20 g/L酵母粉、5 g/L NaCl。

1.1.3 主要生化試劑

甘氨酸、?；撬?、甘氨膽酸鈉（GCA）、甘氨脫氧膽酸鈉（GDCA）、甘氨鵝脫氧膽酸鈉（GCDCA）、?；悄懰徕c（TCA）、?；敲撗跄懰徕c（TDCA）、?；蛆Z脫氧膽酸鈉（TCDCA）、DMSO、β-巰基乙醇，上海麥克林生物科技有限公司；CaCO3、檸檬酸三鈉、EDTA（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid），咪唑，廣州化學試劑廠；茚三酮顯色液，上海羅恩試劑；DL2000 DNA Marker，廣州東盛生物有限公司；Nhe Ⅰ、Xho Ⅰ限制性內切酶、Pushion master mix、T4DNA Ligase、cut@smart buffer，美國NEB公司；PCR產物純化試劑盒、質粒提取試劑盒，美國omega公司；SDS-PAGE上樣緩沖液、標準蛋白Marker，上海碧云天生物技術有限公司。

裂解液（g/L）：NaCl 5.60 g、NaH2PO40.63 g、咪唑4.76 g，pH 7.60～7.80。

洗脫液（g/L）：NaCl 8.40 g、NaH2PO42.18 g、咪唑13.60 g，pH 7.20。

交換液（g/L）：NaCl 5.60 g、NaH2PO42.18 g、pH 7.20。

1.2 儀器與設備

WBK-4B型電熱恒溫水浴鍋，廣東環凱微生物科技有限公司；Seven CompactTMS210型數字pH計，美國Mettler Toledo公司；Microfuge?16臺式冷凍離心機，美國Beckman Coulter公司；EPOCH2酶標儀，美國Biotek公司；C150凝膠成像系統，美國Azure Biosystems公司；Biometra DNA擴增循環儀，德國Biometra公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 膽鹽水解酶活力分析

MRS固體培養基中加0.20%?；敲撗跄懰徕c、0.37 g/L CaCl2，121 ℃滅菌20 min，倒平板晾干。再將無菌濾紙片均勻放入平板上，每個濾紙片均勻滴加10 μL菌液，37 ℃厭氧培養72 h。觀察濾紙周圍有無沉淀圈出現[17]。若平板中出現沉淀圈，說明菌株可能具有潛在膽鹽水解酶活性。

菌體膽鹽水解酶的定量分析[18]：將屎腸球菌132接種于MRS肉湯中，大腸桿菌ATCC 8739接種于LB肉湯中37 ℃培養18 h，培養液經8000 ×g離心5 min后收集菌體，用無菌的PBS緩沖液洗滌兩遍后將菌體重懸于PBS緩沖液中。取1 mL菌懸液，加1 μL 1 mol/L維生素C進行破碎（30%功率，6 s停4 s，100 min），13000 ×g離心3 min收集上清，即為粗酶液。利用改良Bradford蛋白濃度試劑盒測定粗酶液蛋白濃度，并繪制蛋白濃度標準曲線。粗酶液對甘膽酸鈉解離體系如表1所示。

表1中溶液溫和渦旋混勻后于37 ℃孵育30 min，置于高溫使酶失活，于16000 ×g離心10 min，吸取250 μL茚三酮顯色液加入750 μL上清中，同時配制標準曲線樣品濃度（0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mmol/L）；將樣品、對照、空白1、空白2、標準曲線樣品于顯色液振蕩混勻，沸水浴15 min，冰浴3 min，靜置5 min后于OD570處測吸光度。實際吸光度值=樣品吸光度值-空白1吸光度值-空白2吸光度值。

表1 膽鹽水解酶酶促反應 Table 1 Bile salt hydrolysase enzymatic reaction

BSH總酶活定義為：單位時間內、單位體積的酶液使結合型膽鹽水解產生氨基酸的微摩爾數，單位μmol/(min·mL)；1U=μmol/min。

BSH比酶活定義為：單位時間內、單位質量的總蛋白中的酶液使結合型膽鹽水解產生氨基酸的微摩爾數，單位μmol/(min·mg)。

1.3.2 DNA的提取和引物設計

利用團隊前期全基因組測序信息中找到相關bsh基因（GenBank登錄號：MZ031135），總片段長度為975 bp，以NheⅠ和XhoⅠ為雙酶切位點，引物為BSHf：5’-AAAAAAGCTAGCATGTGTACGTCTATTA CTTATGTAAC-3’，和BSHr：5’-GTGGTGCTCGAGC TAATTTATATATTTAATTTGTTG-3’，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。將培養好的菌體，按照廣州美基生物技術有限公司細菌基因組DNA提取試劑盒方法，提取基因組DNA。

1.3.3 目的基因的克隆、表達載體的構建

利用上述基因組DNA和引物進行PCR擴增，擴增體系（50 μL）：上下游引物各2.5 μL（10 μmol/L）、DMSO 1.5 μL、Pushion master mix 25 μL、模板DNA 1 μL、滅菌超純水補足50 μL。反應條件：98 ℃預變性30 s；98 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 40 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物于1%瓊脂糖凝膠電泳中進行驗證。利用美國omaga公司產物純化試劑盒（D6492-03）進行PCR產物純化，選取pET-28a (+)質粒和PCR產物進行雙酶切，酶切體系（50 μL）：Nhe Ⅰ2 μL、Xho Ⅰ2 μL、cut@smart buffer 5 μL、pET-28a (+)質粒/PCR產物25 μL，滅菌超純水補足50 μL，酶切2 h后對酶切PCR產物進行純化，利用Omega公司膠回收試劑盒（D2500-02）對酶切質粒進行膠回收。利用T4連接酶對酶切PCR產物和回收質粒進行酶連反應，16 ℃過夜連接并導入DH5α大腸桿菌感受態細胞中，利用抗性基因（卡那霉素）平板篩選進行菌落PCR、雙酶切驗證，提取質粒送至蘇州金唯智生物技術有限公司進行測序，利用DNAMAN 9軟件進行同源比對，確定插入序列是否正確，命名正確的質粒為pET-28a-BSH。最后將提取得到的正確質粒轉化大腸桿菌BL21感受態細胞用于異源表達。

圖1 重組質粒構建示意圖 Fig.1 Schematic diagram of recombinant plasmid construction

1.3.4 BSH的異源表達和純化

將含有pET-28a-BSH的大腸桿菌BL21接種于含卡那霉素的發酵培養基中，37 ℃、200 r/min，培養4 h后調整溫度為18 ℃，加終濃度至0.4 mmol/L IPTG進行誘導表達，誘導48 h后，10000 ×g，離心20 min，收集菌體重懸于含0.1%溶菌酶裂解液中，放-80 ℃中備用。

將菌體進行冰浴超聲破碎（30%功率，6 s停4 s，30 min），4 ℃離心取上清，過0.8 μm濾膜即得到粗酶液。粗酶液過HisTrap Fast Flow鎳柱[19]（Cyctiva廠家，美國丹納赫集團），用裂解液洗脫雜質蛋白，再利用洗脫液洗脫目的蛋白，30 ku超濾管濃縮目的蛋白，交換液重懸和離心除去咪唑，用蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白定量，純化蛋白中加20%甘油，保存于-80 ℃冰箱，備用。

1.3.5 BSH酶的底物特異性分析

反應體系：20 μL酶液、0.5 μL 1 mol/L維生素C溶液、100 μL pH=6、6 mmol/L膽酸鹽、80 μL的雙蒸水，輕輕充分混勻后置于37 ℃恒溫水浴鍋中孵育30 min，反應結束后置于高溫使酶失活，于16000×g離心10 min，上清加入60 μL茚三酮顯色液，迅速置于沸水浴中反應15 min，冰浴3 min，靜置5 min后于570 nm處測吸光度，以不加酶液為對照。樣品實際吸光度值=吸光度值-對照吸光度值。根據甘氨酸標準曲線計算生成的氨基酸的量，計算比酶活，以最高酶活力為100%，計算相對酶活，重復三次實驗。

膽酸鹽分別為6 mmol/L GCA、6 mmol/L GDCA、6 mmol/L GCDCA、6 mmol/L TCA、6 mmol/L TDCA、6 mmol/L TCDCA。

1.3.6 BSH的最適pH和pH穩定性

以6 mmol/L GCA為底物，將反應體系（詳見1.3.5）分別置于不同pH（3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0）下反應按1.3.5方法計算相對酶活。

以6 mmol/L GCA為底物，將不加底物的反應體系分別置于不同pH（3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0）下孵育1 h，置于1.3.5方法進行反應并計算相對酶活。

1.3.7 BSH的最適溫度和熱穩定性

6 mmol/L GCA為底物，將反應體系（詳見1.3.5）分別置于不同溫度（4、20、30、40、50、60、70 ℃）下反應，按1.3.5方法計算相對酶活。

6 mmol/L GCA為底物，將不加底物的反應體系分別置于不同溫度（4、20、30、40、50、60、70 ℃）下孵育1 h，置于1.3.5方法進行反應并計算相對酶活。

1.3.8 不同金屬離子對BSH活力的影響

6 mmol/L GCA為底物，反應體系（詳見1.3.5）中分別加入終濃度為5 mmol/L不同金屬離子（NaCl、CaCl2、MgSO4、MnCl2·4H2O、FeSO4·7H2O、LiCO3、Al2(SO4)3·8H2O、NiSO4·6H2O、CoSO4·7H2O、ZnSO4），測定相對酶活，以未加金屬離子的比酶活為100%。

1.3.9 BSH反應動力學參數的測定

將不同濃度（2、4、6、8、10、20 mmol/L）的GCA加入1.3.5反應體系中反應30 min，按1.3.5方法計算相對酶活。利用GraphPad Prism 8.4.3軟件，根據米氏方程（Michaelis-Menten）擬合數據，并計算BSH最大反應速率（Vmax），米氏常數（Km）值。

1.3.10 數據處理

結果以實驗的均數±標準差（mean±SD）表示，每次實驗3次重復。采用Microsoft Excel 365軟件計算平均值和SD值，Graph Pad 8.4.3進行繪圖。利用在線軟件Swiss Model對BSH的3-D結構進行了同源模擬。

2 結果與分析

2.1 菌體破碎液膽鹽水解酶活力的測定

屎腸球菌132在含?；敲撗跄懰徕cMRS平板上具有明顯的沉淀圈（圖2），推測屎腸球菌132可能具有膽鹽水解酶活性。經膽鹽水解酶定量分析結果表明，屎腸球菌132總酶活為0.20 U/mL，比酶活為0.55 U/mg。先前有研究報道，張芬[20]利用茚三酮法，以GDCA為底物，測定10株腸球菌的比酶活在0.11～1.86 U/mg，本研究屎腸球菌132比酶活力處于中等水平。

圖2 屎腸球菌132膽鹽水解酶定性分析 Fig.2 Qualitative analysis of bile salt hydrolyase in E. faecium strain 132

2.2 表達載體的構建和BSH的純化

目的基因經過克隆、重組質粒到質粒導入BL21感受態細胞后進行誘導表達，利用超聲破碎菌體收集上清并過鎳柱純化。如圖3a所示，在1000 bp左右，出現一條清晰的目的條帶，表明BSH克隆成功；純化蛋白經SDS-PAGE蛋白凝膠實驗得到一條清晰明亮的條帶（圖3b），條帶大小約為37 ku，為常見BSH蛋白條帶，說明BSH蛋白被成功表達并純化。有研究報道屎腸球菌包含兩個bsh基因，且這兩個基因長度均為975 bp，條帶大小在37 ku左右[20]，而本研究bsh基因，條帶大小與之一致。

圖3 純化的BSH蛋白SDS-PAGE Fig.3 Purified SDS-PAGE of purified recombinant BSH protein

2.3 BSH的底物特異性

為探究BSH的底物特異性，利用茚三酮顯色法對6種結合膽鹽進行底物特異性分析。結果如圖4所示，pH=6對GCA解離中酶活達4.93 U/mg，相比于粗酶液，酶活力增加了近10倍（每次比酶活/粗酶液比酶活）。BSH對GCA、TCA均較高的酶活力，對GDCA、GCDCA、TDCA的相對酶活能達到80%，TCDCA特異性最差，達60%。不同種屬酶的活性位點、底物特異性稍有差異。有研究報道，屎腸球菌WEFA23對GDCA水解能力較強[20]，與本研究結果較為一致，對甘氨膽酸類水解能力較強。而另一個研究則報道屎腸球菌NW2對TDCA水解最強，但對GCA的水解也能達到82%[21]，而本研究對這兩種結合膽酸的水解均都大于80%，與之結果較為類似。BSH的底物特異性也可能歸因于酰胺鍵附近的空間位阻，隨著酰胺鍵附近空間位阻的增加，膽鹽水解速率降低[22]。BSH對底物特異性有所差異，對甘氨結合膽酸活性最高，故選取GCA為底物進行酶學特性研究。

圖4 BSH的底物特異性 Fig.4 Substrate specificity of recombinant BSH

2.4 BSH最適pH及pH穩定性

在不同pH條件下反應并測定BSH的相對酶活，結果如圖5a所示，在pH=5.50時達到最高比酶活，達6.59 U/mg，與文獻報道的屎腸球菌NW2中BSH2最適pH相一致[21]；當pH=5時，BSH相對酶活下降至80%；pH＞7時酶活開始急劇下降；pH=10時下降至20%；pH＜4時BSH酶活幾乎喪失。BSH適應pH范圍較廣，在pH=5～10均有一定的活性。當酶經1 h的不同pH緩沖液孵育后，pH＜4時BSH酶活幾乎喪失，與乳桿菌屬100-100菌株來源的BSH（pH 3.80～4.50）差別較大[23]，說明其穩定性較差；在pH為5～7時，酶穩定性較好，與長雙歧桿菌SBT2928來源的BSH（pH 5～7）較為一致[24]；pH＞7時酶活開始急劇下降；pH=10時下降至20%，穩定性開始下降，可能由于結構遭到破壞造成穩定性差，表明該酶對高酸堿均不耐受。任婧[25]在綜述中提到，甘氨類膽鹽在酸性條件下有非常強的毒性，此時BSH則優先水解甘氨類膽鹽，因其大部分研究BSH的最適條件都是以甘氨類膽鹽為底物，故會得出BSH傾向微酸性條件（pH=5～6）。

圖5 BSH最適pH及pH穩定性 Fig.5 The optimal pH and the pH stability of BSH

2.5 BSH最適溫度及熱穩定性

測定不同溫度條件下BSH的相對酶活，結果如圖6a所示，在30 ℃表現出最高酶活力，與屎腸球菌NW2中BSH2相一致[21]，當溫度在4～60 ℃范圍時均有較高的酶活力，4～60 ℃酶活力均大于60%；當溫度高于60 ℃時，酶活力迅速下降，當溫度達70 ℃時，相對酶活下降至20%。故BSH在4～60 ℃均有較高酶活。將酶置于不同溫度下孵育1 h，再按1.3.5體系進行反應并測定相對酶活。從圖6b可以看出，當溫度4～30 ℃范圍時，相對酶活達80%，這與雙歧桿菌來源的重組BSH熱穩定性較為一致[19]；而當溫度＞40 ℃時，酶活急劇下降至20%，熱穩定性較差。與植物乳桿菌[26]BSH相比，本研究的BSH耐受pH和熱穩定性范圍較窄，這可能是由于不同來源和結構所導致。結果表明BSH不耐受高溫，為常溫酶。

圖6 BSH最適溫度及熱穩定性 Fig.6 The optimal temperature and thermal stability for BSH

2.6 不同金屬離子對BSH活力的影響

不同的金屬離子往往對酶會產生激活或者抑制作用，通常作為酶的激活劑或者抑制劑，故本研究在酶反應體系中加入不同金屬離子，探究其對酶的競爭或者抑制作用。結果如表2所示，Na+、Ca2+、Mg2+均對酶活有激活作用，為該酶的激活劑；Mn2+、Fe2+對酶活影響不大；但Ni2+、Al3+、Li2+、Co2+、Zn2+均對酶活有強抑制作用，酶活幾乎喪失，為該酶抑制劑。趙瑞香[27]等研究嗜酸乳桿菌BSH對Mn2+、Fe2+、Ca2+、Mg2+對BSH活性有促進作用，周羅雄等[21]研究屎腸球菌NW2BSH活力時發現Co2+抑制BSH活性，與本研究均具有較好的一致性。這可能是因為不同離子對酶結構存在破壞作用，影響穩定性。

表2 不同金屬離子對BSH活力的影響 Table 2 The effect of different metal ions on the activity of recombinant BSH

2.7 BSH反應動力學參數的測定

以GCA為底物，測定BSH反應動力學參數。Km值是底物親和常數，Vmax為酶促反應最大反應速率，利用米氏方程擬合曲線。結果如圖7所示，米氏曲線呈S型，酶與底物在催化反應時表現出不同的協同作用。根據擬合曲線算出Km值為3.16 mmol/L，Vmax為6.44 μmol/(min·mg)。與報道的干酪乳桿菌[28]（Km值=4.57 mmol/L）相近，而與脆弱擬桿菌[29]（Km值=0.35 mmol/L）有明顯差別，不同菌株BSH的Km值差異較大，可能由于不同底物、不同來源菌株或者不同BSH結構所造成，這一現象為揭示酶與底物的作用機理和酶的空間結構關系提供參考。

圖7 BSH反應動力學 Fig.7 Kinetics of recombinant BSH reaction

2.8 BSH 3-D結構同源模擬

利用在線軟件Swiss Model對BSH的3-D結構進行了同源模擬，結果如圖8所示，該酶有324個氨基酸殘基組成，與來源于糞腸球菌膽鹽水解酶Cys2Ala突變體晶體同源性最高，達82.04%。用計算絕對模型質量的函數QMEAN評估模擬得到的模型的可靠性[30]。QMEAN范圍為0～1，得到的值越大，說明模型越可靠，該模型QMEAN值為0.77、全球模型質量評估（Global model quality estimate，GMQE）值為0.94，說明模擬的BSH的3-D結構是較為可靠的。

圖8 BSH 3-D結構同源模擬結構模型 Fig.8 Three-dimensional homology simulation of recombinant BSH structure model

3 結論

基于本研究前期發現屎腸球菌132具有降膽固醇功能且改善大鼠相關脂質代謝，通過全基因組測序發現其含有一個bsh基因，首先確定其細胞破碎液具有膽鹽水解酶活力，并且構建了bsh基因表達載體。通過在大腸桿菌BL21中表達并純化得到BSH，對其進行酶學特性研究。研究結果表明，BSH偏好水解甘氨酸類膽酸鹽，但是對?；撬犷惸懰猁}水解也能達60%～90%；當以GCA為底物、pH=5.50、溫度為30 ℃時達最適反應條件，BSH在偏酸中性中能保持較高的酶活但是該酶熱穩定性較差；不同金屬離子對酶活有不同影響，且該酶反應動力學得出該酶的Vmax為6.44 μmol/(min·mg)，Km值為3.16 mmol/L。本研究主要探討屎腸球菌132體外BSH活性，通過構建BSH表達載體，探究pH、溫度、不同金屬離子對該酶酶活的影響，后續可進一步研究BSH空間結構和潛在活性位點的關系，或選用食品級乳酸菌表達系統表達bsh基因，為在飼料和食品行業中應用奠定理論基礎。