藜麥皂苷灌胃后大鼠尿液代謝及腸道菌變化

張若愚，閆菲，李雪寧，曹雨晴，余遠，馮靜，薛鵬*

（1.濰坊醫學院公共衛生學院，山東濰坊 261200）（2.濰坊醫學院附屬醫院兒科，山東濰坊 261200） （3.濰坊醫學院臨床醫學院，山東濰坊 261200）（4.濰坊醫學院康復學院，山東濰坊 261200）

藜麥是具有較高營養價值的雙子葉偽谷物植物，具有耐寒、耐旱，易于種植等優點，已作為糧食作物在世界范圍廣泛種植[1]，在我國云南省、山西省、甘肅省、四川省以及新疆省都有廣泛種植，目前藜麥麩皮中已測得87種皂苷化合物[2]。藜麥皂苷具有抗蟲抑菌、抗氧化、抗腫瘤等多種生物活性[3]。雖然藜麥皂苷已作為生物農藥用于抑制福壽螺的繁殖[4]。市場上也有了含有藜麥皂苷的全谷物產品。一般劑量下的藜麥皂苷的高食用安全性也得到了證實[5]。然而，過量的皂苷對正常細胞及機體可能存在毒性效應[6]，但其毒作用機制尚未發現。更無關于藜麥麩皮或藜麥麩皮皂苷使用的相關指南或推薦攝入量等。因此，近年來課題組開展了對藜麥皂苷的毒性研究，前期研究證實，經甲醇提取，正丁醇萃取的藜麥皂苷（含量＞60%）急性毒性試驗下LD50大于10 g/kg，且不具致畸致突變毒性[5]，本次研究基于皂苷亞慢性毒性研究的90 d灌胃干預，評價藜麥皂苷的口服安全性。攝入過高劑量植物皂苷可能會對腎臟及消化道造成損傷[7]。尿液可以直觀的反應出腎臟的健康情況，通過采用液相質譜聯用技術可以實現對動物尿液成分的高通量及高分辨率分析[8]。然而尿液中水溶性成分居多，多數采用親水系統。目前常用的HILIC色譜分析柱與Amide色譜分析柱的分離分析能力各有偏重。因此，本項研究在藜麥皂苷對SD大鼠進行90 d經口灌胃處理后，使用親水色譜柱-質譜（HILIC-Q Exactive ESI & Amide-Q Exactive ESI）對尿液進行全面分析[9]。同時，腸道菌群多樣性可反映機體健康狀況[10]，兩者具有很大的相關性[11]。綜上深入探究皂苷食用的安全性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藜麥麩皮購自內蒙古益稷生物科技有限公司；無特定病原體（SPF）級別的雄性SD大鼠（6～8周齡），購自山東朋悅實驗動物繁育有限公司（SCXK（魯）20190003）；甲醇、正己烷、乙酸乙酯、正丁醇，優級純，國藥集團化學試劑有限公司；RNA提取試劑盒，德國默克；甲醇、乙腈、甲酸、乙酸銨，色譜純，賽默飛世爾科技有限公司；4%多聚甲醛，白鯊生物科技有限公司。藜麥皂苷由濰坊醫學院公共衛生實驗室參考Lin等[5]研究從藜麥麩皮中提?。ê浚?0%）。

1.2 主要儀器

旋轉蒸發儀，東京理化器械株式會社；QuantStudio 5 ABI PCR儀，賽默飛世爾科技有限公司；NovaSeq 6000系統，因美納科學器材有限公司；UPLC-Q-Exactive型超高效液相質譜聯用儀，賽默飛世爾科技有限公司；Micro 21型臺式離心機，賽默飛世爾科技有限公司；IX73光學顯微鏡，奧林巴斯；SCIENTZ-48L型高通量組織研磨器，寧波新芝生物科技股份有限公司。液相色譜柱為Waters Acquity UPLC BEH HILIC柱（3.0 mm×100 mm，1.7 μm）和Waters Acquity UPLC BEH Amide柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）。

1.3 方法

1.3.1 動物飼養

在通過動物實驗倫理申請（2019SDL097）后根據良好實驗室規范原則（GB/T 22278-2008）將大鼠飼養于濰坊醫學院公共衛生學院實驗動物房的IVC大鼠籠盒內。并將48只雌雄大鼠各隨機分為四組：高劑量（500 mg/kg）皂苷灌胃組、中劑量（50 mg/kg）皂苷灌胃組、低劑量（5 mg/kg）皂苷灌胃組與空白（溶媒）灌胃對照組，每組6只。連續90 d經口灌胃暴露后，采集大鼠尿液后處死，解剖取腎臟，使用4%的多聚甲醛固定大鼠腎臟，石蠟包埋切塊后HE染色于光學顯微鏡下觀察。

1.3.2 腸道菌群

大鼠解剖時，采集大鼠結腸內容物，使用RNA試劑盒提取大鼠結腸內容物中RNA。對提取的RNA進行PCR擴增回收，采用TruSeq Nano DNA LT Library Prep試劑盒制備測序文庫，并進一步純化文庫富集所得產物，在對RNA進行高通量測序后所得的結果與數據庫進行比對分析。

1.3.3 代謝組學

1.3.3.1 尿液分析

在大鼠灌胃90 d后，使用代謝籠采集大鼠尿液，使用冷甲醇將大鼠尿液原液去蛋白，渦旋1 min混勻，離心取上清，氮吹干，1 mL甲醇復溶，稀釋100倍，過0.45 μm濾膜備用[12]。

1.3.3.2 液相色譜質譜聯用條件

UPLC-Q-Exactive液相質譜儀進行分析配合HILIC柱。根據Tang等[13]方法：流動相A為0.1%甲酸加10 mmol/L的乙酸銨95/5%乙酸/水溶液，流動相B為0.1%甲酸加10 mmol/L的乙酸銨為50/50%乙腈/水。線性UPLC梯度洗脫為：0 min為2%的B；1 min為2%的B；10 min為22%的B；15 min為30%的B；21 min為50%的B；22 min為2%的B；30 min為2%的B。在速率下進行分離為0.3 mL/min和進樣體積為4 μL。質譜方法為：電噴霧離子源（ESI）；離子源電壓為3.2 kV，鞘氣體積流量為40 L/min；離子源溫度為320 ℃；飽和輔助氣體積流量為2 L/min；裂解電壓為300 V；霧化氣為氮氣；數據采集范圍m/z50～1200，采用Full MS-ddMS模式在正負離子模式下掃描。

另配合Amide柱。根據Ke等[14]方法：流動相A為100 mmol/L的乙酸銨水溶液，流動相B為乙腈。線性UPLC梯度洗脫為：0 min為99%的B；10 min為99%的B；15 min為40%的B；20 min為99%的B；30 min為1%的B。在速率下進行分離為0.3 mL/min和進樣體積為4 μL。質譜方法同上述質譜方法。

1.3.4 統計方法

使用Compounds Discover 3.1.1對液相質譜聯用系統導出的raw文件分析處理，進行峰對齊，峰過濾，峰提取和自動積分。最終創建了一個包含相對分子質量、保留時間（Rt）、峰面積、等信息的多維峰表。并采用mzCloud，Chemspide（包含BioCyc、Bovine Metabolome Database、Bovine Rumen Metabolome Database、CSF Metabolome database、Fecal Metabolome database、Golm Metabolome Database、Human Metabolome Database、KEGG、Saliva Metabolome Database、Serum Metabolome Database、Urine Metabolome Database、Yeast Metabolome Database等數據庫），進行定性并獲取相應峰面積，后使用SIMCA-P 14.1對腸道菌群及代謝組學數據進行分析，通過主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA），檢驗R2、Q2值，得Folding Change值及P值后由Graph-pad 8.0制得差異代謝物火山圖。取差異代謝物（絕對值＞1，p＜0.05），使用MetaboAnalyst 5.0進行代謝通路富集分析[15]。

初步篩查腸道菌群分析中的高通量測序數據；重測、補測問題樣本。通過質量初篩的原始序列按照index和Barcode信息，進行文庫和樣本預分析，并去除barcode序列。使用Vsearch 2.9.1軟件分析序列去噪或OTU聚類。對各樣本（組）在不同物種分類學水平的具體組成進行展示，了解整體概況。

2 結果與討論

2.1 大鼠生命狀態及解剖后觀察

大鼠在飼養期間無明顯不良狀況，灌飼結束后由HE染色切片觀察大鼠腎臟（圖1）。雌性高劑量藜麥皂苷灌胃組腎小球部分空泡變性，腎小球肥大，部分腎小管中細胞核數目增加，細胞核排列紊亂，與慢性腎損傷大鼠的病理表征一致[16]。在雄性大鼠及雌性中低劑量組大鼠與空白對照組大鼠無顯著差異。

2.2 代謝組學研究

對藜麥皂苷90 d灌胃大鼠的尿液進行液質聯用儀分析后，使用Compound Discover 3.1.1對源文件處理得Fold Change值、VIP值、p值等，并做出火山圖，PCA分析，OPLS-DA分析等，重點對差異明顯的高劑量組大鼠與空白對照組大鼠進行分析。

2.2.1 差異代謝物主成分分析

對代謝物進行PCA分析，雌性大鼠R2=0.7，雄性大鼠R2=0.6，均大于0.5，擬合優度較好，具有較高的解釋力。質量控制（Quality Control，QC）樣本重合度均較好，證實實驗采用的方法具有較高重復度且機器具有較高穩定性，結果可信度高。在PCA圖（圖2）中可見雌性大鼠組間差異較為明顯，高中低劑量組與空白對照組均能較好區分；雖然雄性大鼠中劑量組與中劑量組區分不明顯，但雄性大鼠高劑量組與空白對照組仍有明顯差異，對照組散點分布于橫軸之下，高劑量組分布于橫軸之上。OPLS-DA模型下組間差異更為明顯，表明皂苷灌胃對大鼠尿液代謝物影響明顯（圖3）。

2.2.2 差異代謝物數量分析

高劑量藜麥皂苷灌胃對雌雄大鼠均可產生顯著影響，而在中低劑量下影響相對較小。通過火山圖（圖4）可見經500 mg/kg藜麥皂苷灌胃后，雌性大鼠尿液中發現可鑒別的代謝物596種，其中差異代謝物（|log2(Fold Change)|＞1，VIP＞1，p＜0.05）101種，上調38種，下調63種（由于數目過多，表1僅展示log2(FC)大于4，且VIP大于1的部分），雌性中劑量組與對照組相比之下僅有76中差異化合物，雌性低劑量組與對照組相比之下僅有53中差異化合物；雄性大鼠尿液中共發現可見別的代謝物358種，其中差異代謝物29種，上調7種，下調22種（表1、表2僅展示可命名的化合物）雄性中劑量組與對照組相比之下僅有15中差異化合物，雄性低劑量組與對照組相比之下僅有2中差異化合物，且在雌雄中低劑量組與對照組差異代謝物均被高劑量組與對照組差異代謝物所包含。包括在雌性大鼠代謝物中發現的L-組氨酸（L-Histidine）、L-絲氨酸（L-Serine）、吡哆醇（pyridoxine）、甲酰-5-羥基犬尿胺（Formyl-5- hydroxykynurenamine）、黃尿酸（Xanthurenic acid），犬尿喹啉酸（Kynurenic acid）等化合物的變化均提示了皂苷對腎臟的影響，而Helene等[17]的研究亦證實了 未水解的皂苷可能對腎臟具有一定毒性。

表1 雌性大鼠代謝物差異 Table 1 Metabolite differences in female rats

表2 雄性大鼠代謝物差異 Table 2 Metabolite differences in male rats

2.2.3 差異代謝物代謝物通路富集分析

將差異代謝物帶入MetaboAnalyst 5.0進行通路富集分析，各代謝通路中，維生素B6代謝、色氨酸代謝、氨循環、丙氨酸代謝的改變明顯（圖5）。其中，維生素B6代謝與眾多輔酶的合成息息相關，藜麥皂苷通過提高吡哆醇（pyridoxine）水平，調節維生素B6代謝，參與輔酶合成，進而影響各種氨基酸的代謝（圖6）。其中色氨酸又是腸胃微生物的重要代謝產物[18]。藜麥皂苷通過促進色氨酸代謝下調了甲酰-5-羥基犬尿胺（Formyl-5-hydroxykynurenamine）、黃尿酸（Xanthurenic acid）水平，上調了犬尿喹啉酸（Kynurenic acid）水平。而腸道中色氨酸代謝作為腸道相關疾病的重要相關因素與特定乳酸桿菌等益生菌關系密切，色氨酸代謝減弱可能與拮抗皂苷抗營養作用，改善大鼠腸道損傷，增強大鼠的自身免疫水平有關[19-21]，亦可以此為依據將皂苷作為免疫佐劑激發皂苷干預后大鼠的免疫能力[22]。同時，維生素B6代謝還與固醇類激素具有相關性，維生素B6水平上調可增加機體對固醇類激素及維生素D的敏感性，而維生素D可促進鈣吸收預防骨質疏松，這極有可能是皂苷治療骨質疏松以及發揮部分激素作用的重要機制[23]。不僅如此，隨著維生素B6的增加，同型半胱氨酸降解減緩可危害大鼠心血管健康[24]，L-絲氨酸（L-Serine）上調也可與同型半胱氨酸降解減緩的結論相互佐證。

值得注意的是L-組氨酸（L-Histidine）水平下降與甲基組氨酸代謝增強相關較大，而甲基組氨酸代謝的加快則表示及肌源纖維蛋白分解加快，說明攝入藜麥皂苷可致肌肉代謝加強[25]。然而在藜麥皂苷高劑量灌胃組中的代謝產物中未見肌酐等急性腎損傷生物標志物水平的變化，這說明攝入藜麥皂苷未造成腎臟功能性改變[26]。但是通路富集分析卻發現高劑量的藜麥皂苷經口灌胃造成了氨循環變化，藜麥皂苷通過下調L-組氨酸（L-Histidine）、上調L-絲氨酸（L-Serine）改變了氨循環。這一改變提示長期高劑量攝入藜麥皂苷會造成大鼠腎臟代償性損傷[27]。HE染色切片也證實，高劑量藜麥皂苷對雌性大鼠腎臟產生損傷，這一影響在低中劑量范圍下不明顯，而日常所接觸的藜麥皂苷均在中劑量范圍以下[28]，因此推測藜麥皂苷在環境與食品中的適量添加不會對腎臟產生不良影響。

2.3 腸道菌群

腸道菌群作為一種機體健康不可忽視的重要因素，與腸道疾病、腎臟損傷、心血管疾病息息相關[29]。由Alpha多樣性的Observed Species指數（圖7a）可見，僅有雌性對照組與高中劑量之間存在顯著的統計學差異，表示雌性高中劑量組大鼠體內腸道菌群豐度大于雌性空白對照組，這一現象在雄性大鼠及雌性低劑量組中未發現。Simpson指數（圖7b）中則未發現顯著差異。而本研究中，由于腸道菌群自身變異大，故使用OPLS-DA對腸道菌群種屬進行分析。雌雄大鼠，對照組與藜麥皂苷灌胃各組均存在差異（圖8）。其中，雌性大鼠R2X為0.756，R2Y為0.602；雄大鼠R2X為0.956，R2Y為0.607，均大于0.5，模型擬合優度較好。高劑量藜麥皂苷經口灌胃組與空白組相比，腸道菌群種類分布具有顯著性差異。將代謝組學與腸道菌群多樣性交叉分析顯示，在各個差異代謝物相關的代謝通路中，色氨酸代謝與大鼠腸道菌群變化息息相關，而其他常見的腸道菌群相關代謝物未發現明顯改變。結合目前研究，影響腸道菌群分布的主要代謝物為色氨酸、短鏈脂肪酸及膽汁酸等[30]。藜麥皂苷通過下調大鼠體內的色氨酸代謝，影響其腸道菌群分布，但其具體機制尚不清楚。而藜麥皂苷對大鼠腸道菌群的改變也反饋式地影響了機體本身代謝，在長期藜麥皂苷灌飼過程中，代謝產物與腸道菌群相互作用，改變了腸道微環境。 為雌性對照組；MH為雄性高劑量組；MM為雄性中劑量組；ML為雄性低劑量組；MC為雄性對照組；圖8同。

3 結論

綜上，通過代謝組學及腸道菌群結合分析證實，高劑量藜麥皂苷使大鼠尿液中L-脯氨酸、甜菜堿、犬尿喹啉酸等能量代謝物質及氨基酸類物質水平發生改變，并影響了維生素B6代謝、氨循環、色氨酸代謝等通路，從而調節機體代謝，影響大鼠腸道菌群分布，改變其腸道微環境。低中劑量下藜麥皂苷對大鼠并未造成明顯傷害，雖在高劑量下可能會對腎臟造成損傷，但通常飲食與生活中所接觸的藜麥皂苷含量難以達到實驗設定的高劑量。本研究為藜麥皂苷對腎臟的作用提供了理論依據，但對整體及其他臟器的毒性研究仍有待探究。