乳雙歧桿菌XLTG11緩解環磷酰胺 致小鼠免疫功能損傷

李玟玟，馬微微，馬青，張振華，黃莉莉

（黑龍江中醫藥大學藥學院，黑龍江哈爾濱 150040）

益生菌是對宿主有益并有利于腸內菌群生態平衡的活性微生物制劑，當攝入足夠劑量時會刺激宿主免疫系統，增強宿主免疫應答反應，從而幫助宿主抵抗各類疾病發生[1]。目前，益生菌作為保健食品在臨床使用廣泛，主要以調節腸道菌群提高免疫力為主，其主要來源于乳桿菌屬和雙歧桿菌屬。雙歧桿菌屬下的動物雙歧桿菌乳亞種（Bifidobacterium animalissubsp.lactis）即乳雙歧桿菌（Bifidobacterium lactis）安全性高，使用時間長，在我國《可用于食品菌種名單》和歐盟安全資格認定（qualified presumption of safety，QPS）名單中均有收錄[2,3]。乳雙歧桿菌XLTG11分離自健康嬰兒腸道，具有優良益生特性，在pH 2.5的人工胃液中3 h，存活率為75.01%，之后繼續在pH 8.0的人工消化液中11 h，存活率為89.75%，具有良好的胃腸道消化液耐受性，具有開發為保健食品的優勢。馬微微等[4]發現乳雙歧桿菌XLTG11可以升高小鼠全血白細胞數目、刺激T淋巴細胞增殖分化，增強小鼠細胞免疫與體液免疫功能。此外，乳雙歧桿菌XLTG11可以降低促炎細胞因子表達，增強腸道屏障，調節腸道菌群組成，提高短鏈脂肪酸含量，進而有效緩解葡聚糖硫酸鈉誘導的小鼠潰瘍性結腸炎[5]。環磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）是一種細胞毒化療藥物，對動物的體液和細胞免疫應答具有抑制作用，是制備動物免疫抑制模型的常用藥物[6]。

本研究以CTX構建免疫低下小鼠模型，灌服乳雙歧桿菌XLTG11探討其對小鼠胸腺及脾臟指數、細胞免疫功能、小腸黏膜屏障、免疫球蛋白和炎癥因子的影響，全面評價乳雙歧桿菌XLTG11的免疫調節功能，為益生菌微生態制劑產品的合理應用及保健食品開發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株

乳雙歧桿菌XLTG11，葵花藥業集團有限公司；中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏編號CGMCC No.18738。實驗前將菌株以不同劑量分裝保存于-80 ℃冰箱，用0.4 mL生理鹽水作為溶劑臨用現配。

1.1.2 實驗動物

8周齡健康SPF級雄性BALB/c小鼠（18～22 g），遼寧長生生物技術股份有限公司，動物許可證號：SCXK（遼）2020-0001。實驗動物飼養于屏障環境動物室，期間自由飲水、攝食，溫度控制在20～23 ℃，12 h明暗交替。

1.1.3 主要試劑和儀器

環磷酰胺凍干粉（批號20172225），江蘇恒瑞醫藥股份有限公司；鹽酸左旋咪唑（levamisole hydrochloride，LEV）（批號200102），山西太原藥業有限公司；綿羊紅細胞（SRBC）（批號20210605），上海源葉生物科技有限公司；小鼠免疫球蛋白A（immunoglobulinA，IgA，編號MM-0055M2）、免疫球蛋白G（immunoglobulinG，IgG，編號MM-0057M2）、干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ，編號MM-0182M2）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosisfactor-α，TNF-α，編號MM-0132M2）、白細胞介素2（interleukin，IL-2，編號MM-0701M2）、白細胞介素6（interleukin，IL-6，編號MM-0163M2）試劑盒，江蘇酶免實業有限公司；Donatello脫水機，意大利DIAPATH公司；JB-P5包埋機，武漢俊杰電子有限公司；RM2016病理切片機，上海徠卡儀器有限公司；SORVALL ST8/8R離心機，美國TOMOS公司；Nikon Eclipse E100光學顯微鏡，日本尼康。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及模型建立

空白組和模型組灌服生理鹽水0.4 mL，陽性對照組灌服LEV（10 mg/kg），乳雙歧桿菌XLTG11不同劑量組分別灌服乳雙歧桿菌XLTG11溶液1×106、1×107、1×108、1×109CFU，持續28 d，期間自由飲食。第23、24 d，除空白組腹腔注射生理鹽水外，其余各組小鼠腹腔注射CTX（40 mg/kg），參照文獻[7]方法建立免疫低下小鼠模型。

1.2.2 免疫器官指數測定

實驗第28 d末次給藥30 min后，各組小鼠稱重，脊椎脫臼處死，摘取胸腺和脾臟，剝離表面脂肪，用濾紙吸干表面水分，稱重并按照公式計算胸腺和脾臟指數。

1.2.3 遲發型變態反應（delayed typehypersensitivity，DTH）測定

實驗第23 d，先后用0.2 μL、20 μL 2%（V/V）SRBC間隔4 d對小鼠進行致敏和攻擊。于攻擊前、后24 h分別測量每只小鼠左后足趾部位厚度，同一部位測量三次取平均值，計算足趾厚度差值。

1.2.4 小腸黏膜組織病理變化

小鼠處死后，采集2～3 cm小鼠回腸，4%多聚甲醛固定，經脫水、包埋、切片等步驟制作石蠟切片，HE染色，使用光學顯微鏡觀察小腸黏膜組織病理變化，染色步驟參考文獻操作[8]。

1.2.5 小腸黏膜絨毛高度和杯狀細胞數目測定

使用1.2.4的小腸黏膜組織HE染色切片，選取小腸組織目的區域進行100倍成像，使用Image-Pro Plus 6.0分析軟件，以毫米作為標準單位，分別測量每張切片中5根完整腸絨毛高度（Villus height），并求出平均值。

使用1.2.4的小腸黏膜組織未染色切片，將切片進行碘酸雪夫氏（PAS）染色處理，選取小腸組織目的區域進行100倍成像，使用Image-Pro Plus 6.0分析軟件，以毫米作為標準單位，計數單位長度杯狀細胞數量。

1.2.6 血清中細胞因子水平測定

實驗第28 d末次給藥30 min后，摘除各組小鼠眼球取全血，3000 r/min離心10 min，取血清分裝-80 ℃冰箱冷凍待測。ELISA試劑盒檢測血清IgA、IgG、IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α水平，操作步驟按說明書進行。

1.3 統計學方法

應用SPSS 26.0統計軟件，實驗數據以均數±標準差（±S）表示，單因素方差分析方法進行數據處理，LSD法進行兩兩比較，p＜0.05具有顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 各組小鼠免疫器官指數測定

胸腺是機體最重要的免疫器官，是T細胞分化、發育的場所；脾臟是機體最大的免疫器官，其中的免疫細胞在機體防御和清除功能中具有重要作用[9]。當機體接受抗原刺激后，T淋巴細胞及B淋巴細胞數目增多，相應細胞區體積擴大，免疫器官的體積和重量也隨之增大。因此，胸腺指數和脾指數的高低可以反映機體非特異性免疫水平，在保健品免疫功能評價中具有重要意義[10,11]。田艷等[12]研究了以乳雙歧桿菌為主要成分的益生菌對CTX模型小鼠免疫功能的影響，結果表明CTX可以降低小鼠胸腺和脾指數，經益生菌給藥處理后，小鼠胸腺指數明顯回升，但脾指數無顯著差異。乳雙歧桿菌XLTG11不同劑量組對CTX小鼠胸腺和脾指數的影響如表1所示。與空白組比較，模型組小鼠胸腺指數和脾指數顯著降低（p＜0.05），說明免疫低下小鼠模型構建成功。與模型組比較，陽性對照組小鼠胸腺指數增長43.43%（p＜0.05），XLTG11各劑量組小鼠胸腺指數均增加（p＜0.05），且呈劑量依賴性，其中1×106CFU劑量組增加37.37%（p＜0.05），1×107CFU劑量組增加43.43%（p＜0.05），1×108CFU劑量組增加56.56%（p＜0.01），1×109CFU劑量組增加84.84%（p＜0.001），但各組小鼠脾指數無明顯變化。表明乳雙歧桿菌XLTG11可以拮抗CTX對小鼠胸腺的損傷，回調胸腺指數使其接近正常水平，但不能拮抗CTX導致的小鼠脾臟損傷。

表1 XLTG11不同劑量組對CTX小鼠胸腺和脾指數的影響 Table 1 Effect of different dose groups of XLTG11 on thymus and spleen indexes in CTX mice (±S, n=8)

表1 XLTG11不同劑量組對CTX小鼠胸腺和脾指數的影響 Table 1 Effect of different dose groups of XLTG11 on thymus and spleen indexes in CTX mice (±S, n=8)

注：*p＜0.05，***p＜0.001，與空白組比較；#p＜0.05，##p＜0.01，###p＜0.001與模型組比較。

組別 胸腺指數 脾指數 空白組 2.11±0.36 3.12±0.94模型組 0.99±0.20*** 2.40±0.54*陽性對照組 1.42±0.44# 2.97±0.49 XLTG11（1×106 CFU） 1.36±0.31# 2.69±0.42 XLTG11（1×107 CFU） 1.42±0.41# 2.71±0.50 XLTG11（1×108 CFU） 1.55±0.44## 2.73±0.62 XLTG11（1×109 CFU） 1.83±0.32### 2.89±0.42

2.2 各組小鼠DTH測定

SRBC誘導小鼠DTH評價乳雙歧桿菌對細胞免疫功能的影響[13]，結果如表2所示。與空白組比較，模型組小鼠足跖厚度顯著降低（p＜0.05），XLTG11（1×109CFU）組小鼠足跖厚度增加，增加效果32%（p＜0.05）。與模型組比較，陽性對照組小鼠足跖厚度顯著增加，增加效果58.82%（p＜0.01），XLTG11各劑量組小鼠足跖厚度均增加（p＜0.05），且隨著給藥劑量增大效果越顯著，增加效果分別為38.24%（p＜0.05）、50.00%（p＜0.05）、55.89%（p＜0.01）、94.12%（p＜0.001）。

表2 XLTG11不同劑量組對CTX小鼠足跖厚度的影響 Table 2 Effect of different doses of XLTG11 on plantar thickness of CTX mice (±S, n=8)

表2 XLTG11不同劑量組對CTX小鼠足跖厚度的影響 Table 2 Effect of different doses of XLTG11 on plantar thickness of CTX mice (±S, n=8)

注：*p＜0.05，與空白組比較；#p＜0.05，##p＜0.01，###p＜0.001與模型組比較。

組別 足跖厚度/mm 空白組 0.50±0.04 模型組 0.34±0.08* 陽性對照組 0.54±0.11## XLTG11（1×106 CFU） 0.47±0.12# XLTG11（1×107 CFU） 0.51±0.05# XLTG11（1×108 CFU） 0.53±0.09## XLTG11（1×109 CFU） 0.66±0.24*###

2.3 各組小鼠小腸黏膜組織病理變化

人體70%的淋巴細胞都存在于腸道，腸道具有黏膜免疫功能，是機體最大的免疫器官，其組織結構的完整性可以反應腸道健康狀況，而腸道健康又直接決定了人體健康[14]。研究表明，CTX具有抑制腸道黏膜免疫作用[15]，而乳雙歧桿菌屬益生菌對維持腸道微生態平衡，增強腸道免疫功能尤為重要[16]。各組小鼠腸組織HE染色結果見圖1?？瞻捉M小鼠小腸黏膜組織結構完好，絨毛排列整齊緊密，粗細均勻。模型組小鼠小腸黏膜組織損傷，腸壁變薄，絨毛萎縮長短不一，且排列稀疏。陽性對照組和XLTG11各劑量組小鼠小腸黏膜組織損傷均有改善，絨毛病變程度減輕。隨著劑量增加，小鼠的小腸黏膜損傷情況得到緩解，呈劑量依賴性，以XLTG11（1×109CFU）效果最明顯。

圖1 光學顯微鏡下觀察小腸黏膜組織蘇木精-伊紅（HE）染色（×100） Fig.1 Observation of small intestinal mucosa tissues hematoxylin-eosin (HE) staining under the light microscope (×100)

2.4 各組小鼠小腸黏膜絨毛高度和杯狀細胞數目測定

在小腸黏膜層中，小腸黏膜向管腔內伸出的指狀突起為絨毛，絨毛外部被覆一層單層柱狀細胞，柱狀細胞間的粘液分泌細胞即為杯狀細胞。小腸絨毛高度和小腸與營養物質接觸面積直接相關，絨毛高度是衡量機體生長發育的重要指標，絨毛越高則證明小腸吸收轉化營養物質能力越好，在一定程度上反應化學消化能力以及細胞的更新狀態[17]。杯狀細胞數量與小腸黏膜免疫功能密切相關，杯狀細胞可以調節黏蛋白合成相關過程，參與腸道黏膜屏障構成[18]。Nana Wang等[19]發現乳雙歧桿菌XLTG11可以改善硫酸葡聚糖鈉致小鼠結腸組織結構損傷，拮抗杯狀細胞數目減少，從而增強小鼠腸道黏膜免疫功能。各組小鼠小腸黏膜絨毛高度HE染色結果見圖1，杯狀細胞數目PAS染色結果見圖2，測定結果見表3。與空白組比較，模型組小鼠小腸絨毛高度顯著降低（p＜0.001），杯狀細胞數目降低（p＜0.05）。與模型組比較，陽性對照組小鼠小腸絨毛高度增高，增加效果為16.91%（p＜0.05），杯狀細胞數目增加，增加效果為47.83%，XLTG11各劑量組小鼠小腸絨毛高度均增加，劑量由小到大增加效果分別為15.23%（p＜0.05），15.77%（p＜0.05），16.35%（p＜0.05），20.82%（p＜0.01）。1×107CFU組杯狀細胞數目增加33.59%，1×108CFU增加40.45%，1×109CFU增加51.23%。實驗結果表明，乳雙歧桿菌XLTG11可以提高小腸絨毛高度，增加小腸對營養物質的吸收轉化，增加杯狀細胞數目，拮抗CTX對腸道黏膜造成的損傷，對小鼠腸道黏膜免疫具有明顯增強作用，與Nana[19]研究結果相一致。

圖2 光學顯微鏡下觀察小腸黏膜組織碘酸雪夫氏（PAS）染色（×200） Fig.2 Observation of small intestinal mucosa tissues periodic acid-schiff (PAS) staining under the light microscope (×200)

表3 XLTG11不同劑量組對小腸黏膜絨毛高度和杯狀細胞數目的影響 Table 3 Effect of different doses of XLTG11 on villus height and goblet cell number of small intestinal mucosa (±S, n=8)

表3 XLTG11不同劑量組對小腸黏膜絨毛高度和杯狀細胞數目的影響 Table 3 Effect of different doses of XLTG11 on villus height and goblet cell number of small intestinal mucosa (±S, n=8)

注：*p＜0.05，***p＜0.001，與空白組比較；#p＜0.05，##p＜0.01，與模型組比較。

組別 絨毛高度/mm 杯狀細胞數目空白組 338.22±29.51 23.90±5.01 模型組 264.80±26.27*** 17.06±3.49* 陽性對照組 309.58±51.42# 25.22±5.93## XLTG11（1×106CFU） 305.13±34.31# 19.50±6.77 XLTG11（1×107CFU） 306.57±32.71# 22.79±3.53# XLTG11（1×108CFU） 308.10±38.47# 23.96±5.68# XLTG11（1×109CFU） 319.93±51.5## 25.80±7.90##

2.5 各組小鼠血清IgA、IgG、IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α水平測定

機體內IgA和IgG濃度升高可以說明機體能更好地應對胃腸道中病原體定植的負面影響，從而發揮免疫調節作用[20]。IL-2是T細胞系Th1型細胞因子，可誘導殺傷細胞產生其他細胞因子，如IFN-γ、TNF-α等[21]。IL-6是Th2型細胞因子，主要來自于活化的T細胞和其他免疫細胞分泌[22]，促進B淋巴細胞向漿細胞增殖分化，從而分泌特異性免疫球蛋白參與體液免疫[23,24]。各組小鼠血清細胞因子結果見表4。與空白組比較，模型組小鼠血清IgA、IgG、IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α水平明顯降低（p＜0.05），說明CTX會干擾小鼠血清細胞因子分泌。與模型組比較，陽性對照組小鼠血清IgA、IgG、IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α水平分別升高15.65%（p＜0.01）、23.67%（p＜0.01）、24.92%（p＜0.05）、36.49%（p＜0.01）、15.54%（p＜0.05）、20.39%（p＜0.01）；乳雙歧桿菌XLTG11四個劑量組對IgA、IL-2、和TNF-α含量均有顯著提高作用（p＜0.05），1×108CFU組IgG、IL-6、IFN-γ水平分別升高16.52%（p＜0.05）、21.65%（p＜0.05）、14.10%（p＜0.05）；1×109CFU組分別升高35.60%（p＜0.001）、22.76%（p＜0.05）、18.06%（p＜0.01）。本實驗前期研究結果[4]顯示，乳雙歧桿菌XLTG11對CTX致免疫低下小鼠的脾臟T淋巴細胞亞群平衡具有調節作用，可提高小鼠脾臟T淋巴細胞CD3+、CD19+、CD4+CD8-和CD4-CD8+百分比。研究表明，CD19+參與B淋巴細胞發育再生，促進免疫球蛋白類別轉換，使被激活的B細胞膜表面表達和分泌的免疫球蛋白類別從產生IgM轉換為產生IgG、IgA或IgE，從而升高血清中免疫球蛋白IgA和IgG表達水平[25]。CD4+CD8-和CD4-CD8+T淋巴細胞與細胞因子IL-2和TNF-α呈正相關[26]。因此，我們推測乳雙歧桿菌XLTG11增強小鼠免疫功能是通過刺激淋巴細胞增殖分化，升高B淋巴細胞和T淋巴細胞分泌免疫球蛋白及Th1細胞、Th2細胞因子水平參與機體免疫反應實現的。

表4 各組小鼠血清IgA、IgG、IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α水平 Table 4 Levels of serum IgA, IgG, IL-2, IL-6, IFN-γ, TNF-α of rats in various groups (±S, n=8)

表4 各組小鼠血清IgA、IgG、IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α水平 Table 4 Levels of serum IgA, IgG, IL-2, IL-6, IFN-γ, TNF-α of rats in various groups (±S, n=8)

注：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，與空白組比較；#p＜0.05，##p＜0.01，###p＜0.001，與模型組比較。

組別 IgA/(ng/mL) IgG/(ng/mL) IL-2/(ng/L) IL-6/(pg/mL) IFN-γ/(ng/L) TNF-α/(ng/L)空白組 57.87±3.64 462.19±21.64 700.68±123.49 82.29±7.06 472.73±51.55 467.16±30.28模型組 48.38±3.65** 378.10±92.63** 533.40±65.94** 56.50±13.29*** 403.99±64.51* 412.70±57.50*陽性對照組 55.95±3.66## 467.59±54.35## 666.32±134.02# 77.12±17.49## 466.78±62.60# 496.86±49.31##XLTG11(1×106 CFU) 54.11±3.19# 405.24±35.33 646.22±142.10# 61.59±8.77 399.58±51.32 463.58±38.69#XLTG11(1×107 CFU) 54.75±3.30# 432.87±32.42# 663.80±103.17# 67.96±5.73 433.15±53.26 465.62±41.08#XLTG11(1×108 CFU) 56.95±8.72## 440.56±47.27# 673.12±80.22# 68.73±14.61# 460.97±33.15# 468.12±78.39#XLTG11(1×109 CFU) 58.07±6.85### 512.72±21.05### 725.08±63.62## 69.36±9.44# 476.94±47.67## 472.56±33.93#

3 結論

本實驗研究結果顯示，40 mg/kg CTX連續腹腔注射2 d可顯著降低小鼠胸腺指數和脾指數、降低足跖腫脹度，降低小腸絨毛高度和杯狀細胞數目，降低血清免疫球蛋白IgA、IgG和細胞因子IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α的水平（p＜0.05），成功建立小鼠免疫功能低下模型。在灌胃給予各劑量組乳雙歧桿菌XLTG11干預28 d后，CTX小鼠免疫功能低下情況得到明顯改善，乳雙歧桿菌XLTG11（1×109CFU）組小鼠胸腺指數提高了84.84%，足跖腫脹程度增加了94.12%（p＜0.05），血清細胞因子IgA、IgG、IL-2、IL-6、TNF-γ和TNF-α水平分別升高20.03%（p＜0.001）、35.60%（p＜0.001）、36.03%（p＜0.01）、22.76%（p＜0.05）、18.06%（p＜0.01）、14.50%（p＜0.05），且呈劑量依賴性，表現出增強機體免疫功能的作用。此外，乳雙歧桿菌XLTG11可以緩解小腸黏膜組織損傷，減輕組織病變程度，增加小腸絨毛高度和杯狀細胞數目，1×109CFU組小鼠小腸絨毛高度增加20.82%（p＜0.01），杯狀細胞數目增加51.23%（p＜0.01），表現出較好的黏膜免疫調節和腸道屏障保護作用，具有較強的腸道黏膜免疫增強作用。綜上，乳雙歧桿菌XLTG11具有增強免疫功能作用，且呈劑量依賴性。這一結論為乳雙歧桿菌XLTG11在保健品方面的開發與應用提供了理論支持。