紅參-膠原蛋白肽復配飲品對小鼠造血能力 和免疫調節功能的影響

劉會平，鄧玉娣，涂亞莉，尹漢通，王琳清，魏茜，楊曉娜，廖文鎮*，蔣亮*

（1.時代生物科技（深圳）有限公司，廣東深圳 518115）（2.南方醫科大學公共衛生學院，廣東廣州 510515）

隨著社會經濟水平升高、生活節奏不斷加快，人們也追求更高的物質生活水平。目前市面上存在的飲料已經不能滿足人們的需求，大部分人期望飲料能具有較高的營養價值，如增強免疫力、美白等。因此，大量的功能性飲料也應運而生。查閱大量資料可知，人們已經研究出了各種各樣的功能性飲品，這些飲品大多有抗氧化作用[1,2]，或有增強免疫功能[3,4]等效用。隨著日益沉重的社會壓力和殘酷的社會競爭力，機體免疫能力低下已成為危害現代人健康的重大隱患之一。此外，受到2020年新冠肺炎疫情的影響，人們對自身健康越來越重視，“免疫力”一詞也逐漸成為消費者關注健康的關鍵詞。免疫健康將是功能性食品飲料未來的發展大趨勢和重要增長動力。此外，目前市面上同時具有抗氧化、補氣血和免疫調節作用的固體飲料極少，迫切需要研發和豐富此類飲料。

近年來，復配飲品作為一種飲料新產品逐漸被人們接受并受到廣泛好評。復配飲品是將具有不同營養成分的物質進行不同比例的搭配，使其功能互補，進而提高飲品的營養價值。紅參為人參常用炮制品之一，是一種新資源食品，含有皂苷類、揮發油類、糖類、氨基酸類、微量元素等，主要具有增強免疫、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老和抗疲勞等作用[5]。阿膠肽具有抗氧化、增強免疫力、抗皺延衰、補水保濕和預防骨質疏松的作用[6]。除此之外，魚膠原蛋白肽、酵母β葡聚糖、N-乙酰神經氨酸、雞肉蛋白肽、桂圓粉、紅棗粉、γ-氨基丁酸等活性成分均有補血止血、提高免疫力等作用。針對當前市場需求，通過將以上具有不同營養成分的物質國家固體飲料標準GB/T 29602，復配制成固體飲料。同時，驗證其改善造血功能和提高機體免疫的效果，為其作為一款多功能的食品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

復合固體飲料由時代生物科技（深圳）有限公司提供，主要成分為魚膠原蛋白，是經過魚皮預處理、煮膠、絮凝、棉濾、酶解等生產工藝獲得，其主要成分經檢測為小分子蛋白肽。當歸補血口服液購自鄭州市協和制藥廠?？偪寡趸芰Γ═AOC）檢測試劑盒（FRAP法）、SOD試劑盒、抗氧化能力試劑盒（ABTS法）、GSH-Px試劑盒、MDA試劑盒等檢測試劑購自南京生物。環磷酰胺購自上海源葉。

清潔級C57BL/6 6周齡雄性小鼠60只[許可證號：SCXK（粵）2018-0002]，體質量20～22 g，由廣東省醫學實驗動物中心提供，實驗過程中，所有的實驗操作均在《實驗動物管理條例》[7]的規定下進行，并且符合規定。將實驗室溫度設置在20～25 ℃，濕度60%～80%，讓動物自由飲食。

1.2 儀器與設備

恒溫水浴鍋，揚州三發電子公司；Legend Micro17低溫離心機，美國Thermo；UV-1800可見分光光度計，日本島津；ELX08酶標儀，美國Bioteck；AA-160電子天平，美國DENVER；FCD-217SEN冰箱，中國海爾。

1.3 試驗方法

1.3.1 固體飲料配制

在凈化條件下，將國家新批準的食品與具有抗氧化、增強免疫力作用的天然產物，經過粉碎、過篩和稱量，并按照不同比例進行混合配制，配制完成后再進行灌裝等工序，經檢驗合格。配方見表1。

表1 復合固體飲料的配方 Table 1 Formula of composite solid beverage

1.3.2 食用方法

2.21 g裝復合固體飲料溶于50 mL水中，直接飲用。

1.3.3 抗氧化作用評價

1.3.3.1 ABTS自由基清除率

將標準品原液用蒸餾水分別稀釋成1、0.5、0.25、0.13、0.062、0.031、0 mmol/L濃度，取上述不同濃度的標準品稀釋液（10 μL）和不同濃度的樣品溶液（10 μL）分別加入含有ABTS自由基溶液的檢測溶液（190 μL）中，混勻之后室溫反應6 min，在405 nm波長下測定樣品的吸光度值。同時用10 μL蒸餾水代替樣品溶液，進行空白對照組實驗，每個濃度重復3次。

1.3.3.2 總抗氧化能力TAOC

標準曲線繪制：將20 μmol/mL FeSO4標準溶液等比稀釋（0.4、0.2、0.1···），吸取100 μL標準溶液和蒸餾水（作空白），分別加入100 μL試劑盒檢測試劑二，充分混勻，反應10 min，用雙蒸水調零，測定A593nm，計算?A=A標準-A空白。

首先預熱分光光度計或酶標儀30 min以上，將波長調至593 nm，同時用蒸餾水調零。取混合檢測試劑180 μL、不同濃度的樣品6 μL、雙蒸水180 μL，充分混勻，反應10 min，雙蒸水調零，吸取200 μL于96孔板，測定593 nm吸光值。計算?A’=A測定-A對照。

以Fe2+終濃度為橫坐標，以?A為縱坐標繪制標準曲線，得到線性回歸方程y=kx+b，將?A’帶入方程求得x（μmol/mL）。計算公式（根據試劑盒說明書提供，按液體體積計算）：

總抗氧化能力/(μmol/mL)=x×v反總÷v樣=34×x。

式中：

v樣總——加入提取液的體積（1 mL）；

v反總——反應總體積（0.20 mL）；

v樣——反應中樣品體積（0.006 mL）。

1.3.4 免疫調節作用評價

1.3.4.1 氣血雙虛模型建立與分組干預：

參考Gao等[8]的方法進行造模。從動物中心引進60只小鼠，適應性飼養1周后，隨機選取50只用于造模，造模4 d。造模第1 d，造模組每只小鼠尾部放血0.25 μL/g，在第2 d腹腔注射環磷酰胺80 mg/kg，在第4、6、8天腹腔注射環磷酰胺40 mg/kg，注射前禁食不禁水12 h。剩余10只小鼠尾部不放血，腹腔注射同等體積的生理鹽水（作空白對照組）。

將隨機選取的50只氣血雙虛模型小鼠隨機分為5組，每組10只，高（400 mg/kg）、中（200 mg/kg）、低（100 mg/kg）劑量組分別灌胃復配飲料，陽性對照組灌胃當歸補血口服液（6.60 mL/kg），模型組僅灌胃同等體積的生理鹽水（20 mL/kg），1次/d，連續灌胃15 d。于末次給藥2 h后觀察小鼠的整體情況，然后尾部取血進行相關指標檢測。

1.3.4.2 基本情況

觀察小鼠的活躍度、毛發顏色光澤整齊度、鼠耳鼠尾等情況，記錄小鼠體重變化。

1.3.4.3 全血細胞檢測

灌胃15 d后，禁食12 h，稱重。各組動物眼眶取血，隨后使用全自動血液細胞分析儀（BC-2800vet）對小鼠全血進行分析。

1.3.4.4 臟器指數與病理切片

解剖小鼠后，收集小鼠內臟先用生理鹽水沖洗，再用濾紙吸干并稱重，計算臟器指數。將一部分臟器用多聚甲醛溶液浸泡固定，用于制作病理切片，余下的部分則裝入凍存管，貯存于-80 ℃冰箱中待用。

病理切片的制作過程[9]：樣品浸泡在多聚甲醛中48 h后，修整組織，用無水乙醇脫水，二甲苯透明組織后，將組織進行浸蠟包埋處理。隨后將蠟塊切片，貼片，脫蠟，染色，中性樹膠封存。最后使用顯微鏡觀察切片，并拍照。

1.3.4.5 氧化應激評價

用試劑盒測定小鼠血清中超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的活性以及丙二醛（MDA）的含量水平[10]。操作步驟和分析過程均按照相應試劑盒說明書進行。

1.4 統計學處理

采用SPSS 25.0軟件完成統計工作，數據以XSD± 表示，多組之間采用方差分析比較，組間比較采用t檢驗，顯著水平為p＜0.05。

2 結果與分析

2.1 復合固體飲料的抗氧化作用

如圖1所示，ABTS標準曲線的決定系數R2=0.9996，表明標準曲線的相關性較高。ABTS+·是一種人工合成自由基，因其較穩定常用于檢測抗氧化能力。該自由基在414、645、734和805 nm處可獲得最大吸收峰。ABTS+·與抗氧化劑反應之后變成無色的ABTS，通過檢測吸光度的變化測量抗氧化劑抗氧化作用的能力[11]。測得的結果以trolox equivalent antioxidant capacity trolox當量抗氧化能力表示，即被測抗氧化劑清除ABTS+·的能力（吸光度大小的變化）與標準抗氧化劑trolox（VE的水溶性類似物）清除ABTS+·的能力的比值。由圖3可知，紅參魚膠原蛋白肽復配飲品均有比較高的ABTS清除能力，具有一定的體外抗氧化能力，并且，隨著濃度增加，樣品的ABTS自由基清除率也隨之提高。

圖1 ABTS標準曲線 Fig.1 The standard curve of ABTS

圖3 樣品的ABTS自由基清除率 Fig.3 The ABTS free radical scavenging rate of the samples

TAOC是反映活性物質抗氧化性能的一個重要指標[12]。其檢測原理是，Fe3+被還原后可與斐林類物質結合形成穩定的絡合物，通過比色反應檢測其抗氧化力。由圖2可知，TAOC標準曲線的決定系數R2=0.9998，表明TAOC標準曲線的相關性較高。由圖4可知，本復配飲品具有一定的抗氧化能力，在100 mg/mL濃度下，總抗氧化能力可達0.25 U/mL；且在其他條件一致下，隨著濃度升高，其抗氧化能力也逐漸增強。

圖4 樣品的抗氧化活性（TAOC） Fig.4 The antioxidant activity (TAOC) of the samples

2.2 復合飲料對氣血兩虛模型小鼠基本情況的影響

實驗期間，空白對照組小鼠活動及皮毛顏色均正常；而模型組小鼠活動減少，小鼠尾部和耳尖毛色明顯變淺，被毛粗亂、蓬松、欠缺光澤；三種不同劑量（高、中、低）干預組與當歸補血口服液（陽性）組小鼠的活躍度及精神狀態隨著時間的延長均有所好轉。由圖5和圖6可知，實驗初期，各組小鼠體重無明顯差異，且小鼠體重隨時間的增長均有不同程度的增加，其中，對照組的體重有明顯增加，p＜0.05，差異有顯著性，且增長速度較快。其他組小鼠，由于進行了放血和注射環磷酰胺的操作，比較虛弱，體重比對照組輕，一定劑量的飲品組干預后，體重有所上升。但在本實驗中，差異不顯著，這可能是由于干預時間較短。

圖5 小鼠體重變化曲線 Fig.5 The change curve of mice body weight

圖6 小鼠初始體重與最終體重 Fig.6 Initial and final body weight of mice

2.3 復合飲料對氣血兩虛模型小鼠血常規的影響

血常規是目前臨床上常用的基本檢測指標，可以初步判斷機體的生理及病理狀態，其中，白細胞、淋巴細胞、單核細胞和中性粒細胞是機體白細胞的重要組成部分，在免疫系統中起著核心作用。紅細胞、血紅蛋白主要反映機體的造血功能，而血小板主要功能是止血。如表2所示，與對照組相比，模型組小鼠血常規指標（如淋巴細胞、血小板、白細胞和中性粒細胞）水平均顯著降低，p＜0.05，差異有顯著性，說明復制氣血雙虛模型成功。這與劉培建等的動物造模結果基本吻合[13]。與模型組相比：高劑量飲料組能顯著升高（p＜0.05）小鼠全血中的淋巴細胞、白細胞和血小板水平，使其趨近于正常水平，提示本復配飲品可以顯著改善氣血雙虛小鼠的造血功能，同時對免疫功能也有較好調節作用。與模型組相比：陽性藥物組（當歸補血口服液）也能升高小鼠血常規指標（白細胞、淋巴細胞和血小板），p＜0.05，差異結果具有顯著性，使其趨近于正常水平。白細胞數目和淋巴細胞數目與免疫力相關，而血小板數目則與凝血功能有關。從以上結果可知，服用紅參魚膠原蛋白肽飲品的小鼠相比于氣血雙虛模型小鼠，白細胞、淋巴細胞和血小板的數目均得到了恢復，小鼠的免疫力和凝血功能也有所提高，可證明本復配飲品可以改善氣血雙虛所致的小鼠血常規指標降低和免疫力下降的現象，可增強氣血雙虛小鼠的血液系統和免疫系統能力，具有改善小鼠造血功能的效果。

表2 各組小鼠的血常規情況 Table 2 Blood routine conditions of mice in each group (ˉX±SD, n=5)

2.4 復合飲料對氣血兩虛模型小鼠臟器指數與脾臟病理的影響

免疫器官按其功能可分為中央免疫器官和外周免疫器官。中央免疫器官主要包括骨髓和胸腺，是免疫細胞發生、分化和成熟的地方。外周免疫器官主要包括脾臟、淋巴結和其他淋巴組織，是免疫細胞沉降、增殖和發生免疫反應的場所[14]。脾臟和胸腺作為重要的免疫器官，復合飲料對脾臟指數和胸腺指數的影響可作為研究動物模型免疫機制的初步指標。由表3可知，模型組小鼠的胸腺指數與脾臟指數相比對照組均有顯著降低（p＜0.05）。而一定劑量的復配飲品干預后，這兩個臟器指數均有所增大。其中，中劑量組的小鼠胸腺指數相比模型組有所增大（p＜0.05）；中、高劑量組小鼠脾臟指數相比模型組顯著增大（p＜0.05）。6個組之間的肝臟指數差異無統計學意義。以上結果均說明，本復配飲品可有效調節氣血雙虛小鼠的免疫力。

表3 各組小鼠的臟器指數 Table 3 Organ indices of mice in each group (ˉX±SD, n=5)

對小鼠脾臟行HE染色（圖7），可以看到，正常對照組小鼠脾小結大而多、脾臟紅潤且白髓清晰，脾中央周圍淋巴細胞密度較大。而模型組小鼠的脾臟結節數量和面積顯著減小。復配飲品干預組與陽性藥物組小鼠的脾臟形態與模型組相比，小鼠脾小結數目增多且面積增大，脾臟更為紅潤，白髓更清晰，且細胞密度顯著增加，趨近于正常對照組脾臟形態。上述病理分析表明，本復配飲品可明顯改善由氣血雙虛所致的脾臟損害。

圖7 各組小鼠的脾臟切片 Fig.7 Spleen sections of mice in each group

2.5 復合飲料對氣血兩虛模型小鼠氧化應激的影響

氧化應激是指機體在受到內外界有害刺激時，體內氧化系統和抗氧化系統失衡，導致其在體內大量積累超出組織負荷，從而引發組織發生氧化損傷的過程[15]。超氧化物歧化酶（SOD），在體內可與O2-·發生抗氧化反應，將對機體有害的物質轉化為無害的物質，顯著降低機體的氧化應激水平[16]。谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）是機體內常見的一種重要的過氧化物分解酶。主要是催化谷胱甘肽（GSH）參與過氧化反應，促進游離過氧化氫和脂質過氧化物的分解，以及清除在細胞呼吸代謝過程中產生的過氧化物和羥自由基，減輕細胞膜多不飽和脂肪酸的過氧化作用[17]。在機體內，自由基可作用于脂質發生過氧化反應，產生丙二醛（MDA），而MDA又會引起蛋白質、核酸等生命大分子的交聯聚合反應，且具有細胞毒性。據研究發現，MDA含量可通過機體脂質過氧化速率和強度直接反映機體潛在抗氧化能力，同時也能反映組織過氧化損傷程度[18]。而氧化應激與免疫功能存在關聯[19,20]。免疫細胞的細胞膜中含有不飽和脂肪酸，所以對氧化應激十分敏感，在受到自由基攻擊后，免疫功能極易受到影響[21]。在前述體外實驗中，已證實復合飲料具有體外抗氧化作用。接下來，對其體內抗氧化作用進行研究。由圖8可以看出，模型組相比于對照組，GSH-Px活性和SOD活性均顯著降低，而MDA含量顯著升高，差異有統計學意義（p＜0.01），說明模型組小鼠處于氧化應激狀態。低、中、高三組劑量小鼠與模型組相比，GSH-Px與SOD酶活性均有所升高，差異具有統計學意義（p＜0.05）。此外，高劑量組的MDA含量顯著低于模型組（p＜0.05）。這提示，此飲品可顯著增強氣血兩虛小鼠抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性同時降低MDA的含量，具有提高氣血兩虛小鼠抗氧化能力的作用。

圖8 飲料對小鼠氧化應激指標的影響 Fig.8 The effect of beverages on oxidative stress indicators in mice

3 結論

本研究結合當前市場需求，以紅參、阿膠肽為主要原料，以魚膠原蛋白肽、酵母β葡聚糖、N-乙酰神經氨酸、雞肉蛋白肽、桂圓粉、紅棗粉、γ-氨基丁酸為輔料，開發出了一種復合功能飲料，同時考察該飲料的抗氧化能力、對機體免疫功能的影響。結果證明，此固體飲料具有清除自由基的能力，在100 mg/mL濃度下，總抗氧化能力可達0.25 U/mL，顯著增強了小鼠的抗氧化能力，減輕氧化損傷。紅參中含有皂苷、糖類、氨基酸類等營養物質，具有較強的抗氧化活性，而其總抗氧化能力與紅參中的皂苷和還原糖顯著相關，因此本飲品具有較好的抗氧化能力很可能與其將紅參作為主要原材料有關。此外，阿膠肽具有預防骨質疏松、增強免疫力和抗氧化等功能；魚膠原蛋白肽、酵母β葡聚糖、N-乙酰神經氨酸、雞肉蛋白肽、桂圓粉、紅棗粉、γ-氨基丁酸等成分均具有補血止血、提高免疫力的作用。在本實驗中，增強了氣血雙虛模型小鼠的免疫力和凝血功能，對脾臟損傷有改善作用，可降低MDA的含量及增強小鼠抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性。在本次實驗中，模型組小鼠的胸腺指數與脾臟指數與對照組相比均顯著降低（p＜0.05）。而一定劑量的飲品干預后，這兩個指數均有所增大。其中，中劑量組的小鼠胸腺指數顯著大于模型組（p＜0.05）；中、高劑量組的小鼠脾臟指數顯著大于模型組（p＜0.05）。此外，該飲品對氣血雙虛小鼠的血液系統也有一定的增強作用，起到了改善造血功能的效果。該復合飲料不僅風味獨特，而且還具有抗氧化，改善造血功能和增強免疫功能的功效。綜上可知，這款復合飲料攜帶服用方便，配方科學合理，制造方法容易，是一款極具開發潛力的食品，在食品行業有著廣闊的應用前景。后續可以就該功能飲料在調節免疫功能及其作用機理上作更深入的研究。