花生瘡痂病菌全基因組PKS基因簇挖掘及毒素生物合成基因ESCB1生物信息學分析

張曉天，付祎瑋，焦文莉，樸靜子，李洋，李自博，周如軍

（沈陽農業大學植物保護學院，遼寧 沈陽，110866）

花生瘡痂病是花生產業中重要病害之一，在我國各主要花生產區均有發生危害，植物發病葉片、葉柄和莖稈等產生大量褐色、圓形或卵圓形病斑，病斑中部稍凹陷，呈“火山口”狀，可導致發病部位扭曲畸形，植株矮化，一般田間發病率10%～30%，損失嚴重[1]?；ㄉ忦璨【‥lsino? arachidis）可產生一種具有光敏活性的苝醌類真菌毒素—痂囊腔菌素（Elsinchrome，ESC），在光照條件下產生大量活性氧，導致細胞膜脂過氧化、電解質泄漏、膜通透性降低，最終細胞死亡，是花生瘡痂病菌關鍵的致病因子，在病菌侵染和病斑擴展過程中發揮著重要作用[2～4]

植物病原真菌毒素致病作用、生物合成途徑及調控網絡研究對于揭示病菌的侵染機制、致病機理和病原寄主互作具有重要意義。前期研究表明，毒素的生物合成一般由編碼聚酮合酶（polyketide synthase，PKS）的基因所在的基因簇進行調控[5]。如涉及尾孢菌素（Cercosporin）、黑粉菌素（Ustilaginoidins）和伏馬菌素（Fumonisin）生物合成的CTB、Ugs 和FUM基因簇等，當PKS基因被靶向敲除或沉默時，毒素生物合成途徑受到阻滯，毒素生物合成受到抑制[6～8]。目前ESC的生物合成途徑及調控機制研究尚處于初始階段，僅在柑橘瘡痂病菌（Elsino? fawcettii）中初步闡明了聚酮合酶EfPKS1基因是毒素生物合成的關鍵基因[9,10]，鋅指轉錄因子EfSTE12基因缺失，毒素積累減少，果膠酶和蛋白水解酶活性升高[11]，而基因簇中其他基因功能尚不清晰，生物合成途徑和調控網絡尚未解析，需進一步研究揭示。

近年來，全基因組測序技術和生物信息學的快速發展，可以便捷地從基因組中挖掘特定功能基因或基因簇，研究其生物功能，在基因水平為植物病原真菌遺傳、次生代謝、生物合成途徑及病原寄主互作科學問題提供可靠的分子證據[12,13]。前期研究發現花生瘡痂病菌ESC 的積累量與致病性呈顯著性正相關，是病菌重要的毒力因子[14]，項目組對病菌進行了全基因組測序，大小為33.18 Mb[15]。本文在此基礎上，進一步開展了E.arachidis次生代謝相關PKS 基因簇挖掘、毒素生物合成相關基因ESCB1克隆和生物信息學分析，旨在為解析ESC 生物合成途徑、構建調控網絡和闡明病菌致病機制提供前期理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：花生瘡痂病菌（E.arachidisLN-JHC01），分離自遼寧錦州花生種植基地。

1.2 PKS基因簇的挖掘

利用antiSMASH 在線網站（https://bitbucket.org/antismash/antiSMASH5.0/）預測和分析次級代謝產物基因簇，通過NRPS-PKS knowledgebase（http://www.nii.ac.in/～pksdb/sbspks/master.html）對預測結果進行驗證后，篩選出PKS基因簇。

1.3 PKS基因簇的功能預測

根據antiSMASH 搜索已知功能的同源基因簇，并預測基因簇中合成基因對應產物的核心結構，初步判斷基因簇代謝產物，利用NCBI BLAST（https://blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi）對基因簇所有同源序列進行同源比對，初步確定基因功能。

1.4 ESCB1基因的克隆

根據ESCB1基因組序列，利用Primer5.0 引物設計軟件設計全長引物ESCB1-F（TCGATTGCTTTCCCTGGAA）/ ESCB1R （CCTTGATGCTCCTCTTGATA），以DNA 為模板PCR 擴增，擴增條件為：95℃預變性10 min；95℃變性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸2 min，35個循環；72℃終延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳，PCR產物由上海生工生物工程公司測序。

1.5 ESCB1基因生物信息學分析

利用ORF Finder（http://www. bioinformatics. org/sms2/orf_find.html）、ProtParam（https://web.expasy.org/protparam）、NetPhos 3.1 Server（http://www.cbs.dtu. dk/services/NetPhos/）、InterPro（http://www. ebi.ac. uk/interpro/scan. html）、蛋白二級結構預測網站（https://npsa-prabi. ibcp. fr/cgi-bin）、蛋白三級結構預測網站（https://www. swissmodel. expasy. org）等在線軟件獲得開放閱讀框、外顯子、內含子信息，預測編碼蛋白的理化性質、保守結構域等。通過MEGA 7.0 軟件構建系統發育樹。為了可視化蛋白質結構域架構，使用軟件DOG 2.0 繪制ESCB1基因結構域。

1.6 ESC毒素的提取及含量測定

ESC毒素的提取及含量測量參考劉璐方法[16]。

1.7 ESCB1的表達分析

菌懸液涂布于PDA 培養基中黑暗培養14 d 后光照培養2 d，刮取菌絲，利用Eastep Super 總RNA提取試劑盒（普洛麥格生物技術有限公司）提取總RNA，HiFiScript cDNA Synthesis Kit 反轉錄試劑盒（康為世紀公司）進行反轉錄得到cDNA，以Actin基因為內參，以黑暗培養16 d 為對照，qPCR 測定ESCB1表達量。

2 結果與分析

2.1 全基因組中PKS基因簇預測分析與篩選

通過antiSMASH5.0 預測和NRPS-PKS knowledgebase 驗證，E.arachidis基因組中共發現次級代謝基因簇22 條，其中t1PKS 基因簇5 條，PKS-NRPS基因簇1條，結果如表1所示。

表1 PKS基因簇信息表Table 1 PKS sequence information

基因簇中所含有的編碼基因數量及分布各不相同。繪制PKS基因結構域發現PKS的保守結構域包括?；D移酶（acyltransferase，AT）、酮基合酶（ketosynthase，KS）、脫水酶（dehydratase，DH）、甲基轉移酶（methyltransferase，MeT）、?；d體蛋白（acylcarier protein，ACP）和具有還原活性的烯脂酰還原酶（enoylreductase，ER）、酮體還原酶（ketoreductase，KR）等結構域（圖1）。根據其結構域類別不同劃分為 非 還 原 型（EVM0004732、EVM0003759、EVM0005880） 和 還 原 型 （EVM0005988、EVM0002563、EVM0006869）兩類。根據基因簇產物類型，大小和結構組成，編號為3.3 的基因簇為ESC 生物合成關鍵基因簇，命名為ESCB 基因簇，核心PKS基因EVM0003759命名為ESCB1。

圖1 聚酮合酶結構域分析Fig.1 Analysis of Elsino? arachidis polyketide synthases(PKS)proteins domains

2.2 ESCB基因簇功能分析

該基因簇位于基因組的3 516 380～3 563 171 bp位置，長度約為47 kb，含有12 個編碼基因，分別命名為ESCB1～ESCB12（圖2）。以PKS 編碼基因為核心[17～19]，包括超家族轉運蛋白（major facilitator superfamily transporter，MFS）編碼基因[6]，鋅指轉錄因子（zinc finger transcription factor）編碼基因[11]，細胞色素P450（cytochrome P450）編碼基因[20]，O-甲基轉移酶（o-methyltransferase）編碼基因[21]和單加氧酶編碼（monooxygenase）基因[22]等生物合成相關基因。

圖2 ESCB基因簇分布圖Fig.2 Distribution of the ESCB gene cluster

2.3 ESCB1基因克隆

以DNA 為模板，使用全長引物ESCB1F/ ESCB1R 和長鏈高保真酶進行PCR 擴增，瓊脂糖凝膠電泳（圖3），獲得的清晰明亮PCR 條帶，測序分析后確定ESCB1基因全長為6636 bp。

圖3 ESCB1基因PCR電泳圖Fig.3 PCR electrophoresis result of ESCB1 gene

2.4 ESCB1生物信息學分析

2.4.1 系統進化分析 將ESCB1基因編碼蛋白與柑橘瘡痂病菌（Elsino? australis）、柳樹瘡痂病菌（Sphaceloma murrayae）、竹黃菌（Shiraiasp.）等真菌編碼的聚酮合酶編碼蛋白進行相似性分析。結果顯示，ESCB1 蛋白與E.australis的Eapks 蛋白及S.murrayae的CQ-2017a 蛋白親緣關系最近（圖4），相似性為91%（圖5）。Eapks 和CQ-2017a 均參與ESC生物合成，因此，初步認為ESCB1基因參與花生瘡痂病菌ESC的生物合成。

圖4 ESCB1系統進化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree of ESCB1

圖5 ESCB1基因編碼蛋白與其他蛋白序列對比分析Fig.5 Amino acid sequences of ESCB1 and other protein

2.4.2 開放閱讀框、外顯子和內含子分析 利用ORF Finder 對ESCB1基因進行分析，ESCB1基因具有一個完整的開放閱讀框（圖6）。該基因編碼長度為2212 個氨基酸的蛋白序列。利用在線分析工具Softberry 對ESCB1基因全長的外顯子和內含子進行預測，并與cDNA 進行序列對比。結果顯示，ESCB1基因包含4個外顯子區域及3個內含子區域。

圖6 ESCB1基因ORF分析Fig.6 ORF analysis of ESCB1

2.4.3 編碼蛋白結構域分析 利用IntroPro 在線分析網站對蛋白的結構域進行分析，ESCB1基因編碼蛋白包括長度為240 個氨基酸的啟動單元（SAT），434 個氨基酸的KS，301 個氨基酸的AT，316個氨基酸的DH，長度分別為77 個氨基酸和75 個氨基酸的ACP以及253個氨基酸的TE（圖1）。

2.4.4 蛋白理化性質分析及親疏水性 利用Prot-Param 對ESCB1基因編碼蛋白的理化性質進行預測，編碼蛋白包含2212 個氨基酸，分子量為238.84 kDa，理論等電點（pI）5.65。推測該蛋白分子式為C10594H16718N2890O3240S76，原子總數為33 518。該蛋白脂溶性系數為86.92，不穩定系數（Ⅱ）為41.44，親水性系數（GRAVY）為-0.144。親疏水性結果分析表明（圖7），ESCB1編碼蛋白在643 位的I 有最大值為2.333，在2015 位的E 有最小值為-2.789，親水性最強，多肽鏈表現出親水性。

圖7 ESCB1基因編碼蛋白親疏水性Fig.7 Hydrophilicity of ESCB1 protein

2.4.5 編碼蛋白磷酸化位點分析及亞細胞定位利用NetPhos 3.1 Server 在線工具軟件對ESCB1基因編碼蛋白磷酸化位點進行分析，結果顯示，該蛋白含有多個可被磷酸化氨基酸殘基，說明該蛋白可被激酶磷酸化后發揮作用（圖8）。利用亞細胞定位在線分析工具分析，ESCB1 蛋白定位在細胞葉綠體中。

圖8 ESCB1蛋白磷酸化位點預測Fig.8 prediction of ESCB1 protein phosphorylation sites

2.4.6 編碼蛋白二、三級結構 根據分析結果可知ESCB1基因編碼蛋白含有的二級結構中，α-螺旋和無規卷曲是蛋白酶中的主要結構元件占總蛋白的73.72%，而β-轉角和延伸鏈則散布于整個蛋白中（圖9A）。利用在線Swiss-model 分析工具發現ESCB1基因編碼蛋白的三級結構與Cercosporin合成相關基因CTB1基因編碼的蛋白三級結構覆蓋率為56.68%。以該蛋白晶體結構作為模板，構建了三維結構模型如圖9B所示。

圖9 ESCB1基因編碼蛋白二級結構（A）和三級結構預測（B）Fig.9 Secondary structure(A)and tertiary structure(B)prediction of ESCB1 coding protein

2.4.7 蛋白信號肽及跨膜結構預測 利用在線工具分析ESCB1 蛋白是否存在信號肽（SPI）及信號肽的剪切位點（CS），結果顯示編碼蛋白不存在Sec/SPI結構與CS，說明蛋白可能是非分泌蛋白，主要分布于細胞內。使用在線工具預測ESCB1基因跨膜結構，分析結果可知，ESCB1基因編碼蛋白不存在跨膜結構域，該蛋白質為非膜蛋白。

2.4.8ESCB1表達分析 前期光生物學研究證實E.arachidis中ESC的生物合成在光照和黑暗條件下具有顯著差異[23]，光照條件下菌落為紅色，周圍產生紅色暈圈，產毒量為54 nmol/plug，黑暗條件下菌落為淡黃色，未檢測到毒素的合成。為進一步明確ESCB1是否參與ESC 的生物合成，分別檢測該基因在光照和黑暗條件下的mRNA 表達水平，結果表明，光照條件下ESCB1的表達量為黑暗對照的3.24倍，且表達模式與毒素在光暗條件下的變化趨勢相同（圖10）。

3 結論與討論

基因組挖掘是以基因簇序列為指導預測次生代謝產物的一種新型生物信息學分析方法，同時還能直接將次生代謝產物結構與合成途徑關聯，方便進行生物合成和組合生物合成研究等[24,25]。AntiSMASH 是微生物次生代謝產物生物合成基因簇預測及組成結構分析網站，可以在整個基因組范圍內進行PKS 及NRPS 基因簇篩選，對基因簇組成結構和產物進行初步分析和預測，為解析生物合成途徑提供理論基礎。真菌次生代謝產物生物合成基因一般在基因組中緊密成簇，稱為次生代謝產物生物合成基因簇[5]。如C.nicotianae和Ustilaginoidea virens等真菌中Cercosporin 和Ustilaginoidins 生物合成相關基因均成簇存在，組成CTB 基因簇和Ugs基因簇，大量研究解析了基因簇的組成及相關基因功能，極大促進了病菌致病機制領域的研究進展[7,20]。本研究在全基因組測序的基礎上，發現E.arachidis基因組中含有6 條與次生代謝密切相關的PKS 和PKSNRPS 基因簇，通過生物信息學分析，挖掘出ESC 生物合成ESCB 基因簇。該基因簇上包含PKS 編碼基因，MFS 編碼基因，鋅指轉錄因子編碼基因等12 個預測功能基因，但基因簇中各基因的生物學功能尚需要進一步驗證。

目前研究表明，ESC 毒素在E.fawcettii中經由PKS 途徑生物合成，但基因簇中各編碼基因的功能尚未完全解析。本文通過基因克隆、同源聚類和生物信息學分析，E.arachidis中PKS 編碼基因ESCB1與Cercosporin 和Hypocrellin 生物合成PKS編碼基因CTB1和SbaPKS高度同源[18,19]，初步認為ESCB1基因是花生瘡痂病菌中ESC 生物合成的關鍵編碼基因，并得到了ESCB1基因的序列全長、結構域和磷酸位點等大量分子信息，為該基因功能的深入研究提供了分子數據基礎。為了進一步驗證，本文進一步開展了毒素含量與表達量相關性研究，結果表明，ESCB1表達量與ESC 含量趨勢基本相同，且受光照正向調控，調控模式與C.nicotianae相似[19]，但與Aspergillus nidulans光調控模式不同[26]，說明PKS 編碼基因在不同真菌中雖然生物功能類似，但調控表達模式差異較大，因此，為了明確花生瘡痂病菌毒素生物合成途徑及致病機制，應進一步開展ESCB1基因功能、基因簇解析及調控網絡研究工作。