基于兩種熒光染料的內標比率型熒光探針檢測水體中銀離子

汪 鵬，熊威威，李文恒，翟 琨?，向東山?

1. 湖北民族大學生物資源保護與利用湖北省重點實驗室，湖北恩施445000；2. 湖北民族大學化學與環境工程學院，湖北恩施445000

0 引 言

銀（silver，Ag）是一種重要的過渡金屬，廣泛應用于醫藥、電子、攝影、化妝品等領域［1］。Ag+是銀在自然界中一種常見的存在形式，在低濃度時具有很強的抗菌活性［2］，可以通過抑制游離巰基蛋白酶的活性抑制其生物學功能。隨著銀在各個領域的廣泛應用，排放到自然界中的Ag+越來越多，Ag+進入到水和土壤后，可以被植物根系吸收，再通過食物鏈進入人體，對人類健康構成威脅。據報道，人體內Ag+過多會導致精氨酸缺乏癥，還會對腦部、皮膚、眼睛、肝臟、腎臟和腸道造成損害［3］。因此，建立簡單、快速且準確的Ag+定量檢測方法具有十分重要的意義。

分子熒光定量檢測法具有選擇性好、靈敏度及準確度高、檢測速度快等優點，因此基于分子熒光分光光譜法對Ag+的檢測近年來引起了國內外科研工作者的較多關注［1，4，5］。但目前的工作多是利用單一發射波長的熒光信號對Ag+進行定量檢測，測定結果受環境因素影響較大，檢測結果的重復性較差。比率型熒光探針是一種通過兩個熒光信號強度比值的變化實現對目標物的定量檢測的方法，檢測結果受環境因素影響小，方法重復性更好、準確度更高［6～8］。目前，基于比率型熒光探針對Ag+進行定量檢測已有報道：Lu 等［9］利用離子印跡比率熒光探針實現了對Ag+的定量檢測；Jiao 等［10］利用無標記的比率熒光碳點實現了對Ag+的定量檢測；Li等［11］合成一種硫黃素T 的有機/無機雜化納米材料實現了Ag+的比率熒光定量檢測。但這些方法還存在一些不足之處：一是需要合成納米材料或有機物作為熒光探針，且合成過程較為復雜；二是熒光探針所產生的信號強度較弱，不適于Ag+的痕量檢測。

核酸適配體（aptamer）是一種能特異性識別相應靶標分子的單鏈核酸［12，13］。據報道，Ag+的核酸適配體已被篩選出來且得到了較多應用［14～17］。SG（SYBR GreenⅠ）是一種非常靈敏的核酸染料，在水溶液中的背景熒光很弱，但與雙鏈DNA（dsDNA）結合后熒光信號會顯著增強［18，19］。本文擬利用熒光染料TAMRA 標記的核酸適配體及核酸染料SG 構建一種能特異性識別Ag+的比率型熒光探針，實現對Ag+高選擇性的定量檢測。

1 實驗部分

1.1 主要儀器及試劑

儀器：RF-5301PC 型分子熒光光譜儀（Shimadzu公司），AA800 型原子吸收光譜儀（Perkin-Elmer 公司）及Ethos Plus 型微波消解系統（Milestone公司）。

試劑：硝酸銀（AgNO3）為優級純，其他化學試劑均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司；SG 生物試劑原液（上海瑞安生物技術有限公司）是用無水二甲基亞砜（DMSO）配制的10 000 倍濃縮液，使用時用雙蒸水稀釋10 000 倍配制成工作液；緩沖溶液為0.1 mol/L 的Tris-HNO3緩沖溶液（50 mmol/L NaNO3，pH 7.8）；熒光染料TAMRA 標記的Ag+核酸適配體委托上海生工生物技術有限公司合成，其核苷酸堿基序列為：5′-TCTC TCT TCT CTT CAT AAA TCA ACA CAA CAC ACA-（CH2）6-TAMRA-3′（斜體部分為Ag+的適配體）；實驗用水均為雙蒸水。

1.2 熒光探針的制備

將TAMRA 標記的Ag+核酸適配體用0.1 mol/L Tris-HNO3緩沖溶液配制成濃度為5×10-7mol/L 的儲備液。先將50 μL 不同濃度（4×10-8～2.4×10-6mol/L）的AgNO3溶液加入到50 μL 5×10-7mol/L TAMRA 標記的核酸適配體中，再加入100 μL SG工作液，最后加入Tris-HNO3緩沖溶液至終體積為500 μL，混合均勻，用水浴鍋加熱至35 ℃，反應9 min。停止反應，冷卻至常溫后測定體系的熒光強度。在優化實驗條件時，TAMRA 標記的核酸適配體濃度均為5×10-8mol/L，Ag+的濃度均為2.4×10-7mol/L。

1.3 水樣的采集與消解

自來水樣取自湖北民族大學生物資源保護與利用湖北省重點實驗室，天然礦泉水樣取自湖北省恩施市龍洞河源頭，取樣時間均為2019 年10 月8 日中午。自來水取樣時，先放水5 min 后再采集，天然礦泉水在水深20 cm 處采集水樣，所取水樣清澈透明、無色、無懸浮雜質和沉淀，水樣帶回實驗室后冷藏保存。水樣的消化步驟為：準確量取10 mL 水樣于消解罐中，加入6 mL 濃HNO3和4 mL H2O2，置于微波消解系統中進行消解。消化的升溫程序為：先加熱到120 ℃保持30 min，再升溫到140 ℃保持20 min，最后升溫至180 ℃保持20 min，消解完成后自然冷至室溫。將消解液轉移至100 mL 容量瓶中，用1% 稀HNO3洗滌消解罐2～3 次，將洗滌液也倒入容量瓶中，然后定容至100 mL，搖勻，待測。

1.4 Ag+的檢測

Ag+的檢測通過測定SG 與TAMRA 熒光強度比值（ISG/ITAMRA）的變化來實現。SG 與TAMRA 的熒光信號采用同步熒光分析法測定。TAMRA 的最大發射波長（584 nm）與最大激發波長（560 nm）之差（Stokes 位移）為24 nm［20］，SG 最大發射波長（525 nm）與最大激發波長（499 nm）之差為26 nm［21］，它們的Stokes 位移很接近，可通過同步熒光分析法同時獲得它們的熒光信號。為了使兩種熒光染料同時獲得較好的熒光信號，本實驗將同步掃描的波長間隔（Δλ）設置為25 nm，激發及發射狹縫的寬度均設置為10 nm。利用火焰原子吸收分光光度法測定Ag+時，先對樣品濃縮50 倍后再檢測。

1.5 方法的選擇性實驗

本實驗主要考察水樣中常見的金屬離子和水樣消解后有可能與Ag+發生反應的陰離子對測定結果的影響。具體步驟為，在一系列Ag+濃度為2.0×10-7mol/L 的溶液中分別加入濃度為2.0×10-5mol/L 的Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Hg2+、Mn2+、Cd2+、Cu2+、Ni2+、Fe3+、Cr3+、Al3+、SO42-及PO43-溶液，然后在相同的條件下與濃度為2.0×10-7mol/L的Ag+溶液（CK）進行對照實驗。

2 結果與討論

2.1 檢測方法的原理

利用熒光染料標記的核酸適配體及核酸染料SG 檢測Ag+的基本原理如圖1 所示。該方法中，在Ag+核酸適配體的3′端標記了熒光染料TAMRA，在沒有目標物Ag+存在時，TAMRA 標記的核酸適配體呈單鏈狀態，與SG 幾乎不發生作用，因此體系中SG 的熒光信號很弱。在有Ag+存在時，TAMRA標記的核酸適配體中的C 堿基（胞嘧啶）通過“CAg+-C”特異性結合形成雙螺旋結構（雙鏈DNA），SG 可進入雙鏈DNA 的雙螺旋小溝區域并與之結合，導致體系中SG 的熒光強度顯著增強。溶液中Ag+越多，與TAMRA 標記的核酸適配體反應后得到的雙鏈DNA 就越多，與雙鏈DNA 結合的SG 也就越多，作用后SG 的熒光也就越強。但熒光染料TAMRA 在適配體與Ag+反應前后熒光強度不會發生變化，即熒光染料TAMRA 的熒光強度與溶液中Ag+的濃度沒有關系。因此，可通過SG與TAMRA熒光強度比值（ISG/ITAMRA）的變化實現對Ag+的定量檢測。

圖1 基于比率型熒光探針對Ag+檢測的基本原理Fig.1 The basic principle of detection for silver ion based on ratiometric fluorescent probe

2.2 實驗條件的優化

2.2.1 SG 工作液用量

在反應溫度為35 ℃、反應時間為9 min 及緩沖溶液的pH 值為7.8 的條件下，考察了體系中Ag+濃度為2.4×10-7mol/L 時加入SG 工作液的用量對測定結果的影響。結果（圖2）表明，當SG 的用量小于70 μL 時，ISG/ITAMRA隨著SG 用量的增加而增大，當SG 工作液的體積達到70 μL 后，繼續增加SG 工作液的體積，ISG/ITAMRA幾乎不再發生變化。為保證SG 工作液相對過量，本實驗選擇加入的SG 工作液的體積為100 μL。

圖2 SG 用量對測定結果的影響Fig.2 Effect of SG volume on measurement results

2.2.2 緩沖溶液pH 值

本實驗中，緩沖溶液pH 值對測定結果的影響可能表現在3 個方面：一是影響Ag+與核酸適配體反應后形成雙鏈DNA 的穩定性；二是影響TAMRA及SG 的發光效果；三是影響Ag+在溶液中的存在形式，Ag+在堿性條件下能與OH-反應生成難溶的AgOH（AgOH 的溶度積KSP=2×10-8，本實驗中Ag+檢測最大濃度為240.0 nmol/L 時，pH＞12.92會生成沉淀）。因此，本實驗在反應溫度為35 ℃、反應時間為9 min 的條件下對緩沖溶液的pH 值進行了考察。結果（圖3）表明，當緩沖溶液的pH 值在6.6～7.8 之間時，ISG/ITAMRA隨pH 值的增加而增大；當pH 值大于7.8 時，ISG/ITAMRA隨pH 值的增大而逐漸減小。因此，本實驗選擇緩沖溶液的pH 值為7.8，此時，ISG/ITAMRA值最大，且在檢測范圍內不會生成沉淀。

圖3 pH 值對測定結果的影響Fig.3 Effect of pH value on the detection results

2.2.3 反應溫度

在反應時間為9 min、pH 7.8 的條件下對反應溫度的影響進行了考察。結果（圖4）表明，當反應溫度在20～35 ℃之間時，ISG/ITAMRA隨溫度的升高而增大；當溫度高于35 ℃時，ISG/ITAMRA隨溫度的升高而快速減小。這主要是因為在溫度較低時，升高溫度可以加快Ag+與核酸適配體的反應速率，但當溫度較高，超過了Ag+與核酸適配體反應后所形成雙鏈DNA 的解鏈溫度時，雙鏈DNA 不能穩定存在，導致ISG降低，ISG/ITAMRA值減小。因此本實驗選擇的反應溫度為35 ℃。

圖4 反應溫度對測定結果的影響Fig.4 Effect of reaction temperature on the detection results

2.2.4 反應時間

在反應溫度為35 ℃、pH 7.8 的條件下，對Ag+、TAMRA 標記的核酸適配體及SG 的反應時間進行了考察。結果（圖5）表明，當反應時間小于9 min時，ISG/ITAMRA隨反應時間的增加而增大；當反應時間大于9 min 后，ISG/ITAMRA隨反應時間的增加變化較小。因此，本實驗選擇的反應時間為9 min。

圖5 反應時間對測定結果的影響Fig.5 Effect of reaction time on the detection results

2.3 工作曲線、檢出限及精密度

在優化的實驗條件下，考察了ISG/ITAMRA與Ag+濃度之間的關系，圖6（a）為不同濃度Ag+體系所對應的同步掃描熒光光譜，圖6（b）為ISG/ITAMRA與Ag+濃度（c）的線性關系圖。圖6（b）結果表明，在4.0～240.0 nmol/L 范圍內，ISG/ITAMRA與Ag+濃度具有良好的線性關系，擬合的回歸方程為ISG/ITAMRA=0.006 0c+0.050 4（R2=0.998 1），方法的檢出限為2.0 nmol/L（3σ，n=9）。為了考察方法的精密度，對9 個相同濃度的Ag+（20 nmol/L）樣品分別用本文的比率法（以ISG/ITAMRA作熒光信號）和單色熒光法（以ISG作熒光信號）進行測定，計算了兩種方法的相對標準偏差（RSD），比率法的RSD 為1.7%，單色熒光法的RSD 為3.5%，比率法具有更好的精密度。

圖6 不同濃度Ag+所對應體系的同步掃描熒光光譜(a)以及ISG/ITAMRA與Ag+濃度的線性關系(b)Fig.6 Synchronous scanning fluorescence spectra of different concentrations of Ag+ for the detection system (a)and the linear relationship between ISG/ITAMRA and the concentration of Ag+ (b)a-j: 0, 2.0, 4.0, 8.0, 16.0, 30.0, 60.0, 120.0, 180.0, 240.0 nmol/L

2.4 方法的選擇性

在240.0 nmol/L 的Ag+溶液中分別加入100 倍濃度的其他金屬離子及陰離子SO42-、PO43-等干擾離子溶液，檢測體系ISG/ITAMRA的變化，考察方法的選擇性。結果（圖7）顯示，雖然上述干擾離子的濃度遠大于Ag+濃度，但各樣品所對應的體系ISG/ITAMRA均無明顯變化，表明該方法對Ag+具有很高的選擇性。

圖7 其他離子對Ag+檢測的影響Fig.7 Effect of other ions on Ag+ detection

2.5 實際樣品分析

為了驗證方法的準確性，用本方法及火焰原子吸收分光光度法（AAS 法，國標法）分別對實際水樣（自來水和天然礦泉水）中的Ag+進行了檢測，并進行加標回收實驗。 分別取4 份自來水（編號T1～T4）和天然礦泉水（編號S1～S4）樣品，加入不同濃度的AgNO3溶液，消解后分別采用本方法和AAS 法（檢測前對樣品濃縮50 倍）［22］對各樣品中Ag+的濃度進行檢測。結果（表1）表明，利用本方法測定的自來水和天然礦泉水中Ag+的含量分別為12.3 nmol/L 和21.2nmol/L，利用AAS 法測定的自來水和天然礦泉水中Ag+的含量分別為12.6 nmol/L和21.4 nmol/L，結果接近，且均低于飲用水中Ag+的國家限量標準（463.5 nmol/L）［23］；本方法的回收率在98.5%～101.8% 之間，AAS 法的回收率在98.0%～102.3% 之間，結果相差不大；本方法的RSD 均較小，說明本方法具有更好的重復性。

表1 本方法與AAS 法測定結果的比較(n=3)Table 1 Comparison of detection results between this method and AAS (n=3)

2.6 與已有檢測方法的比較

如表2 所示，與已報道的Ag+檢測方法［9～11，17，24］相比，本方法靈敏度更高，檢出限更低，適于Ag+的痕量檢測。

表2 本方法與已有的Ag+檢測方法的比較Table 2 Comparison of this method and other reported detection methods for Ag+nmol/L

3 結 語

本文利用熒光染料TAMRA 標記的核酸適配體及核酸染料SG 建立了一種高選擇性定量檢測水體中Ag+的方法。與已有的基于比率型熒光探針檢測Ag+的方法相比，該方法具有以下兩個特點：一是熒光探針合成較容易，檢測過程相對簡單；二是利用高靈敏的核酸染料SG 產生熒光信號，檢出限更低，靈敏度更高。該方法檢出限遠低于飲用水中Ag+的國家限量標準，且受環境因素干擾較小，對自來水和天然礦泉水測定結果的RSD 均在2%以下，加標回收率在98.5%～101.8%之間，可望用于實際飲用水的檢測。