阿魏酸對去卵巢大鼠骨微結構的影響

董曉敏 王朝南 林瑞芳 林雅靜

骨質疏松癥是因骨代謝平衡失調導致的以骨強度降低、骨折風險增加為特征的骨骼系統疾病，表現為骨量減少、骨微結構破壞，進而引起骨脆性增加，容易發生骨折[1]。骨質疏松癥相關性疾病的發病率、致殘率和病死率在老年患者中逐年增加，尤其是絕經后婦女罹患骨質疏松癥遠大于男性，主要與雌激素缺乏相關，通過積極治療延緩骨量減少速度，可顯著減低骨折發生，對已發生骨折的患者也可有效防止再次發生骨折。阿魏酸是一種酚酸類成分，是抗骨質疏松癥常用中藥當歸、川芎的有效成分之一。除抗氧化作用外，研究表明，阿魏酸還能通過調節凋亡基因，從而發揮抗成骨細胞凋亡的作用[2]。阿魏酸可刺激體外培養的成骨細胞增殖、分化和礦化，促進成骨相關基因的表達[3]。本研究通過觀察阿魏酸對去勢骨質疏松癥大鼠骨微結構和骨代謝的影響，探討其防治骨質疏松癥的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取2 月齡Wistar 雌性大鼠40只，體質量為（225±25）g，實驗動物由溫州醫科大學動物實驗中心提供。實驗中，所有大鼠自由進食和飲水，使用標準飼料，其中鈣含量為1%，磷含量0.8%，70%～80%碳水化合物和5%脂肪。飼養環境溫度25 ℃，相對濕度50%～70%，12 h 晝夜循環周期。本研究得到溫州醫科大學動物實驗中心倫理委員會批準（批號wydw2021-0580）。

1.2 試劑和儀器 阿魏酸（上海源葉生物科技有限公司，批號B20007）、堿性磷酸酶（ALP）（上海酶聯生物科技有限公司，批號ml003360）、骨鈣素酶聯免疫吸附測定（ELISA）檢測試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司，批號ml002883）。雙能X 線骨密度儀（美國Hologic 公司，型號：Discovery Wi）、Micro-CT（德國BRUKER 公司，型號：Skycan1276）、LEICA RM2235切片機（德國LEICA 公司，型號：RM2235）、生物顯微鏡（德國Zeiss 公司，型號：Axio Lab.A1）。

1.3 分組和模型制備 所有大鼠適應性喂養1 周后，40 只Wistar 雌性大鼠采用隨機數字表法分為假手術組、模型組、阿魏酸低劑量組和阿魏酸高劑量組，每組10 只。使用1%戊巴比妥（30 mg/kg）腹腔注射麻醉所有大鼠，在左右軟肋下剪開皮膚，分離筋膜，顯露腹腔，找到雙側卵巢及周圍組織，其中假手術組僅切除卵巢周圍脂肪組織（卵巢大?。?，模型組、阿魏酸低劑量組和阿魏酸高劑量組切除雙側卵巢組織建立骨質疏松模型。手術結束時所有大鼠均給予青霉素預防感染，過程順利，無大鼠死亡。術后所有大鼠連續3 d 肌注青霉素鈉預防感染（每天20 萬U）。術后1 周，待大鼠狀態恢復后，開始喂養干預。假手術組和模型組給予生理鹽水[50 mL/（kg·d）]灌胃，阿魏酸低劑量組和阿魏酸高劑量組分別給予等量阿魏酸[20、80 mg/（kg·d）]灌胃，藥物劑量參考文獻[4]，研究顯示該劑量可改善骨質高轉換狀態。每天上午灌胃1 次，連續12 周。

1.4 檢測指標 治療結束時用適量水合氯醛麻醉處死大鼠，經下腔靜脈采血，4 ℃離心分離制備血清，使用全自動生化儀測定血鈣、血磷濃度，按照ALP 及骨鈣素ELISA 試劑盒說明測定ALP 和骨鈣素（OC）水平。獲取各組大鼠雙側股骨，剔除肌肉等結締組織，對右側股骨采用骨密度儀及Micro-CT 測定骨密度和骨微結構參數，包括皮質骨骨小梁體積比率（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁數目（Tb.N）、骨小梁間隙（Tb.Sp）。各組大鼠左側股骨取10%甲醛固定液固定24 h，轉75%乙醇脫水過夜，常規石蠟包埋，制作病理學切片，片厚3 μm，HE 染色，生物顯微鏡下觀察股骨HE 染色情況及骨小梁形態。

1.5 統計學方法 應用SPSS 19.0 統計軟件分析數據。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，多組間樣本比較采用單因素方差分析（oneway ANOVA）分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗，以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 阿魏酸對大鼠血清骨代謝指標的影響 給藥12 周后，與模型組比較，阿魏酸低、高劑量組大鼠血清鈣、磷濃度和ALP 含量均無明顯差異（P＞0.05），阿魏酸低、高劑量組大鼠OC 含量有所下降，差異有統計學意義（P<0.05），見表1。

表1 各組大鼠骨代謝指標比較（）

表1 各組大鼠骨代謝指標比較（）

注：假手術組為僅切除卵巢周圍脂肪，未切除卵巢；模型組為手術切除雙側卵巢，等量生理鹽水灌胃；阿魏酸低劑量組為手術切除雙側卵巢，給予阿魏酸20 mg/（kg·d）灌胃；阿魏酸高劑量組為手術切除雙側卵巢，給予阿魏酸80 mg/（kg·d）灌胃；ALP 為堿性磷酸酶；OC 為骨鈣素；與假手術組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

2.2 阿魏酸對大鼠股骨骨小梁的影響 在股骨骨微結構測定上，與假手術組比較，模型組大鼠骨密度、BV/TV、Tb.Th 以及Tb.N 都有不程度下降，而Tb.Sp增大（P<0.05）；與模型組比較，阿魏酸低、高劑量組骨密度、BV/TV、Tb.Th 以及Tb.N 均有明顯回升，而Tb.Sp 變?。≒<0.05），見表2。

表2 各組大鼠股骨近端骨骨微結構指標比較（）

表2 各組大鼠股骨近端骨骨微結構指標比較（）

注：假手術組為僅切除卵巢周圍脂肪，未切除卵巢；模型組為手術切除雙側卵巢，等量生理鹽水灌胃；低劑量組為手術切除雙側卵巢，給予阿魏酸20 mg/（kg·d）灌胃；高劑量組為手術切除雙側卵巢，給予阿魏酸80 mg/（kg·d）灌胃；BMD 為骨密度；BV/TV 為骨小梁體積比率；Tb.Th 為骨小梁厚度；Tb.N 為骨小梁數目；Tb.Sp 為骨小梁間隙；與假手術組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

2.3 股骨組織切片觀察 股骨干骺端HE 染色如下圖顯示，與假手術組比較，模型組切除雙側卵巢后，大鼠股骨骨松質骨小梁排列變薄稀疏，髓腔增大；與模型組比較，阿魏酸組組織切片顯示骨皮質增厚且連續，骨小梁相對體積變大，數量增多，表明骨結構有所恢復。見圖1。

3 討論

絕經后女性由于雌激素的缺乏，造成骨吸收和骨成形的動態平衡失調，導致骨成形率低于骨吸收率，進而使得體內骨量減少和骨強度逐漸下降[5]。中藥治療骨質疏松，在有效改善骨量的同時，能明顯減少相關不良反應的發生[6]。研究表明，去勢大鼠模型的雌激素、骨骼變化和絕經后婦女改變相似[7]，故本研究通過去勢大鼠建立絕經后骨質疏松模型來研究阿魏酸抗骨質疏松的作用。

研究發現，氧化應激會抑制成骨細胞分化，增加破骨細胞的分化的吸收功能[8]，被認為是骨質疏松癥的發病機制中重要原因[9]。眾所周知，阿魏酸被認為具有抗炎抗氧化等多種生物作用[10]。在誘導缺氧誘導因子通路傳導時，阿魏酸同時會促進β-連環蛋白在間充質干細胞表達，此過程可促進間充質干細胞成骨，增加ALP 和OC 的含量[11]，同時促進成骨細胞表達骨保護素mRNA 和骨活素mRNA，誘導生成鈣化結節，進而促進成骨形成。有學者發現，阿魏酸40～640 μmol/L 濃度時可以促進骨細胞鈣化結節形成，在40～2560 μmol/L 濃度時會促進成骨細胞分化功能[3]。ALP 是成骨細胞分化早期特異性標志之一，而骨鈣素不僅是成骨細胞活性標志[12]，還能反映骨轉化狀態，即血清骨鈣素水平會隨著骨轉化增強而升高[13]。在實驗中，經過去卵巢處理，缺乏雌激素的模型組和阿魏酸組大鼠血清ALP 和OC 濃度都高于假手術組，同時由于阿魏酸低、高劑量組均能抑制骨轉化過程中血清OC 水平的升高，實驗中測定OC 含量均低于模型組（P＜0.05），這也反映阿魏酸具有增強成骨細胞活性、促進增殖分化的作用。此外，有學者發現雌激素受體亞型GPR30 對骨保護有重要作用[14]，阿魏酸等中藥的相關活性成分可通過特異性激活GPR3O 通路促進骨生長，還能避免傳統雌激素替代治療引起子宮內膜增厚等副作用[2]。目前已知破骨細胞是體內唯一具有骨吸收能力的細胞，在骨代謝中破骨細胞的數量和活性與骨質疏松癥的形成密切相關[15]。

研究表明，核因子κB（NF-κB）信號通路是介導骨吸收和骨成形之間平衡的重要通路[16]，其中NFκB 是成熟破骨細胞存活和發揮作用的關鍵調節因子[17]。阿魏酸通過下調核因子κB 受體活化因子配體（RANKL）誘導的NF-κB 活化水平，抑制RANKL 誘導的破骨細胞分化，從而減少破骨細胞的生成，并使破骨細胞的骨吸收活性下降[18]。研究表明，通過Micro-CT 觀察骨微結構能較靈敏反映骨質疏松癥的早期表現[19]。本實驗結果顯示，通過去勢干預，模型組大鼠股骨骨小梁排列稀疏變薄，髓腔變大，而阿魏酸組的大鼠骨皮質增厚且連續，皮質骨量增加，松質骨網結構致密，且骨量增加與阿魏酸劑量成正相關，大鼠BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th 較模型組顯著增加，Tb.Sp呈下降趨勢（P＜0.05），表明阿魏酸在合適濃度范圍內可以防止骨質流失，增加骨礦沉積，糾正雌激素缺乏的骨代謝失衡，改善去勢骨質疏松癥的骨微結構，這對預防骨質疏松有重要作用。

總之，本研究結果表明，阿魏酸對去勢大鼠骨微結構有一定改善作用，可促進骨形成，增加骨量，可能是治療骨質疏松的潛在選擇。