臍帶血清促進牙髓干細胞增殖作用研究

譚金娣 姜建平 何佳英

骨組織工程技術就是將機體分離的擴干細胞（種子細胞）在體外進行培養、擴增，然后與細胞支架材料結合后再植入機體骨缺損部位，從而再生出新骨來修復骨組織缺損，其研究內容主要涉及以下三方面：（1）種子細胞來源；（2）生物載體支架選擇；（3）微環境構建[1]。目前已證實的成體多能干細胞由非牙源性干細胞、牙源性干細胞兩大類構成，其中牙源性干細胞由于具有很強的自我更新和分化能力，在實驗研究和臨床上被廣泛使用[2]。研究顯示，對牙源性干細胞施以體外特定誘導，其可向多種功能細胞分化[3-4]。而在體外研究中，細胞的體外培養、擴增、分化和凍存等一般都需使用含胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）或小牛血清制品，外源性物質的加入，使得細胞在骨組織工程及臨床應用中存在人畜共患疾病傳播和免疫排斥的風險[5-6]。本研究旨在觀察人臍帶血清（umbilical cord blood serum，CBS）促進人牙髓干細胞（dental plup stem cell，DPSC）增殖作用，報道如下。

1 實驗材料

1.1 材 料 實驗所取離體牙為杭州市中醫院口腔科19～29 歲健康成年人正常拔除的完整且無齲壞的第三磨牙；拔除后的牙放到培養瓶（內含5 倍雙抗培養液）里，4 ℃溫度下，密封存儲。實驗所需CBS 為杭州市中醫院手術室內無菌條件下，抽取健康胎兒離體臍帶中臍帶血（未抗凝），并注入無菌玻璃瓶，放到培養箱（37 ℃）內靜置備用。FBS 購于上海吉泰生物；本研究符合《赫爾辛基宣言》涉及人類受試者醫學研究倫理原則。

1.2 試劑及儀器 胰酶（中國碧云天生物技術研究所），DMEM F/12 培養基（美國Hyclone 公司），培養板、培養皿（美國Corning 公司），塑料細胞培養瓶（美國Costar 公司），超凈工作臺（中國蘇州凈化設備廠），倒置相差顯微鏡（日本Olympus 公司），培養箱（美國Sheldon 公司），離心機（德國Hettich 公司）。

2 實驗方法

2.1 分離培養人DPSC（1）有效清潔超凈工作臺，同時借助紫外燈實施0.5 h 殺菌處理。（2）打開超凈工作臺，打開上部通風開關用于將實驗過程中產生的污染氣體抽離。將離體牙于臨時培養基（DMEM F/12 培養基）中取出，用酒精棉球擦拭牙體表明的血漬，去除牙體表面殘存的牙周膜等軟組織，將離體牙置于培養皿A 中。（3）通過無菌PBS 對培養皿A 內牙體組織進行沖洗，2 mL/次,共3 次。（4）將適量Ⅰ型膠原酶滴入另一個無菌的培養皿B 中（一般1 顆磨牙需1 mL Ⅰ型膠原酶）。（5）用滅菌的手排鉆將離體牙縱向劈開（注意鉆頭不要碰到牙髓組織），暴露牙髓組織，用無菌眼科剪將根尖部牙髓組織剪掉并將剩余牙髓組織用無菌鑷子置于培養皿B 中。（6）用眼科剪將牙髓組織剪碎（1 mm3/塊）。（7）用一次性吸管將牙髓與Ⅰ型膠原酶混合液移入無菌離心管中，吹打混勻后密封。（8）將離心管放置于37 ℃水浴搖床中消化1 h。（9）取回消化的離心管，于超凈工作臺上用一次性吸管吸棄上清液，放入3～5 mL 的DMEM F/12 培養基，先經吹打使之充分混合，再管口密封，移至離心機內，設置為1000 r，作用5 min。（10）取回離心管，于超凈工作臺上用一次性吸管吸棄上清液，添加3～5 mL 內含20% FBS 的DMEM F/12 培養液，待吹打混勻，封管口，移至離心機內，1000 r 下計時5 min。（11）取回離心管，于超凈工作臺上用一次性吸管吸棄上清液，加入含有20% FBS 的DMEM F/12培養液5 mL，吹打混合后將組織懸浮液移入無菌培養瓶中。（12）將存有組織懸浮液的培養瓶置于培養箱中培養（37 ℃，5% CO2），觀察細胞貼壁后每隔3 d換液1 次。（13）借助倒置相差顯微鏡查看細胞形態與數目，待培養瓶內細胞覆蓋率達80%，用胰酶消化傳代。

2.2 傳代培養人DPSC（1）有效清潔超凈工作臺，同時借助紫外燈實施0.5 h 滅菌處理。（2）借助倒置相差顯微鏡查看細胞形態與數目，再移至超凈工作臺上，將其中培養基清除掉，用PBS 實施3 遍清洗。（3）向培養瓶里放入1～2 mL 胰酶，接著將此瓶移至培養箱里，停留0.5 min。（4）從培養箱內把培養瓶取出，借助倒置相差顯微鏡查看細胞形態，待其顯示圓形，馬上結束消化。（5）于超凈工作臺上，將胰酶清除掉，再放10 mL 含15% FBS 的DMEM F/12 培養液，接著借助吸管吹打貼壁細胞，使其脫落。（6）分別取兩個新的無菌培養瓶，用吸管分別吸取5 mL 細胞懸液置于新的培養瓶中，再分別加入5mL 培養液。（7）再次置于培養箱里培養（5% CO2、37 ℃）。

2.3 人臍帶血清（hCBS）制備 手術室內無菌條件下，抽取健康胎兒離體臍帶中臍帶血（未抗凝），并注入無菌玻璃瓶內，放到培養箱（37 ℃）內靜置，計時120 min，待血凝塊充分析出后，無菌環境中于超凈工作臺將血清移至離心管內，1000 g、4 ℃下，離心20 min，棄沉淀，僅留上清，-20 ℃保存。取部分血清做細菌、真菌、衣原體、支原體、乙型肝炎和丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒及梅毒、EB 病毒、巨細胞病毒等各項病原微生物測定，將各項測定結果皆顯示陰性的人CBS 用做培養。使用前56 ℃水浴滅活30 min，存放于4 ℃下備用。

2.4 不同培養條件下的人DPSC 增殖能力（1）種板、接種細胞：取呈良好狀態的第3 代DPSC，先在37 ℃溫度下用胰蛋白酶（0.5%）消化，再借助倒置相差顯微鏡查看細胞形態，待其顯示圓形，通過DMEM F/12 培養液（內含10%FBS）馬上結束消化，彎頭吹打，即得單細胞懸液。取細胞的第3 代以4×103個/孔接種在96 孔培養板中，實驗分為四組，其中10%FBS培養DPSC 作為對照組，設置其余三組實驗組。首先在四組中分別加入200 μL 的DPSC 單細胞懸液，待細胞貼壁生長后，對照組繼續加10%FBS 培養，其他三組分別加入5%、10%、20% hCBS 繼續培養。每板各濃度種6 孔，每孔體積200 μL。FBS 加入細胞的懸液外一圈，以確保濕度。置于5% CO2中過夜。（2）于37 ℃、飽和濕度、5% CO2時培養，測定的時間節點為1、3、5、7 與9 d，添加0.02 mL 的MTT 試劑，于37 ℃中進行4 h 孵育，將孔里培養基、MTT 試劑吸除干凈，再每孔加入15 μL DMSO，作用10 min 后，將培養板放入脫色搖床振蕩5～10 min，借助自動酶標儀檢測各孔OD490 nm 值。（3）繪制細胞生長曲線，進行統計分析。

2.4 人DPSC 多向分化能力（1）取MTT 法得出增殖速度最快的一組第三代的DPSC 細胞。（2）成脂肪細胞誘導的培養液為50 μmol/L indomethacin 0.5 μmol/L isobutylmethylxanthine 和0.5 μmol/L dexamethasone，培養2 周。（3）用于誘導成軟骨細胞的培養液是6 μg/mL Insulin，10 ng/mL TGF-β1，95 μmol/mL dexamethasone，37 mg/mL vitamin-C-phosphate，0.8 μM sodium Pyruvate，6 μg/mL 轉鐵蛋白，進行3 W 培養。（4）用以誘導OB 的培養液是5 mM β-glycerophosphate，50 mg/mL vitamin-C-phosphate 和2 mM Lglutamine，培養3 周。（5）Oil Red O 染色測定向脂肪細胞的誘導狀況；甲苯胺藍染色測定向成軟骨細胞的誘導狀況；Alizarin Red S 測定向OB 的誘導狀。

2.5 流式細胞儀測定細胞表面標志物（1）取呈良好狀態的第3 代DPSC，用PBS 行3 遍洗滌，通過胰酶消化為單細胞，再移入離心管（15 mL）內，待細胞顯示圓形，用含10% CBS DMEM-F12 培養液立即終止消化，彎頭吹打，配成單細胞懸液。（2）于1500 r/min 行15 min 離心，留存沉淀，PBS 洗滌3 次，分別取1×105個細胞懸液100 μL 加入6 支離心管中，其中1 支為對照組，其余分別加入抗體CD90、CD75、CD45、MSCA-1 和CD34，5 μL，輕晃，避光下放入4℃里1 h。（3）待取出，將2 mL 的PBS 直接加入，于1500 r/min 下離心，計時5 min，將未結合抗體清除掉，借助FCM 測定抗體表達量。

2.6 統計學方法 應用SPSS 19.0 統計軟件，實驗所得數據計量資料采用Shapiro-Wilk 法進行正態性檢驗，得出細胞計數服從正態分布（P 均＞0.05），故采用均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），就各時間節點兩組組間差異采用LSD 法進行比較，以P＜0.05 認為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 細胞培養結果 原代培養DPSC，待至第4 天發現細胞貼壁生長，到第7 天時，產生克隆細胞團，同時顯示出典型性成纖維細胞（FIB）樣形態。培養至第14 天，克隆細胞統一性更明顯，可觀察到平行分布的成纖維形態與長細胞突，待數目達到，開始傳代。傳代后，顯示細胞快速增殖。見圖1。

3.2 10% FBS 與不同濃度hCBS 促進DPSC 增殖能力比較 在橫、縱軸參數為“時間”“OD 值”下，完成生長曲線的繪制。由此曲線可知，在培養時間增加下，DPSC 數量提高，同時于第3 天顯示快速生長。四組DPSC 在第1～9 天內均呈現不同程度的生長狀態，且呈線性增長，10% hCBS 組促進DPSC 增殖明顯。見表1，圖2。

表1 10% FBS 與不同濃度hCBS 促進DPSC 增殖能力比較（，n=24）

表1 10% FBS 與不同濃度hCBS 促進DPSC 增殖能力比較（，n=24）

注：FBS 為胎牛血清；hCBS 為人臍帶血清；與10%FBS 組同期比較，aP＜0.05

3.3 體外鑒定DPSC 多向分化能力 圖3A 所示，DPSC 的成骨誘導3 W 后的礦化結節產生情況，可發現成功礦化。圖3B 所示，經過2 W 的細胞成脂肪誘導培養，Oil Red O 染色得到中央為空泡的Fatcell。圖3C 所示，經過3 W 細胞成軟骨誘導培養的結果，甲苯胺藍染色顯示藍色結節。

3.4 流式細胞儀鑒定 流式細胞技術檢測顯示，其中間充質干細胞CD90 抗體的陽性表達率74%，CD75 抗體的陽性表達率65%，MSCA-1 抗體陽性表達率0.5%。CD34、CD45 造血干細胞抗體陽性表達率＜5%。見圖4。

4 討論

在細胞培養方面，FBS 的應用率最高，其可滿足細胞諸多生物學行為的激素、生長因子與營養等生物活性物質所需。但其因可能存在安全、科學與倫理方面的問題，在臨床應用中受限。主要采用動物血清的干細胞培養體系現今已極大阻礙到干細胞技術向臨床轉化，相關細胞療法進行的基礎為，一種無異種血清的人間充質干細胞（MSC）培養體系的構建[7]。由于hCBS 富含生長因子被推薦用來取代FBS。國內外均有研究，CBS 或血漿內富含細胞存活與生長必需的細胞因子，對骨髓或其他來源的人MSC 體外生長與增殖具促進作用[8-10]。結果發現，不同濃度的CBS促進DPSC 增殖的作用不盡相同，前期預實驗研究證實CBS 對DPSC 增殖的促進作用具有濃度依賴性，體積分數1%～10%的CBS 明顯提高DPSC 的增殖活性，其中10%CBS 組促進增殖能力最強。本研究通過用5、10 與20%濃度CBS 與10%FBS 培養牙髓干細胞對比可以得出，在1、3、5、7、9 d 的細胞周期中，DPSC 數量均有增加，并在第3 天呈快速生長，在整個細胞培養周期，體積分數5%、20%CBS 對DPSC的促增殖作用基本相同（P＞0.05）。至中后期，在促進DPSC 增殖方面，高濃度CBS 組則有所下降，可見一定濃度區間內，DPSC 增殖活性和CBS 存在濃度依賴性表現，高濃度CBS 對DPSC 增殖具有抑制性。這可能和前者所含血清成分相關，血清所含的一些成分對血小板生長因子（PDGF）可能具抵抗效能。其中10%CBS 組與10%FBS 組比較，從培養第5 天起，CBS 比FBS 更能促進DPSC 增殖（P＜0.05），而且經CBS 培養后的DPSC 在適宜條件的誘導下，DPSC 可較容易地完成向成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞的轉化，體現出多向分化活性。

目前通常采用三類特征鑒定間充質干細胞：（1）體外培養貼壁生長，顯示梭狀。（2）條件適宜時可誘導得到成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等。（3）免疫表型 ：CD31、CD105、CD45、CD73、CD34、CD106、CD14與CD29 等[11-12]。同上述3 項相符的細胞即可認為所培養的細胞為間充質干細胞。本實驗中CBS 體外培養體系獲得的DPSC 具有間充質干細胞的一般生物學特性，細胞為典型的成纖維細胞樣，呈漩渦狀貼壁生長；體外擴增至四代，細胞形態不發生明顯改變。將CBS 培養后的第三代DPSC 誘導培養，呈現出了不同分化能力，證明CBS 培養前后的DPSC 生物學特性并未改變。另外，實驗采用陽性標記與陰性標記組合方式，對DPSC 展開鑒別，選擇CD73、CD90、CD45 與CD34 和這4 類細胞表面抗原標志物，前兩者可高表達，后兩者則不表達。同時，有報道使用MSCA-1 作為選擇分離間充質干細胞的有效標志物[12]。Tomlinson J 等[13]認為，MSCA-1 也是一種潛在的特異性標記牙髓干細胞的物質，并用MSCA-1 檢測DPSC，得出MSCA-1 表達率1.2%。本研究中取培養的第三代DPSC，MSCA-1 表達率為0.5%。仍有待確定MSCA-1 是否為DPSC 特異性標志物。

綜上所述，雖然FBS 是最常用于體外細胞擴增的血清，但它的動物來源限制了它的使用，尤其用于臨床中時有較大爭議。本研究結果表明，（1）CBS 可促進DPSC 增殖；（2）CBS 與FBS 培養相比較，10%CBS 在促進DPSC 增殖方面優于10% FBS；（3）CBS培養所得DPSC 存在多向分化活性；（4）借助FCM 檢測CBS 培養所得DPSC 與干細胞表面標記特性相符?？傊?，CBS 可替代FBS 用于體外DPSC 擴增。因為臍血易于獲取，操作簡便，能夠取代動物血清用于人間充質干細胞的分離培養，同時維持此細胞的生物學特性，與構建臨床級人間充質干細胞擴增的條件相符，所以，現階段依然是一類比較理想的非動物來源的血清補充物。