miR-103 通過NF-κB 通路上調MGMT 表達誘導胃癌細胞紫杉醇耐藥

高曉丹 王麗潔 王書夢 蘇 潔

胃癌（gastric carcinoma）是常見的消化系統腫瘤。紫杉醇（paclitaxel，PTX）作為天然抗癌藥物，在胃癌化療中療效確切[1]。但獲得性耐藥的出現往往導致PTX 治療失敗。微小RNA-103（miRNA-103，miR-103）是一種可參與肝癌、肺癌、膠質瘤等惡性生物學行為的miRNA[2-4]。研究顯示，miR-103 參與惡性腫瘤化療耐藥[5]。但miR-103 與胃癌PTX 耐藥的關系還不明確。核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）通路已被發現在多種惡性腫瘤化療耐藥中發揮作用[6-7]。最新研究顯示，miR-103 能夠靶向TLR4 而抑制NFκB 磷酸化水平[8]，提示miR-103 在NF-κB 信號通路中可能發揮抑制作用。O6-甲基鳥嘌呤-DNA-甲基轉移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）是NF-κB 參與惡性腫瘤細胞耐藥的重要下游信號分子[9]。但目前miR-103 是否通過NF-κB/MGMT 介導胃癌PTX 耐藥還不清楚。本研究通過構建PTX 耐藥胃癌細胞，觀察miR-103 對胃癌PTX 耐藥的影響，并探討NF-κB/MGMT 在其中的作用，現報道如下。

1 實驗材料

1.1 細 胞 人胃癌NCI-N87 細胞購自中國科學院典藏培養物保藏委員會細胞庫/中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.2 主要試劑 PTX（批號20211212）購自南京本草益康生物科技有限公司；miR-103 抑制物（miR-103 inhibitor）轉染試劑盒購自上海吉瑪公司；四甲基偶氮唑鹽比色[3-（4，5-Dimethylthia-zol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]和結晶紫染液購自上海碧云天公司；逆轉錄聚合酶鏈式反應試劑盒（含引物）（批號0000173942）和實時熒光定量PCR（RTqPCR）試劑盒（批號0000170712）購自美國Promega公司；miR-103 和U6 合成引物購自上海生工生物；RIPA 總蛋白提取試劑盒購自北京索萊寶公司；胎牛血清（FBS，批號2132094P）、DMEM 高糖培養基（批號8120033）、磷酸鹽緩沖液（PBS，批號AE29449009）購自美國Gibco 公司；NF-κB p65（1∶1000）（批號06）、p-NF-κB p65（1∶1000）（批號12）、IκBα（1∶1000）（批號23）抗體及熒光二抗（1∶500）（批號02）抗體購自美國CST 公司；MGMT（1∶1000）（批號GR3301548-3）抗體購自美國Abcam 公司；GAPDH（1∶1000）（批號15）抗體購自南京Bio-World 公司；抗鼠和抗兔IgG、HRP-linked 二抗（批號G1421、G1526）購自美國Santa Cruz 公司。

2 實驗方法

2.1 N87/PTX 構建和細胞培養 采用逐漸增加PTX濃度，間歇誘導的方法構建N87/PTX 細胞。N87 和N87/PTX 細胞以DMEM 全培養基（含10%FBS 和1%青-鏈霉素）進行培養。培養環境為37 ℃，含5%CO2的無菌環境。

2.2 轉染miR-103 inhibitor 抑制內源性miR-103將N87/PTX 細胞接種于6 孔板，培養過夜。次日，將10 μL miR-103 抑制物（inhibitor）和陰性對照（NC）分別用 DMEM 高糖培養基稀釋 50 倍。將Lipofectamine 2000 稀釋300 倍。分別吸取miR-103 inhibitor 0.5 mL 和Lipofectamine 2000 稀釋液1.5 mL 混合并靜置20 min。將細胞培養基更換為上述混合液，置于培養箱培養24 h。將轉染miR-103 inhibitor 和NC 的N87/PTX 細胞分別設為miR-103 inhibitor 組和NC 組，同時以未轉染的N87/PTX 細胞作為空白對照組（Control）。

2.3 MTT 法檢測細胞活力 N87 或N87/PTX 細胞以每孔9×103個接種于96 孔板，以PTX（0、0.01、0.1、1、10、100、1000 μmol/L）處理48 h，每個濃度設置5個重復孔。48 h 時每孔直接加入20 μL MTT 溶液（5 mg/mL）處理4 h，而后每孔加入二甲基亞砜100 μL，用酶標儀（490 nm）檢測吸光度并計算細胞活力，根據細胞活力計算各細胞IC50。實驗重復3 次。耐藥指數=N87/PTX 細胞IC50 均值/N87 細胞IC50 均值。

2.4 RT-qPCR 檢測miR-103 表達水平 取對數期所需細胞接種于96 孔板，當細胞生長至80%匯合度時以TRIZOL 法提取細胞總RNA。按說明書以逆轉錄聚合酶鏈式反應試劑盒進行逆轉錄反應得到cDNA。稀釋cDNA 和引物。以U6 為內參，用RT-試劑盒在ABI 7500 型RT-qPCR 系統中進行檢測。實驗重復3 次，以2-△△Ct法計算miR-103 的表達水平。miR-103 上游引物：5′-AGCAGCATTGTACAGGGCTATCA-3′，下游引物：5′-GCCGTCGGTGATGCTTTTTTGG-3′。U6 上游引物，5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

2.5 結晶紫染色 取對數期細胞接種于6 孔板中，細胞生長至60%匯合度時按需求加入PTX（3 μmol/L）處理48 h。PBS 洗滌，加入4%多聚甲醛固定10min。PBS 洗滌，每孔加入2 mL 結晶紫染液染色10 min。清水洗滌，于倒置顯微鏡下觀察拍照，隨機記錄3 個視野細胞數目，計算細胞貼壁存活率。

2.6 miR-103 的靶基因預測 以miRcode 網站（http://www.mircode.org/）分析miR-103 與IKBα 的編碼基因NFKBIA 結合的可能性。同時在RNA22 v2 microRNA target detection 網站（https://cm.jefferson.edu/rna22/Interactive）預測二者結合的潛在位點。

2.7 蛋白印跡法檢測p-NF-κB p65、MGMT 及IKBα 蛋白表達 提前配制含蛋白抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA 細胞裂解液，置于冰上備用。將所需檢測細胞以PBS 洗兩遍，第二遍保留PBS，用蛋白刮刀刮下細胞并轉移至1.5 mL EP 管中，4 ℃、800 g 離心5 min，棄去上清液并用吸水紙吸干水分，各加入100 μL 裂解液于冰上裂解15 min，4 ℃、8500 g 離心20 min，上清液即為提取總蛋白，總蛋白經BCA 蛋白定量試劑盒定量后制備成蛋白樣品。以每孔道30 μg/10 μL 蛋白樣品進行電泳，隨后將蛋白轉印至PVDF 膜上。PVDF 膜以5%脫脂奶粉封閉過夜。次日加入NF-κB p65、p-NF-κB p65、IKBα、MGMT 及GAPDH 抗體避光孵育4 h。TBST 洗膜后，加入抗鼠和抗兔IgG，HRP-linked 二抗室溫避光孵育1 h，PVDF 膜以TBST 清洗后用ECL 化學發光試劑盒進行顯色，凝膠成像儀進行曝光。

2.8 免疫熒光法檢測NF-κB p65 細胞分布 將細胞鋪在蓋玻片上，24 h 后于冰上用預冷的甲醇固定20 min。然后用0.1% Triton X-100 對細胞進行通透處理，室溫條件下用3% BSA 封閉30 min。將細胞與NF-κB p65 抗體（1∶500）室溫孵育2 h。PBST 洗滌后，細胞與熒光二抗（1∶1000）孵育2 h。在室溫下用0.5 μg/mL 的DAPI 孵育10 min。于倒置熒光顯微鏡下觀察拍照。

2.9 統計學方法 應用Graphpad prism 7.0 統計軟件對實驗結果進行分析處理。數據用Shapiro-Wilk進行正態性檢驗，均為正態分布，以均數±標準差（）表示，組內兩樣本均數比較用t 檢驗，多樣本均數比較采用單因素方差分析，兩兩多重比較采用LSD-t 檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 miR-103 在N87/PTX 表達上調 MTT 結果顯示，PTX 對N87 和N87/PTX細胞的IC50分別為（1.5±0.2）和（40.6±4.5）μmol/L，經計算N87/PTX 耐藥指數為27.1。RT-qPCR結果顯示，N87細胞和N87/PTX 細胞miR-103 表達水平分別為（0.9±0.1）和（10.7±0.9），與N87 細胞比較，N87/PTX 細胞miR-103 表達水平顯著升高（P＜0.01）。

3.2 抑制miR-103 影響PTX 對N87/PTX 細胞的細胞毒作用 MTT 結果顯示，PTX 對Control、NC 及miR-103 inhibitor 組N87/PTX 細胞的IC50 分別為（43.5±4.8）、（41.7±4.5）及（3.3±0.3）μmol/L。與NC 組比較，miR-103 inhibitor 組IC50 顯著降低（P＜0.01）。

3.3 抑制miR-103 影響N87/PTX 細胞對PTX 的敏感性 結晶紫染色結果顯示，PTX（3 μmol/L）對Control 組N87/PTX 細胞存活能力有一定影響。Control+PTX 和NC+PTX 組細胞存活率無明顯差異。與NC+PTX 組比較，miR-103 inhibitor+PTX 組N87/PTX 細胞存活率顯著降低（P＜0.01），見圖1 和表1。

表1 PTX 處理后各組N87/PTX 細胞存活率比較（%，）

表1 PTX 處理后各組N87/PTX 細胞存活率比較（%，）

注：Control 為空白對照；NC 為陰性對照；miR-103 inhibitor 為miR-103 抑制物；PTX 為紫杉醇；Solvent 為溶媒；與Control+Solvent 比較，aP＜0.01；與NC+PTX 比較，bP＜0.01

3.4 NFKBIA 基因（IKBα 蛋白的編碼基因）可能是miR-103 的靶基因 RNA22 v2 和miRcode 軟件分析結果顯示，IKBα 的編碼基因NFKBIA 與miR-103存在互補結合位點，可能是后者的靶基因，二者結合位點序列見表2。

表2 miR-103 與NFKBIA 基因的結合序列

3.5 p-NF-κB p65、IKBα 及MGMT 蛋白在N87/PTX 細胞的表達 蛋白印記結果顯示，相較于N87細胞，N87/PTX 細胞IKBα 蛋白表達明顯下調，p-NF-κB p65 和MGMT 蛋白表達顯著上調（P＜0.01），見圖2 和表3。

表3 N87/PTX 細胞p-NF-κB p65、IKBα 及MGMT相對蛋白表達量比較（%，）

表3 N87/PTX 細胞p-NF-κB p65、IKBα 及MGMT相對蛋白表達量比較（%，）

注：N87 為正常培養的N87 細胞；N87/PTX 為PTX 耐藥N87 細胞；N87 為正常培養的N87 細胞；N87/PTX 為PTX 耐藥N87 細胞；IKBα為核因子κB 抑制蛋白α；MGMT 為O6-甲基鳥嘌呤-DNA-甲基轉移酶；與N87 比較，aP＜0.01

3.6 miR-103 對p-NF-κB p65、IKBα 和MGMT 蛋白表達的影響 蛋白印記結果顯示，NC 和Control組N87/PTX 細胞p-NF-κB p65、IKBα 及MGMT 蛋白表達無明顯差異。與NC 組比較，miR-103 inhibitor 組N87/PTX 細胞p-NF-κBp65 和MGMT 蛋白表達顯著下調，IKBα 蛋白表達明顯上調（P＜0.01），見圖3 和表4。

表4 各組細胞p-NF-κB p65、IKBα 及MGMT相對蛋白表達量比較（%，）

表4 各組細胞p-NF-κB p65、IKBα 及MGMT相對蛋白表達量比較（%，）

注：Control 為空白對照；NC 為陰性對照；miR-103 inhibitor 為miR-103 抑制物；p-NF-κB p65 為磷酸化型NF-κB p65；IKBα 為核因子κB 抑制蛋白α；MGMT 為O6-甲基鳥嘌呤-DNA-甲基轉移酶；與NC組比較，aP＜0.01

3.7 miR-103 對NF-κB p65 核質分布的影響 免疫熒光結果顯示，Control 和NC 組N87/PTX 細胞NF-κB p65 分布于細胞核和細胞質中。相較于NC組，miR-103 inhibitor 組N87/PTX 細胞NF-κB p65主要表達于細胞質，而在細胞核內表達明顯減少，見圖4。

4 討論

miR-103 作為miRNA 家族成員，已顯示與惡性腫瘤化療耐藥有關。一項關于肺癌的研究發現，miR-103 可靶向PTEN 激活PI3K/AKT 信號通路，從而促進肺癌細胞A549 對達沙替尼耐藥[5]。研究顯示，miR-103 能通過調節COP1 誘導人白血病細胞對阿霉素耐藥[10]。本研究成功構建PTX 耐藥胃癌細胞N87/PTX，并發現miR-103 在N87/PTX 細胞中表達升高。進一步研究發現，miR-103 inhibitor 處理即可降低PTX 對N87/PTX 細胞的IC50，還可抑制N87/PTX 細胞的貼壁存活能力。提示miR-103 可能與N87/PTX細胞PTX 耐藥相關。通過生物學信息學分析發現，IKBα 蛋白的編碼基因NFKBIA 與miR-103 存在互補結合位點，NFKBIA 可能是miR-103 的靶基因。提示miR-103 對胃癌細胞PTX 耐藥的影響可能與IKBα 相關。在經典的NF-κB 通路中，IKB 能結合NF-κB 而抑制后者活性，而其自身降解可活化NFκB。在過去的研究中，NF-κB 已被證明在卵巢癌[7]、乳腺癌[12]及黑色素瘤[13]等惡性腫瘤化療藥物耐藥中發揮作用。在本研究中，N87/PTX 細胞IKBα 蛋白表達下調，p-NF-κB p65 蛋白表達上調。提示miR-103可能通過靶向抑制IKBα 蛋白表達，從而磷酸化激活NF-κB p65 蛋白。

為了進一步進行驗證，本研究采用miR-103 抑制物miR-103 inhibitor 抑制N87/PTX 細胞內源性miR-103 活性表達。結果發現，miR-103 inhibitor 可誘導N87/PTX 細胞IKBα 蛋白表達上調，p-NF-κB p65 蛋白表達下調。免疫熒光實驗發現，miR-103 inhibitor 處理后N87/PTX 細胞核NF-κB p65 表達明顯減少。通常情況下，NF-κB 磷酸化激活后通過轉位至細胞核內與其相關的DNA 基序結合，從而誘導靶基因的轉錄[7-8，13]。這些提示，在本研究中，miR-103 可能通過靶向抑制IKBα 蛋白表達，從而磷酸化激活NF-κB p65 蛋白，后者進入細胞核參與轉錄調控。

MGMT 是NF-κB 參與惡性腫瘤細胞耐藥的重要下游信號分子，能與DNA 鳥嘌呤6 位氧上的烷基化合物結合，將烷基轉移到MGMT 的第145 號半胱胺酸活性位點上，使DNA 上烷基化的鳥嘌呤被還原，最終避免子鏈DNA 缺口出現，導致細胞耐藥[9，14]。本研究中N87/PTX 細胞MGMT 蛋白表達上調，提示N87/PTX 細胞耐PTX 效應可能與NF-κB 通路介導MGMT 蛋白表達上調有關。進一步實驗發現，miR-103 inhibitor 還可誘導N87/PTX 細胞MGMT 蛋白表達下調，提示miR-103 可能通過NF-κB 通路介導MGMT 蛋白表達上調。

綜上所述，miR-103 可能通過靶向抑制IKBα 蛋白表達而促進NF-κB p65 磷酸化進入細胞核，而后者通過調節MGMT 的轉錄表達，最終介導胃癌細胞PTX 耐藥。