豬流行性腹瀉病毒串聯表位亞單位疫苗的免疫原性

楊燦燦， 吳詩璟， 張 峒， 張元興， 劉 琴,

（1. 華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237；2. 上海海洋動物疫苗工程技術研究中心，上海 200237）

豬流行性腹瀉病毒 (Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV) 能感染各個年齡的豬，使得感染豬嘔吐、腹瀉、脫水、厭食等，引發哺乳仔豬高達近100%的死亡率，給世界各國的養豬產業帶來嚴重的經濟損失。20 世紀八九十年代，中國已有豬流行性腹瀉(Porcine Epidemic Diarrhea, PED) 疫情的發生[1]。PED的零星出現，呈現出地方性流行的特點。2010 年以來，中國暴發了大規模的PED 疫情，給中國的養豬產業造成巨大的損失，因此亟需有效疫苗防控PED 的暴發[2]。

PEDV 屬于α-冠狀病毒屬，形狀像日冕，呈多形性，平均直徑約110 nm，在電子顯微鏡下可以看到病毒顆粒邊緣有棒狀突起，突起長約20 nm[3]。PEDV是單股正鏈RNA 包膜病毒，基因組大小約28 kb，至少有7 個開放閱讀框 (Open Reading Frame, ORF)。ORF分別編碼非結構蛋白復制酶聚蛋白1a 和1b、輔助蛋白ORF3 以及結構蛋白纖突 (Spike, S) 蛋白、包膜(Envelope, E) 蛋白、膜 (Membrane, M) 蛋白和核衣殼(Nucleocapsid, N) 蛋白[4-7]。各個結構蛋白以及基因組相互作用構成PEDV 顆粒。PEDV 的抗原表位區域主要集中在S 蛋白上，S 蛋白包括S1 (1～789 aa)和S2 (790～1 383 aa) 兩部分，其中COE (499～638 aa)、S1D (636～789 aa) 和C 末端 (1 371～1 377 aa) 是抗原中和表位區域[8-13]。此外，M 蛋白的M3 區域 (160～226 aa)也具有一定抗原活性[14]。這些抗原區域均可以作為開發亞單位疫苗的靶點。

自PED 暴發以來，中國、韓國、日本和美國等相繼開發不同技術路線的疫苗以抵抗PEDV 的感染。目前PEDV 的疫苗研究主要集中在傳統滅活疫苗、減毒疫苗以及新型核酸疫苗、亞單位疫苗和病毒樣顆粒 (Virus-Like Particles, VLPs) 疫苗。亞單位疫苗憑借著抗原成分明確、不包含可能引起機體不良反應的冗余抗原部位、沒有復制感染能力、適用于免疫力低下的群體等優勢，受到疫苗研究者的廣泛關注，是疫苗開發的一個重要方向。以S1 蛋白或S1蛋白的COE 區域為抗原，已經設計了多種亞單位疫苗，但至今沒有上市的PEDV 亞單位疫苗[15-16]。這可能是因為COE 蛋白表位過于單一，S1 蛋白有諸多非抗原表位區域，在PEDV 亞單位疫苗設計中，COE 和S1蛋白可能沒有表現出最好的免疫原性。

利用大腸桿菌、哺乳動物細胞、酵母細胞或桿狀病毒載體表達系統 (Baculovirus Expression Vector Systems, BEVS) 表達PEDV 的S1 或者COE 蛋白已有成功先例[17-19]。用大腸桿菌表達抗原蛋白，可在短時間獲得高產量目標蛋白，但在大腸桿菌中表達的抗原蛋白不能進行正確折疊和翻譯后修飾，不利于保持目標蛋白的抗原活性。在哺乳動物細胞中，抗原蛋白能進行正確折疊和翻譯后修飾，但哺乳動物細胞培養工藝復雜，成本高。BEVS 或酵母細胞是表達抗原蛋白的一個較佳表達系統，恰當的折疊和翻譯后修飾有利于目的蛋白接近天然蛋白，并且昆蟲細胞或畢赤酵母可大規模懸浮培養，有利于蛋白的大量生產。

本研究致力于開發安全、高效的PEDV 亞單位疫苗，實驗選擇了不同于S1 和COE 蛋白的亞單位，將PEDV 的諸多優勢抗原表位連接起來組成串聯表位EC，期望提高PEDV 亞單位疫苗的免疫原性。將EC 作為抗原蛋白，組裝成桿狀病毒載體表達系統，導入昆蟲細胞系Sf9 表達目標蛋白；利用鎳柱親和層析純化目標蛋白，以收獲純度較高的目標蛋白；利用小鼠實驗檢測串聯表位EC 亞單位疫苗免疫效果，考察其作為PEDV 候選疫苗的潛力。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

質粒pFastBac1、大腸桿菌DH5α和DH10Bac 株、昆蟲細胞Sf9 均為本實驗室保存。無縫克隆試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司，質粒小抽試劑盒和3,3′,5,5′-四甲基聯苯胺(TMB)底物溶液購自天根生化科技 (北京) 有限公司，質粒大抽試劑盒購自Macherey-Nagel 公 司，Cellfectin II 轉 染 試 劑 購自Thermo Fisher Scientific 公司，昆蟲細胞培養基購自壹生科 (深圳) 有限公司，His 一抗 (HRP) 和羊抗鼠IgG 抗體 (HRP) 購自華安生物技術有限公司，小鼠干擾素-γ(Interferon-γ, IFN-γ) ELISA 試劑盒和小鼠腫瘤壞死因子-α(Tumour Necrosis Factor-α, TNF-α) ELISA試劑盒購自欣博盛生物技術有限公司，氫氧化鋁凝膠購自Invivogen 公司。BALB/c 小鼠 (雌性、4～6 周齡) 購自上海杰思捷實驗動物有限公司。

1.2 串聯表位設計與構建

參考NCBI 登錄的PEDV 的S 蛋白和M 蛋白氨基酸序列 (GenBank: AF353511.1)，根據昆蟲細胞表達系統，優化合成相應基因序列。以signal-F、signal-R、E1-F、E1-R、E1-R1、E2-F、E2-R、E4-F、E4-R、S1-R、P-EC-F、P-E1-F、P-S1-F 和P-EC-R 為引物 (表1)、以S 基因、M 基因和pFastBac1 質粒為模板，通過PCR 分別獲得S 蛋白的分泌信號肽區域、COE 區域(E1)、S1D 區域 (E2)、C 端區域 (E3)、S1 區域以及M 蛋白的M3 區域 (E4) 基因序列和線性化pFastBac1載體。用Linker (GGGGS) 將E1、E2、E3 和E4 序列串聯起來，得到串聯表位EC。在EC 的N端加上S 蛋白分泌信號肽，C端加上6× His 標簽。用文獻報道的COE 和S1 亞單位作為對照[17,20-21]，先用無縫克隆試劑盒分別將EC、COE 和S1 基因序列與pFastBac1 載體連接起來，再將連接產物轉化為大腸桿菌DH5α 感受態細胞，并用含有氨芐青霉素的LB 平板篩選。篩選獲得陽性克隆后對其基因測序，再從測序無誤的陽性克隆中提取重組pFastBac1-EC、pFastBac1-COE 和pFastBac1-S1 質粒。分別將重組質粒轉化為大腸桿菌DH10Bac 感受態細胞，用含有卡那霉素、氯霉素、四環素、IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷) 和X-gal 的LB(Luria-Bertani) 平板篩選。篩選獲得陽性克隆后對其基因測序，再從測序無誤的陽性克隆中提取重組MultiBac-EC、MultiBac-COE 和MultiBac-S1 質粒。取對數生長期、存活率高于90% 的Sf9 細胞接種于六孔板，接種密度每毫升含1×106個細胞，每孔2 mL。利用Cellfectin II 轉染試劑分別將MultiBac-EC、MultiBac-COE 和MultiBac-S1 重組質粒轉染Sf9 細胞。將轉染后的Sf9 細胞在27 ℃培養箱中靜置培養4 d，收獲P1 代重組桿狀病毒。以感染復數 (Multiple of Infection, MOI) 為0.1、用P1 病毒感染Sf9 細胞。將感染的Sf9 細胞在27 ℃培養箱中靜置培養4 d，收獲較高滴度的P2 代重組桿狀病毒，再依次收獲更高滴度的P3 代重組桿狀病毒。用蛋白印跡 (Western Blot, WB) 法分別檢測P3 代重組桿狀病毒的Sf9 細胞培養液上清、Sf9 細胞裂解液上清和Sf9 細胞裂解液沉淀，用His 一抗 (HRP)鑒定EC 蛋白、COE 蛋白和S1 蛋白的表達情況。

表1 引物信息Table1 Primers information

1.3 EC 蛋白、COE 蛋白和S1 蛋白的生產與純化

為了生產EC 蛋白，將對數生長期、存活率高于90% 的Sf9 細胞按照每毫升7× 105個細胞的密度接種于1 L 搖瓶中，每瓶400 mL，擴培20 瓶。在27 ℃、140 r/min 培養24 h，待細胞密度長至每毫升1.5×106個細胞左右時，以MOI 為0.5 加入P3 代病毒。當細胞存活率降至30% 左右時收取樣品，在1 000×g、4 ℃下離心10 min，收集離心上清，在10 000×g、4 ℃下再次離心30 min，收集離心上清。先用0.45 μm濾膜過濾，再用截留分子量10 kDa 的膜包超濾濃縮，再次用0.45 μm 濾膜過濾濃縮樣品。

采用鎳柱親和層析法純化EC 蛋白。相關緩沖液配方為：(1)平衡液：20 mmol/L Tris-HCl + 100 mmol/L NaCl + 2 mmol/L 咪唑 (pH 8.4)；(2)洗脫液：20 mmol/L Tris-HCl + 100 mmol/L NaCl +X(X分別為15，50，100，500 mmol/L)咪唑 (pH 8.4)。鎳柱親和層析步驟如下：先以115 cm/h 的流速用去離子水洗5 個柱體積，再以同樣流速用平衡液平衡柱子 (5 個柱體積)，然后以75 cm/h 流速上樣，收集流穿樣品；上樣完成后以115 cm/h 流速用平衡液沖洗柱子 (5 個柱體積)，再以115 cm/h 的流速依次用咪唑濃度由低到高的洗脫液逐步洗脫目標蛋白和雜蛋白，收集洗脫樣品。采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)檢測純化效果。

同樣，用攜帶COE 基因的重組桿狀病毒感染Sf9 細胞 (MOI 為0.5) 生產COE 蛋白；用攜帶S1 基因的重組桿狀病毒感染Sf9 細胞 (MOI 為5) 生產S1 蛋白。純化COE 蛋白時，相關緩沖液配方為：(1)平衡液：20 mmol/L Tris-HCl + 100 mmol/L NaCl +2 mmol/L 咪唑溶液 (pH 8.4)；(2) 洗脫液：20 mmol/L Tris-HCl + 100 mmol/L NaCl +X(X分別為10，50，100，500 mmol/L)咪唑 (pH 8.4)。純化S1 蛋白時，相關緩沖液配方為：(1)平衡液：20 mmol/L PB + 150 mmol/L NaCl + 2 mmol/L 咪 唑 溶 液 (pH 7.4)；(2) 洗 脫 液：20 mmol/L PB + 150 mmol/L NaCl +X(X分別為10，15，50，100，500 mmol/L)咪唑 (pH 7.4)。其余步驟同EC蛋白的生產與純化過程。

1.4 EC、COE 和S1 亞單位疫苗免疫原性評價

將BALB/c 小鼠分為EC 亞單位疫苗免疫組 (EC +AL)、COE 亞單位疫苗免疫組 (COE + AL)、S1 亞單位疫苗免疫組 (S1 + AL) 和PBS 對照組 (PBS)，每組各免疫10 只。分別將EC、COE 和S1 蛋白分別與鋁膠佐劑等體積混合制備成疫苗，再分別將各組疫苗和PBS 皮下注射到BALB/c 小鼠體內。首次免疫劑量為每劑75 μg，首次免疫后兩周進行二次免疫，二次免疫劑量為每劑50 μg。分別在二次免疫后7 d 和14 d摘除小鼠眼球取血，將其放入血液室溫靜置1 h，再放置4 ℃冰箱過夜，在3 000 r/min、4 ℃離心15 min。用移液槍吸出上層血清到新的EP 管中，再次在3 000 r/min、4 ℃離心15 min。將上層血清分裝到PCR 管中，每管10 μL，保存在-20 ℃冰箱備用。用酶聯免疫吸附測定 (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)法分別檢測血清中的IgG 抗體、IFN-γ和TNF-α。

檢測IgG 抗體時，用純化的COE、EC 和S1 蛋白作為包被抗原，3 種包被抗原等質量比混合，包被抗原的總質量濃度為6 μg/mL。用PBS 稀釋抗原，將稀釋混合好的抗原加入酶標板中 (每孔100 μL)，再將酶標板放置4 ℃冰箱孵育過夜。棄去酶標板中的液體，每孔加入300 μL PBST 洗滌，靜置30 s 后棄去PBST，在吸水紙上拍干酶標板，如此重復洗滌5 次。加200 μL、10 g/L BSA 到酶標板各個孔中，在37 ℃恒溫箱孵育2 h，再次用PBST 洗滌。加100 μL、10 g/L BSA 稀釋1 600 倍的血清到酶標板各個孔中，在37 ℃恒溫箱靜置孵育1 h，用PBST 洗滌后，加100 μL、10 g/L BSA 稀釋5 000 倍的羊抗鼠IgG 抗體 (HRP)到酶標板各個孔中，37 ℃恒溫箱靜置孵育1 h，再次洗滌。加100 μL TMB 底物溶液到酶標板各個孔中，室溫避光孵育10 min。加50 μL、2 mol/L H2SO4溶液到酶標板各個孔中以終止反應，盡快用酶標儀在OD450處檢測各個孔的吸光度值。

2 結果與討論

2.1 重組桿狀病毒鑒定

將篩選獲得的白斑進行PCR 驗證，結果如圖1所示。PCR 獲得EC、COE、S1 片段的理論大小分別約3 500、2 700、4 500 bp，各個片段都符合理論大小。將PCR 反應原液測序，并將測序正確的菌株保種。

圖1 攜帶EC、COE、S1 序列的重組桿狀病毒菌落驗證Fig.1 Validation of recombinant baculovirus colonies born with EC, COE, S1 sequences

2.2 EC、COE、S1 蛋白表達

EC、COE、S1 蛋白C 端均帶有His 標簽，可用His抗體檢測目標蛋白。采用WB 法分別檢測P3 代病毒的Sf9 細胞培養液上清、Sf9 細胞裂解液上清和Sf9 細胞裂解液沉淀，結果如圖2 所示。本實驗預測COE、EC 和S1 蛋白大小分別為19、44 kDa 和81 kDa，同時COE、EC、S1 蛋白都可在培養液上清里檢測到，說明這3 種蛋白能在Sf9 細胞中可溶性表達，并分泌到細胞外。

圖2 Western Blot 檢測COE (a)、EC (b) 和S1 (c) 蛋白在昆蟲細胞系Sf9 中表達Fig.2 Expressions of the COE (a), EC (b) and S1 (c) proteins in insect cell line Sf9 detected by Western Blot

2.3 EC、COE 和S1 蛋白的純化

EC、COE 和S1 蛋白C 端均帶有His 標簽，采用鎳柱親和層析純化各個蛋白，用SDS-PAGE 檢測不同條件下洗脫的樣品,結果見圖3。由圖可見，在本文的實驗條件下，EC、COE 和S1 蛋白在鎳柱上的親和結合效果較佳，沒有檢測到目標蛋白流穿；大部分雜蛋白流穿，與目標蛋白分離。20 mmol/L Tris-HCl +100 mmol/L NaCl +50 mmol/L 咪 唑 洗 脫 液 (pH 8.4)、20 mmol/L Tris-HCl + 100 mmol/L NaCl + 10 mmol/L咪唑洗脫液 (pH 8.4) 和20 mmol/L PB + 150 mmol/L NaCl + 50 mmol/L 咪唑 (100 mmol/L) 咪唑洗脫液 (pH 7.4) 分別是洗脫EC、COE、S1 蛋白的最優條件，可以洗脫大部分目標蛋白。

圖3 SDS-PAGE 檢測鎳柱親和層析純化的EC (a)、COE (b) 和S1 (c) 蛋白Fig.3 SDS-PAGE determinations of EC (a), COE (b) and S1 (c) proteins purified with Ni affinity chromatography column

2.4 亞單位疫苗免疫效果

為了評價EC 亞單位疫苗的免疫原性，我們將EC 免疫組亞單位疫苗 (EC + AL)、COE 免疫組亞單位疫苗 (COE + AL)、S1 免疫組亞單位疫苗 (S1 + AL)和免疫對照組PBS 分別皮下注射到BALB/c 小鼠頸背部，首次免疫后兩周進行二次免疫。分別在二次免疫后的7 d 和14 d 摘除小鼠眼球取血，用ELISA法檢測血清中的IgG 抗體、IFN-γ和TNF-α。

采用間接ELISA 法檢測二次免疫后第14 d 的小鼠血清IgG 抗體水平?？乖毁|量濃度為6 μg/mL，血清稀釋比例為1∶1 600。圖4(a)結果表明，與PBS對照組相比，各個實驗組中免疫小鼠血清中的IgG抗體均有顯著提升 (P＜ 0.001)，COE + AL 組免疫小鼠血清IgG 抗體水平與S1 + AL 組沒有明顯差異，串聯表位亞單位疫苗EC + AL 組免疫小鼠血清IgG 抗體水平顯著高于其余各組 (P＜ 0.01)，比COE + AL組和S1 + AL 組分別提升了43% 和52%。

圖4 ELISA 檢測兩次免疫EC、COE 或S1 亞單位疫苗小鼠血清IgG (a)、IFN-γ (b) 和TNF-α (c) 水平Fig.4 ELISA determination of serum IgG (a), IFN-γ (b) and TNF-α (c) levels of mouse vaccinated with EC, COE or S1 subunit vaccine twice

采用雙抗夾心ELISA 法檢測二次免疫后第7 d的小鼠血清IFN-γ(圖4 (b)) 和TNF-α水平 (圖4 (c))。結果表明，與PBS 對照組相比，各個實驗組中免疫小鼠血清IFN-γ和TNF-α均有一定提升，COE+AL 組免疫小鼠血清IFN-γ、TNF-α水平與S1 + AL 組接近，串聯表位亞單位疫苗EC+AL 組免疫小鼠血清IFN-γ、TNF-α水平高于其余各組，其中EC+AL 組的IFNγ水平比COE+AL 組和S1+AL 組分別提高了61%和53%，TNF-α水平比COE+AL 組和S1+AL 組分別提升了84%和65%。

3 結 論

本文將S 蛋白的COE 區域、S1D 區域、C 端區域以及M 蛋白的M3 區域通過Linker 串聯起來，設計了串聯表位EC。將EC 和文獻報道的COE 和S1 基因片段分別插入桿狀病毒基因組，EC、COE、S1 蛋白在BEVS 中實現了分泌表達。在不同的純化條件下，分別獲得了較高純度的EC、COE、S1 蛋白。EC + AL 組、COE + AL 組和S1 + AL 組亞單位疫苗以及PBS 對照組分別免疫BALB/c 小鼠后，EC +AL 組表現出了更強的免疫原性。EC + AL 組亞單位疫苗激發小鼠產生更高水平的特異性抗體IgG 以及免疫相關細胞因子IFN-γ和TNF-α。這說明串聯表位EC 能更好地激發小鼠的體液免疫和細胞免疫應答，具有作為PEDV 亞單位疫苗的潛力。