AAV 介導的TNFR 關節內基因治療對血友病性關節病預防和治療的實驗研究

林振洋，王冶凡，張飛旭2，周新月，宗曉瑩，吳俠,3，華寶來4,5，肖嘯,3，孫君江,3

（1.華東理工大學藥學院，上海 200237；2.華東理工大學生物工程學院，上海 200237；3.國家生物器反應工程重點實驗室，上海 200237；4.徐州醫科大學揚州臨床學院，江蘇 揚州 225001；5.揚州大學臨床醫學院血液科，江蘇 揚州 225001）

血友?。℉emophilia）是一種先天性凝血因子缺乏病，主要包括Ⅷ因子缺乏所導致的血友病A 型和Ⅸ因子缺乏所導致的血友病B 型。血友病的主要癥狀表現為全身不同組織和器官自發性出血和創傷性出血，而關節部位的自發性出血占出血事件的70%～80%[1]。關節內反復出血將導致血液積累，引起鐵沉積、巨噬細胞增多和炎性細胞因子表達增加，最終引發滑膜炎癥、軟骨退化以及骨重建等病變[2]，導致血友病性關節?。℉emophilicArthropathy，HA）的形成。目前對于血友病性關節病的治療，主要是預防性地使用重組凝血因子蛋白，減少出血概率，但是凝血因子替代療法價格昂貴、應用有限，而且患者體內容易產生針對凝血因子的抑制物；而對于已患有HA 的患者，只能通過外科手術對關節進行置換，但具有發生嚴重出血的風險[1,3]。

在關節炎的發展過程中，白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNFα）、白介素-6（IL-6）等炎性細胞因子起到了關鍵性的作用[4]。Manetti 等[5]的研究結果顯示，HA 患者血液中的TNFα 水平與HA 的嚴重程度呈正相關，且在HA 患者的膝關節滑膜液中的TNFα 的 含 量 要 顯 著 高 于 骨 關 節 炎（Osteoarthritis，OA）患者?？扇苄阅[瘤壞死因子受體（SolubleTumor NecrosisFactorReceptor，sTNFR）是一種天然存在的可以結合TNFα 的受體蛋白[6]。sTNFR 重組蛋白以及表達sTNFR 的基因治療藥物一直被應用于各種關節炎的治療[7-13]，如sTNFR 的商品化藥物依那西普（Etanercept）已經上市并用于治療類風濕性關節炎[14]。在我們完成的一項臨床轉化研究中發現，血友病性關節炎小鼠模型中，關節出血引起關節內TNFα 水平升高，而使用抗TNFα 的治療方法可減輕血友病性關節病癥狀；在臨床研究中，HA 患者的關節內TNFα的水平較外周循環中顯著增高，向HA 患者的關節內單次注射sTNFR 重組蛋白后，關節內TNFα 水平隨之下降，滑膜炎癥得到減緩[15]。然而在該研究中僅單次給藥sTNFR 重組蛋白，無法實現長期治療。因此，希望通過向關節內局部注射重組腺相關病毒（RecombinantAdeno-AssociatedVirus，rAAV），以基因治療（GeneTherapy）的方式實現單次注射后關節內長期、局部表達sTNFR，從而達到治療HA 的效果。

本文將表達TNFR 的質粒(pAAV-TNFR:Fc)包裝為rAAV5-TNFR:Fc 載體，注射到B 型血友病小鼠關節內，在關節內出血42d 后，提取小鼠關節組織的RNA，利用定量聚合酶鏈式反應(qPCR) 方法檢測TNFα、IL-1β、IL-6 和IL-10 的mRNA 表達水平，同時取關節組織用于病理切片，對病理切片進行不同指標的組織化學染色，并根據相應方法對各病理變化進行定量研究。結果表明TNFR 可以在關節內持續表達，滑膜炎癥以及炎性細胞浸潤和血管新生的病變的程度顯著減輕，探究了關節內的局部基因治療對血友病性關節病的預防和治療作用的理論可行性，并奠定了初步的實驗基礎。

1 實驗部分

1.1 原料和試劑

本文所用pAAV-CB 骨架質粒（含CB 啟動子的AAV 載體）由本實驗室保存，pUC57-TNFR:Fc 質粒（表達TNFR-Fc 目的蛋白的pUC57 載體）由深圳華大基因合成。Trans5α 化學感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司；質粒小量回收試劑盒和膠回收試劑盒購自Omega 公司；質粒大量抽提試劑盒購自Macherey-Nagel 公司；限制性內切酶以及T4 連接酶購自ThermoFisher 公司；用于配制LB 培養基的酵母提取物和胰蛋白胨均購自Oxoid 公司。

人滑膜成纖維細胞（Human Fibroblast-Like Synoviocyte，HFLS）購自北納創聯生物科技有限公司，細胞編號BNCC338586；檸檬酸鐵（分析純）購自上海麥克林生化科技有限公司；DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）高 糖 培 養 基、胎 牛 血 清（FBS）和 胰 蛋 白 酶-EDTA（Ethylene Diamine TetraaceticAcid）（φ =0.25%）購自ThermoFisher 公司；抗TNFR1 抗體（ab90121）購自Abcam 公司；抗TNFα抗體（BAF410）購 自R＆D Sysyem 公 司；抗GAPDH（Glyceraldehyde-3-PhosphateDehydrogenase，甘油醛-3-磷 酸 脫 氫 酶） 抗 體（ARG10112 ） 購 自Arigo Biolaboratories 公司；抗F4/80抗體（28463-1-AP）和抗血管性血友病因子（vonWillebrandFactor，vWF）抗體（11778-1-AP）購自Proteintech 公司。

B 型血友病小鼠（凝血因子Ⅸ表達基因敲除）購自百奧賽圖江蘇基因生物技術有限公司；多聚甲醛固定液購自武漢賽維爾生物科技有限公司；乙二胺四乙酸（EDTA）脫鈣液購自北京雷根生物技術有限公 司；RIPA（Radio Immunoprecipitation Assay）裂 解液、SDS-PAGE（SodiumDodecylSulfate-Polyacrylamide GelElectrophoresis）凝膠快速配制試劑盒、Western 封閉液、蘇木素伊紅（H＆E）染色試劑盒、檸檬酸鈉-EDTA 抗原修復液、內源性過氧化物酶強力封閉液和DAB（Diaminobenzidine）辣根過氧化物酶顯色試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；普魯士藍染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；1-溴-3-氯丙烷（分析純）、二甲苯（分析純）、 φ=75%乙醇（分析純）、異丙醇（分析純）和無水乙醇（分析純）購自上海優試化工有限公司；HistoMount 封片劑和TRIzol 購自ThermoFisher；反轉錄PrimeScriptMix 購自Takara公司；qPCRSYBRMix 購自南京諾唯贊生物。

1.2 測試與表征

生化培養箱（SHP-250）購自上海精宏實驗設備有限公司；二氧化碳培養箱（BB150）購自美國ThermoFisher 公司；臺式冷凍離心機（5424R）購自德國Eppendorf 公司；PCR 儀（T100）購自美國Bio-Rad 公司；高通量水平電泳槽（HE-220）、數顯式穩壓穩流電泳儀（EPS600）、轉移電泳槽（VE-586）、全自動凝膠成像系統（2500）和全自動化學發光圖像分析系統（5200）購自上海天能科技有限公司；實時熒光定量PCR 儀（qTOWER3G）購自德國AnalytikJena 公司，微量進樣器（10μL）購自美國Hamilton 公司，病理切片機（RM2016）購自德國Leica 公司。

1.3 實驗步驟

1.3.1 質 粒 構 建 在NCBI （ National Center for BiotechnologyInformation）網站得到的人TNFR1 胞外區序列，經密碼子優化后，附上小鼠IgG1-Fc 片段，再在該段基因前加入Kozak 序列，得到最終的目的基因TNFR:Fc 序列。將該目的基因序列提交深圳華大基因科技有限公司合成pUC57-TNFR:Fc 質粒。以pUC57-TNFR:Fc 為 模 板，PCR 擴 增TNFR:Fc基因。利用限制酶BshTⅠ和SacⅠ分別對PCR 產物和pAAV-CB 進行雙酶切，經核酸凝膠電泳純化后，將骨架片段和目的基因片段進行膠回收后，用T4 連接酶對兩個片段進行連接，并轉化感受態細胞Trans5α，提取質粒使用SmaⅠ酶切鑒定，通過鑒定用于病毒生產，即pAAV-CB-TNFR:Fc。

1.3.2 重組腺病毒的生產、擴增和純化 本文所用的rAAV5-TNFR:Fc 的包裝、擴增和純化由上海泰兒圖生物科技公司完成。

1.3.3 細胞培養 本文所用細胞為HFLS，便于研究體外rAAV5 對滑膜細胞的感染效果。將HFLS 鋪于6 孔板中，添加含 φ=10%FBS 的DMEM 培養基進行培養。當匯合度達到孔面積的70%～80%，按每個細胞1×106vg 的感染復數（MultiplicityofInfection，MOI）添加rAAV5-TNFR:Fc，培養72h 收取上清后，向細胞中加入RIPA 裂解液，轉移至1.5mLEP(Eppendorf)管中，于4℃，12000r/min 下離心10min，收取細胞裂解液的上清。細胞培養上清和細胞裂解液上清經定量和變性后用于蛋白免疫印跡。

1.3.4 蛋 白 免 疫 印 跡(WesternBlot) 分 別 配 制φ =10%和 φ=15%聚丙烯酰胺凝膠用于TNFR:Fc 和TNFα 蛋白的電泳。上樣于凝膠后，分別于80V 和120V電泳1h，取經電泳的凝膠進行轉膜2h，封閉液封閉2h，一抗孵育12h，二抗孵育2h，于化學發光圖像分析系統對結果進行觀察?？贵w的使用濃度（抗體原液與抗體稀釋液的體積比）分別為：抗TNFR1 抗體，1/2000；抗TNFα 抗體，1/100；抗GAPDH 抗體，1/4000。用ImageJ 軟件對免疫印跡所得結果圖中的條帶進行灰度值分析。

1.3.5 實驗動物 本文所用實驗動物為6～8 周齡的B 型血友病小鼠。對小鼠右膝關節進行穿刺處理，引起關節出血，積累的血液將引起血友病性關節?。℉A）。主要動物實驗的小鼠分組包括預防治療組和延后治療組，如圖1 所示。

圖1 主要動物實驗的小鼠分組Fig.1 Groupsofmiceformajoranimalexperiments

取一批小鼠作為預防治療組（n=3），對其右膝關節注射10μLrAAV5-TNFR:Fc，劑量為每個關節1×1011vg，給藥14d 后再對小鼠的右膝關節進行穿刺處理誘導出血。同時取另一批小鼠設為相應的PBS（PhosphateBufferedSaline）組（n=3），對其右膝關節注射10μLPBS，注射和穿刺處理時間點與給藥組均相同。穿刺處理42d 后（給藥56d 后）處死小鼠，取右膝關節用于后續實驗。另外，取一批小鼠作為延后治療組（n=3），對其右膝關節進行穿刺處理誘導出血，出血14d 后再向右膝關節內注射10μLrAAV5-TNFR:Fc，劑量為每個關節1×1011vg。同時取另一批小鼠設為相應的PBS 組（n=3），對其右膝關節注射10 μLPBS，穿刺處理和注射時間點與給藥組均相同。穿刺處理42d 后（給藥28d 后）處死小鼠，取右膝關節用于后續實驗。

兩個治療組的小鼠從關節穿刺到小鼠被處死的時間間隔均為42d。此外，設NC（NegativeControl）組小鼠除不接受給藥和穿刺處理之外，其余添加均相同。

1.3.6 提取RNA 取小鼠的右膝關節，經研磨和勻漿處理后，用TRIzol 試劑提取關節中的RNA。

1.3.7 定量聚合酶鏈式反應(qPCR) 將提取所得的各樣本的RNA 進行定量后，用PrimeScriptMix 反轉錄為cDNA，將cDNA、雙蒸水和SYBRMix 混合成擴增體系，用于qPCR 測定TNFR 或細胞因子的mRNA表達變化，檢測各指標時均設3 個副孔。

1.3.8 免疫組化染色 取小鼠的右膝關節，經固定、脫鈣、包埋等系列處理后用于病理切片。使用切片進行后續的H＆E 染色、抗F4/80 染色以及抗vWF 染色。本文中所展示的染色結果均為各組內的代表性結果，針對H＆E 染色結果的滑膜炎評分參照文獻[16]中所述標準進行，對F4/80 染色結果的巨噬細胞浸潤評分和對vWF 染色結果的新生血管計數參照文獻[17]中所述方法進行，對每組（n=3）切片的評分均為3 名人員獨立評分后得出的均值。

2 結果與討論

2.1 出血后小鼠關節中TNFα mRNA 水平變化

對B 型血友病小鼠右膝關節進行穿刺處理，28d 后取其膝關節提取RNA，用qPCR 測定TNFα的mRNA 水平變化，見圖2。結果顯示，經穿刺處理后，出血關節中TNFα 在mRNA 水平為其對照組的1.36倍（p＜0.05）。同時，取小鼠膝關節用于WesternBlot檢測TNFα 蛋白水平變化，圖2(b)示出了其中代表性結果。使用ImageJ 軟件對TNFα 的條帶進行灰度值分析，出血關節內TNFα 的含量為NC 組中的2.53 倍（p＜0.05），說明穿刺處理28d 后，出血關節中的TNFα表達上升。

圖2 B型血友病小鼠右膝關節進行穿刺處理28d 后右膝關節TNFα 表達水平的變化Fig.2 ExpressionlevelchangeofTNFαinrightkneejointsofHemophiliaBmice28dafterthepuncture

類似地，Haxaire 等[18]對A 型血友病小鼠膝關節進行穿刺處理，28d 后經穿刺的膝關節中TNFα 的mRNA 水平相對于其對照關節也呈升高趨勢（3.6 倍，p＜0.05）。而且在本課題組近年的兩項研究中，在小鼠關節內發生出血后[15,19]，短期內以及長期內關節中TNFα 的含量均顯著上升。Ovlisen 等[20]的研究結果顯示，對A 型血友病小鼠膝關節穿刺處理后的第3d，經穿刺的膝關節內TNFα 的含量與對照無明顯差異，而IL-1β 和IL-6 的含量均顯著上升（p＜0.0001）。

2.2 質粒構建和載體體外表達驗證

根據小鼠關節內出血后其中TNFα 表達上升的結果，本文構建了表達sTNFR 蛋白的AAV 表達載體。在得到AAV 表達載體之前，首先需要用分子克隆的方法獲得表達sTNFR 蛋白的質粒，在本文中即將目的基因序列插入兩段ITR（Inverted Terminal Repeat）序列的CB 啟動子表達盒中，ITR 序列為質粒DNA 在體內由單鏈轉變為雙鏈所必需的元件。而本文所用目的基因片段是人TNFR1 的胞外區序列加小鼠IgG1 的Fc 序列，相對于TNFR2，TNFR1 對TNFα 的親和力更強[21]，而IgG 的添加使得表達的TNFR 能以二聚體形式更加穩定地存在，從而延長了在體內的半衰期[11]。已經上市的Etanercept 就是人TNFR 與人IgG 的融合蛋白的二聚體[14]。

從質粒的SacⅠ單酶切和SacⅠ、BshTⅠ雙酶切結果可以看出，其總大小在5000～7500bp 之間（應為6300bp），目的基因大小在1000～2000bp 之間（應為1300bp），說明目的基因已經插入了預期的位點。為鑒定質粒ITR 片段留存情況，使用SmaⅠ酶對質粒進行單酶切后，可以得到3 個片段，且在原質粒大小處（6300bp）無條帶（圖3(a)）?？梢娔康幕蛞驯豢寺〉捷d體骨架上的預期位點，且ITR 片段沒有丟失。包裝質粒時采用了AAV5 的血清型，其優勢在于AAV5 在嚙齒類動物的炎癥關節中的目的基因轉導效率比AAV2 更高[22]，且AAV5 在多種常見的天然血清型中擁有極低的中和抗體陽性率[23]，因此使用AAV5 更利于療法擴展至臨床應用。

為驗證病毒載體對表達目的蛋白的能力，用包裝所得的rAAV-TNFR:Fc 感染HFLS，MOI 為每個細胞1×106vg，收取細胞的培養上清和細胞裂解液上清，用于WesternBlot 實驗。被感染細胞的細胞裂解液上清樣本在膜上有明顯條帶，其上清樣本中也能觀察到微弱條帶（圖3(b)），但在未感染的細胞的樣本中未見表達，說明該病毒能夠感染HFLS 并使其穩定表達TNFR:Fc，表達的TNFR:Fc 部分分泌到上清中。

圖3 質粒酶切后電泳結果及rAAV5-TNFR:Fc 感染HFLS 后TNFR 表達的WesternBlot 結果Fig.3 ElectrophoresisofdigestedplasmidandWesternBlotofTNFRinHFLSinfectedwithrAAV5-TNFR:Fc

2.3 載體的小鼠體內表達能力驗證

在完成載體的體外表達能力驗證之后，為進一步驗證載體的體內表達能力，向小鼠的右膝關節內注射1×1011vg 的rAAV5-TNFR:Fc，給藥28d 后取其膝關節提取RNA 用于qPCR 檢測TNFR 的表達，其給藥組的TNFRmRNA 水平相比于對照組上升至551.23 倍（p＜0.01，圖4(a)）。同時取小鼠膝關節提取蛋白進行Westernblot 檢測TNFR 的表達。相比于對照組，能觀察到給藥組樣本在膜上有TNFR 的明顯條帶（圖4(b)）。上述結果說明rAAV5-TNFR:Fc 在小鼠關節內能夠持續地表達TNFR:Fc。

圖4 向B 型血友病小鼠右膝關節內注射rAAV5-TNFR:Fc28d 后右膝關節組織內的TNFR 的表達水平變化Fig.4 ExpressionlevelchangeofTNFRinrightkneejointsafterHemophiliaBmicewereintra-articularlyinjectedwithrAAV5-TNFR:Fc intorightkneejointsafter28d

類似地，Zhang 等[12]在小鼠關節內注射1.6×1011vg劑量的rAAV-TNFR1，關節內的sTNFR 在28d 時達到峰值，60d 時關節內仍能檢測到可觀水平的sTNFR。Khoury 等[10]在小鼠關節內注射1.5×109vg的rAAV5-TNFR:Fc，91d 后仍能檢測到一定水平的TNFR。Zhou 等[9]向大鼠右膝關節內注射3×1010vg的rAAV2-TNFR:Fc，35d 后，在血漿、給藥關節和對側關節中仍能檢測到顯著的sTNFR 表達?？梢婈P節內注射的rAAV-TNFR 介導的關節內TNFR 的局部表達具有良好的可持續性。

2.4 關節內注射AAV-TNFR:Fc 對出血后關節內細胞因子表達水平的影響

在預防治療組中，與NC 組相比，PBS 組的各細胞因子mRNA 水平均不同程度地顯著上升（圖5(a)）。與PBS 組相比，給藥組中TNFα 與IL-1β 的mRNA水平顯著下降，IL-6 與IL-10 的mRNA 水平則沒有明顯改變；而與NC 組相比，給藥組中TNFα 和IL-1β的mRNA 水平已無顯著差異，說明藥物顯著降低了炎癥進程中細胞因子網絡中TNFα 和IL-1β 的表達，二者恢復到正常水平，但對IL-6 和IL-10mRNA水平的表達沒有影響。

在延后治療組中，與NC 組相比，PBS 組的各細胞因子mRNA 水平同樣均不同程度地顯著上升（圖5(b)）；與PBS 組相比，在給藥組中，僅IL-1β 的mRNA 水平顯著下降，TNFα、IL-6 和IL-10 的mRNA水平無明顯差異；然而給藥組和NC 組間TNFα 的mRNA 水平已無顯著差異，給藥組中TNFα 的mRNA表達與NC 組的水平相近。

圖5 關節內注射rAAV5-TNFR:Fc 對B 型血友病小鼠關節內出血后細胞因子的表達水平的影響Fig.5 Effect of intraarticular injection of rAAV5-TNFR:Fc on cytokine expression levels in hemarthrosis joints of HemophiliaBmice

上述兩治療組關節勻漿的qPCR 結果顯示，TNFα 的mRNA 表達水平與NC 已無顯著差異，IL-1β 的mRNA 表達水平顯著下降，而IL-6 和IL-10 的mRNA 表達水平無明顯改變。

取延后治療組小鼠的右膝關節勻漿用于Western Blot 檢測TNFα 表達的變化，圖5(c)為實驗的代表性結果。使用ImageJ 對WesternBlot 結果中TNFα 條帶進行灰度分析，PBS 組和給藥組中TNFα的含量分別為NC 組的1.83 倍（p＜0.05）和1.14 倍，說明關節內注射rAAV-TNFR:Fc 降低了出血42d 后關節中的TNFα含量。

盡管HA 是由多個因素共同導致的病變，具體的病理機制有待闡明，但關節炎癥進程中細胞因子網絡中的主要細胞因子的介導機制近年來已有不少系統性的報道，核因子-κB（NF-κB）相關通路在其中發揮了重要作用[24-25]。關節中血液的代謝產物含鐵血黃素在滑膜細胞和巨噬細胞中過度積累，引發了對細胞中NF-κB 表達的刺激，由此促進了TNFα、IL-1β、IL-6 和IFNγ 的表達，本文也檢測到了TNFα、IL-1β、IL-6 表達水平的上升。這些炎性細胞因子表達的上升又正反饋于NF-κB 通路的活性[24-25]，而且也可促進胞外信號調節激酶（ERK，Extracellularsignalregulatedkinase）、p38、信號轉導和轉錄激活因子3（Signal Transducer and Activator of Transcription 3，STAT3）相關通路的活性，促進具有抗炎和軟骨保護活性的IL-10 的表達[4]，因此在qPCR 的結果中，各種細胞因子的水平均顯著上升。

Haxaire 等[18]對血友病A 型小鼠的膝關節進行單次穿刺處理后，對經穿刺關節的軟組織中的TNFα的mRNA 水平進行測定，在穿刺之后第3、7、14、30d，TNFα 的mRNA 水平分別為對照組的約13、5、6、4 倍，說明在單次出血造成的HA 中，TNFα 的mRNA表達量本身呈隨時間推移而下降的趨勢，在本文中該值（第42d）為1.47 倍（p＜0.05），而給藥組中該值為1.20 倍。Zhou 等[9]向由膠原誘導形成全身炎癥的兩組大鼠的膝關節內分別注射rAAV 衣殼和rAAV2-TNFR:Fc，同樣顯示出rAAV-TNFR:Fc 對TNFα的拮抗效果。35d 后其rAAV 衣殼組和rAAV2-TNFR:Fc組大鼠膝關節內TNFα 含量分別為NC 組的約5.40倍（p＜0.01）和1.4 倍（p＜0.01），均高于本文42d 后對應的兩組的TNFα 含量（1.83 倍和1.14 倍），推測前者的差異（5.40 倍相比1.83 倍）是由于膠原誘導形成的全身炎癥嚴重程度大于局部的血友病性關節炎。文獻[24]測得在小鼠關節出血后的第60d，IL-1β和IL-6 蛋白水平相比于出血后3h 有所降低但仍處于較高水平，而TNFα 已降至近于對照組水平，IL-10水平則明顯高于出血后3h，且顯著高于對照組。

2.5 關節內注射AAV-TNFR:Fc 對出血后關節內病變的治療效果

根據Valentino 等[24]對HA 小鼠滑膜炎模型積分定量分析的方法，對關節組織病理切片的H＆E 染色結果（圖6(a)）的滑膜炎癥病變進行觀察和評分。從滑膜炎評分結果（圖6(b)～6(c)）看，預防治療組中，AAV 組的評分為2.67，其PBS 組的評分為5.00；延后給藥組中，AAV 組的評分為3.78，其PBS 組的評分為5.33，NC 組的評分為0.22（圖中未展示）?？梢妰山o藥組小鼠相對于對應的PBS 組滑膜炎評分均下降，但兩給藥組與NC 組間仍存在顯著差異，說明均未恢復到正常水平。上述結果顯示，rAAV5-TNFR:Fc的關節內局部給藥在一定程度上能夠起到抑制HA 中滑膜炎進展的作用，盡管預防治療組的評分低于延后給藥組，且兩治療組間存在著載體表達時間的差異，但兩種治療方式均能起到顯著降低滑膜炎癥的效果。

圖6 關節內注射rAAV5-TNFR:Fc 治療B 型血友病小鼠HA，關節組織的H＆E 染色結果以及滑膜炎評分Fig.6 H＆EstainingofjointtissueandsynovitisscoringafterHemophiliaBmicewereintraarticularinjectedwithrAAV5-TNFR:FctotreatHA

F4/80 是巨噬細胞表面的一種抗原，在本課題組之前的研究中曾針對該抗原對小鼠關節切片進行免疫組化染色，以評估關節內炎癥細胞的浸潤程度[15]。根據Hoffman 等[17]針對巨噬細胞F4/80 蛋白的染色以及進行巨噬細胞評分的方法，本文將巨噬細胞F4/80 作為抗原對關節病理切片進行免疫組化染色（見圖7(a)），并對巨噬細胞浸潤程度進行觀察和評分圖7(b)～7(c)。從巨噬細胞評分的結果（圖7(b)～7(c)）看，預防給藥組中，AAV 組的評分為1.89，其PBS 組的評分為2.78；延后給藥組中，AAV 組的評分為2.22，其PBS 組的評分為3.00，NC 組的評分為0（圖中未展示），可見兩給藥組的評分相對于對應的PBS組均下降，但兩給藥組與NC 組間仍相差較大，說明均未恢復到正常水平。該評分結果顯示，在慢性HA 中，rAAV5-TNFR:Fc 的關節內局部給藥在一定程度上降低了HA 關節內滑膜中的巨噬細胞的浸潤程度，預防治療和延后治療兩種治療方式均能減少巨噬細胞浸潤程度以保護關節。

圖7 關節內注射rAAV5-TNFR:Fc 治療B 型血友病小鼠HA，關節組織的針對F4/80 抗原的組化染色結果以及巨噬細胞浸潤評分Fig.7 Anti-F4/80antigenIHCofjointtissueandmacrophageinfiltrationscoringafterHemophiliaBmicewereintraarticularinjectedwith rAAV5-TNFR:FctotreatHA

vWF 是能夠介導血小板黏附于血管損傷部位的一種糖蛋白，還具有穩定血液中的凝血因子Ⅷ（FⅧ）的作用，主要由血管內皮細胞產生[27]。根據Hoffman等[17]針對vWF 蛋白的染色以及進行血管計數的方法，本文將其作為抗原對關節病理切片進行免疫組化染色(見圖8(a))，并對高倍鏡（40×）下的新生血管進行觀察和計數，以評估病變關節內的血管增生程度。從新生血管計數結果（圖8(b)～8(c)）看，每高倍鏡視野下，預防給藥組中，AAV 組的新生血管數為5.67，其對應的PBS 組的新生血管數為11.11；延后給藥組中，AAV 組的新生血管數為8.78，其對應的PBS 組的新生血管數為13.78，NC 組為2.33（圖中未展示），可見兩給藥組的每高倍鏡視野下新生血管數量相對于對應的PBS 組均下降，但兩給藥組與NC 組間仍存在較大差距，說明仍未恢復到正常水平。上述結果顯示，rAAV5-TNFR:Fc 的關節內局部給藥在一定程度上能夠抑制HA 關節內滑膜中的新生血管的增生程度，預防治療和延后治療兩種治療方式均能減少血管的增生程度。

圖8 關節內注射rAAV5-TNFR:Fc 治療B 型血友病小鼠HA，關節組織的針對vWF 抗原的組化染色結果以及巨噬細胞浸潤評分Fig.8 Anti-vWFantigenIHCofjointtissueandmacrophageinfiltrationscoringafterHemophiliaBmicewereintraarticularinjectedwith rAAV5-TNFR:FctotreatHA

從對關節組織的滑膜炎評分、巨噬細胞浸潤評分以及新生血管計數結果可見，通過預防治療和延后治療兩種治療方式，rAAV5-TNFR:Fc 的關節內局部給藥在一定程度均能降低關節內的滑膜炎癥程度，并減少巨噬細胞浸潤以及血管增生的病理變化。預防治療組和延后治療組的給藥和關節穿刺的先后順序不同，為了保證從穿刺處理關節到小鼠被處死的時間間隔相同，從而造成了兩治療組目的蛋白的表達時間存在差異，這可能導致延后治療組在滑膜炎評分、巨噬細胞浸潤評分以及每高倍鏡視野新生血管數量均高于預防治療組，盡管如此，延后治療仍顯示出降低這些病變程度的效果。另外，推測導致延后治療組各評分高于預防治療組的另一個重要原因是，在發生出血之后14d 才給藥，關節積累的血液以及其引起的炎癥對關節內的組織已經造成了不可逆的破壞作用，延后的給藥無法改善關節內組織已經受到的損傷，而預防給藥可以最大程度地減少這種破壞，因此，與使用凝血因子藥物預防性地治療HA 類似，應用抗炎藥物治療HA 時，也應遵循預防優先的原則。

此外，本文旨在探究rAAV5-TNFR:Fc 對血友病性關節病的預防和治療作用的理論可行性并奠定初步的實驗基礎，而在臨床研究以及臨床轉化研究中，為阻止人類患者關節內出血情況的惡化，取得更好的抗炎療效，需要將凝血因子與基因療法聯合起來，這比單獨應用基因療法具有更好的可行性和臨床意義。其次，參考zhou 等[7]的臨床研究，本文采用的AAV-TNFR:Fc 的劑量也介于其研究結果的安全范圍內，在該范圍內，HA 對全身循環中細胞因子的影響水平較小[5,19]，盡管如此，TNFR:Fc 水平以及全身循環中各細胞因子的水平有待進一步的檢測，以探究藥物的系統性影響。

3 結束語

在關節內發生出血后，向關節內注射的基因治療藥物rAAV5-TNFR:Fc 能使關節組織持續地局部表達TNFR:Fc，減少關節內炎性細胞因子TNFα 的含量，從而起到抑制關節炎癥進展的作用，預防治療和延后治療兩種方式均能改善關節炎癥，減少炎性的巨噬細胞浸潤和血管增生的病理變化。然而本文僅探究了單獨表達TNFR:Fc 對關節內出血后炎癥的抑制作用，并沒有配合外源性凝血因子藥物的使用，因此對關節僅能起到部分的保護作用，未能完全使病變關節恢復到正常關節水平。向關節內注射rAAV5-TNFR:Fc 用于血友病性關節病的研究值得進一步深入，推測這一療法同樣適用于類風濕性關節炎及骨性關節炎的治療。