水基金屬加工液中微生物多樣性研究

楊 蘭， 曾詩琪， 熊 星， 張 婷， 江 鵬， 周曉龍

（1. 中國石化潤滑油有限公司上海研究院, 上海 200080；2. 華東理工大學化工學院石油加工系, 上海 200237）

金屬加工液在切削、軋制等金屬加工過程中主要發揮著潤滑、冷卻、清洗和設備防銹等作用[1-2]，其組成主要包括水、基礎油和各類化學添加劑。金屬加工液的使用費用大約是機械車間生產成本的10%～20%[3]，因此，金屬加工液的使用壽命至關重要。然而在實際生產過程中，微生物滋生所導致的污染、腐敗問題一直威脅著金屬加工液的正常使用。

金屬加工液為微生物的生長提供合適的營養源和生長環境[4-5]，同時，微生物又可以通過多種渠道（如水、空氣、機械設備或不良的操作習慣等[6]）進入金屬加工液。污染的金屬加工液中礦物油、乳化劑、油性劑等結構及鍵能較弱的有機物優先降解，從而降低金屬加工液的穩定性[7]。另外，微生物在滋生過程中還會產生有機酸腐蝕機械設備和管道[8]，甚至可以通過加工過程中產生的氣溶膠和霧氣在空氣中傳播，因而增加操作人員的患病風險[9-10]。統計數據表明，美國有近120 萬相關工人的健康受到影響[11]。在新冠疫情肆虐全球的背景下，增強人類對直接接觸的微生物污染源的認知十分必要。

添加殺菌劑是金屬加工液控制微生物污染的常見手段，目前殺菌劑主要包括甲醛緩釋類、異噻唑啉酮類和酚類等[12-13]。以上殺菌劑盡管均是廣譜性殺菌劑，但是每種殺菌劑均有針對性，例如甲醛緩釋類殺菌劑抗細菌性優于抗真菌性，而酚類殺菌劑恰恰相反[14]。與此同時，滅殺不同類型微生物所需要的殺菌劑濃度也存在差異[15]。目前，國內鮮有針對水基金屬加工液中微生物污染的研究，實際生產中往往依據經驗向體系內添加殺菌劑。因此，分析金屬加工液中的微生物種類對實際生產有著重要意義。

本文研究了從金屬加工液中分離微生物的可行方法，在不降低微生物濃度的前提下實現微生物從金屬加工液中的提??；并借助Illumina MiSeq 高通量測序完成對6 組金屬加工液樣本的微生物群落組成分析，確定所有樣品在門、綱、目、科、屬和種6 水平下的類型組成，得出優勢細菌和真菌，同時討論了金屬加工液組分對微生物生長的影響。本文有助于了解微生物對金屬加工液使用壽命限制機理，且能指導殺菌劑的選擇和添加。

1 材料和方法

1.1 樣本采集和檢測

實驗共采集6 組來自于不同軋鋼廠現場的金屬加工液樣本，且金屬加工液配方不完全相同，但基本組成均為水、基礎油和化學添加劑，其中水的質量分數超過90%，基礎油為植物油、礦物油和動物油脂中的一種或多種，化學添加劑為油性劑、乳化劑和緩蝕劑等。樣本的相關采集信息和屬性指標見表1。每個樣品采集3 份，將采集到的金屬加工液儲存于干凈的聚乙烯瓶中冷凍保存運回實驗室，實驗期間所有樣本均置于3～10 ℃低溫環境下保存。樣本的使用時間為采集前該金屬加工液被連續使用的時長。

表1 樣本采集信息Table1 Details of sample collection

使用pH 計(雷磁PHSJ-4 型)檢測金屬加工液樣本中pH 值，同時利用重鉻酸鉀氧化法(國家標準HJ 828—2017)測定液相化學需氧量(COD)。

1.2 微生物分離方法及平板計數

破乳法：添加破乳劑是從油、水乳化體系中分離水相的常用手段[16]。實驗選擇聚合氯化鋁(PAC)作為破乳劑，取20 mL 金屬加工液樣本于燒杯中，邊攪拌邊向燒杯中滴加0.5 g/L 的PAC 水溶液至出現明顯絮體，隨后用中速濾紙過濾，取清澈水相作為破乳法菌液。

離心法：取20 mL 金屬加工液樣本，多層紗布過濾去除雜質，然后置于離心管中，在4 000 r/min 下離心10 min[17]。移除液相部分，將底層固相轉移至燒杯中，并使用已滅菌的磷酸鹽緩沖液(pH=7.4) 沖洗以去除殘留油分，重復離心、沖洗3 次，最后將固相分散在5 mL 緩沖液中，作為離心法菌液。

測菌片法：該系列實驗使用德國舒美測菌片。將測菌片浸泡在金屬加工液中10 s，隨后置于30 ℃恒溫培養箱中培養48 h。結束后，使用已滅菌磷酸鹽緩沖液反復沖洗測菌片表面直至菌斑脫落，將得到的液相離心、定容至5 mL，作為測菌片法菌液。

細菌平板計數：使用稀釋涂布平板法完成平板涂布，操作方法見文獻[18]。培養溫度為30 ℃，恒溫培養48 h 后選取30～300 個菌落的平板計算細菌濃度，設置3 組平行實驗，取平均值。培養平板采用LB(Luria-Bertani)培養基，具體組成如下：胰蛋白胨2 g，酵母提取物1 g，氯化鈉2 g，瓊脂3.2 g，去離子水200 mL，pH 7.0～7.2[19]。

1.3 DNA 提取、PCR 擴增和Illumina MiSeq 測序

首先依據E.Z.N.A?soil 試劑盒(美國Omega Biotek 公司)說明書對制得的菌液進行DNA 抽提，并檢測濃度、純度和提取質量。PCR 擴增細菌通用引物序列為：806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’) 和338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)，真菌通用引物為：ITS1F(5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGT AA-3 ’) 和 ITS2R(5 ’-GCTGCGTTCTTCATCGATG C-3’)[20]。PCR 擴增結束后，使用2%(質量分數，下同) 瓊脂糖凝膠回收產物，并純化、洗脫。利用QuantiFluor?-ST(美國Promega 公司) 對回收產物檢測定量。根據 Illumina MiSeq 平臺(美國Illumina 公司)標準操作規程將純化后的擴增片段構建文庫[21]。

1.4 序列處理與分析

原始測序序列使用Trimmomatic 軟件質控，使用FLASH 軟件進行拼接優化。使用的UPARSE 軟件（Version 7.1）根據97% 的相似度對序列進行OTU(Operational Taxonomic Unit)聚類，并在聚類的過程中去除單序列和嵌合體。利用RDP classifier 對每條序列進行物種分類注釋，比對Silva 數據庫（SSU123），設置比對閾值為70%[20,22]。

2 結果與討論

2.1 微生物分離方法

微生物分離過程中體系中的油份會影響DNA抽提結果。因此，必須尋求一種合適的方式將微生物從金屬加工液中分離出來，同時保證微生物濃度不降低。本文分別采用了破乳法、離心法和測菌片法3 種分離方式進行測試，并通過對分離得到的菌液進行細菌平板計數確定分離方式的可行性，實驗結果見表2。

表2 分離前后不同樣品細菌濃度Table2 Bacterial concentration of different samples before and after separation

結果表明，相比于原液，PAC 破乳得到的菌液中細菌濃度明顯減少，說明在PAC 的靜電吸引和架橋等作用下，水相中的微生物會被誤去除。離心法保持了原有的細菌濃度，而測菌片法得到的菌液細菌濃度甚至超過原液，這是因為測菌片上存在微生物生長的營養源，實際上實現了對微生物的富集培養。

對離心法和測菌片法得到的菌液分別進行DNA抽提和PCR 擴增，結果表明離心法菌液擴增結果評級為C 級，表示PCR 產物目的條帶太弱或未監測到，無法進行后續種群鑒定實驗，推測原因可能是離心法菌液未完全去除殘留油份，導致DNA 抽提不理想，進而限制PCR 擴增結果。與之相反，測菌片法菌液擴增評級為A 級，代表DNA 濃度高，可進行后續種群鑒定實驗。因此，最終選定測菌片法來實現微生物從金屬加工液中的分離。

2.2 微生物種類及多樣性分析

借助Illumina MiSeq 高通量測序確定金屬加工液中微生物多樣性，分析結果見表3。送檢的6 組金屬加工液樣品中均檢測出細菌；除QX2和JX 外，剩余4 組樣本未檢測出真菌。盡管檢測出真菌的樣本數少，但真菌擁有更豐富的種屬組成。

表3 金屬加工液微生物多樣性統計Table3 Diversity of microbial in water-based metal working fluids

2.3 金屬加工液細菌群落組成

首先在門、綱、目和科4 個水平對金屬加工液細菌群落組成進行分析，測定結果見圖1。從圖中可以看出，這4 個水平下6 組金屬加工液的群落組成清晰明了。其中，門組成僅由變形菌門(Proteobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)構成；在綱水平上只檢測到變形菌綱(Gammaproteobacteria) 和桿菌綱(Bacilli)。相對豐度上，變形菌門(Proteobacteria) 和變形菌綱(Gammaproteobacteria)占據優勢地位。同時，在目水平上，QX1、QX2、QX3和CJ 4 組金屬加工液的優勢細菌目保持一致，均為腸桿菌目(Enterobacterales)，而JX 和WF 的優勢細菌目分別為伯克氏菌目(Burkholderiales)、芽孢桿菌目(Bacillales) 和假單胞桿菌目(Pseudomonadales)、乳桿菌目(Lactobacillales)。

圖1 不同水平下金屬加工液細菌群落組成Fig.1 Bacterial composition in metalworking fluid at different level

這種一致與差異并存的現象也在科水平上得以體現。QX1、QX2、QX3和CJ 4 組樣本以腸桿菌科(Enterobacteriaceae)為主，而JX 和WF 樣本分別以叢毛單胞菌科(Comamonadaceae)、芽孢桿菌科(Bacillales) 和假單胞桿菌科(Pseudomonadaceae)、氣球菌科(Aerococcaceae)作為優勢細菌科。

在屬水平下，各樣本之間差異性測定結果見圖2。6 組金屬加工液共檢測出10 種細菌屬。QX1中檸檬酸桿菌屬(Citrobacter) 相對豐度占比達到95%，是其優勢細菌屬。與此同時，檸檬酸桿菌屬和Unclassified_f_Enterobacteriaceae屬被發現同時存在于QX2、QX3和CJ 3 組樣本中，區別在于QX2和CJ 中檸檬酸桿菌屬(Citrobacter) 豐度超過50%，而QX3則是以Unclassified_f_Enterobacteriaceae屬為主體。JX 樣本的優勢細菌屬包括叢毛單胞菌屬(Comamonas)和芽孢桿菌屬(Bacillus)。假單胞菌屬(Pseudomonas)、氣球菌屬(Aerococcus)和克雷伯氏桿菌屬(Klebsiella)構成了WF 樣本的優勢細菌屬。此外，也檢測出了少量的不動桿菌屬(Acinetobacter)、普羅威登斯菌屬(Providencia)和摩根氏菌屬 (Morganella)。

圖2 屬水平下金屬加工液細菌群落組成Fig.2 Bacterial composition in metalworking fluid at genus level

種水平下細菌多樣性分析見圖3，共檢測出14 種細菌，而各樣本細菌種數與其COD 濃度呈正比，說明高有機物濃度的環境為細菌生長提供了更多能量來源。其中，QX1的優勢細菌為弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter_freundii_g_Citrobacter)，相對豐度占比為95.68%。檸檬酸桿菌屬是金屬加工液的易檢出細菌[4]。除Citrobacter_freundii-g-citrobacter外，另一種檸檬酸桿菌Unclassified_g_Citrobacter在QX2、QX3和CJ 3 組樣本中被發現也證實了這一點。但是金屬加工液有機成分會對檸檬酸桿菌種類產生影響，例如Citrobacter_freundii具有以甘油為唯一碳源和能源的特性，而甘油可用作金屬加工液的油性劑[23-24]。因此，這種特性可能導致擁有更多可利用營養源的Citrobacter_freundii能在QX1樣本中占據主體地位。此外，QX2、QX3和CJ 3 組樣本中均檢測出一種腸桿菌Unclassified_f_Enterobacteriaceae，其存在可能與3 組金屬加工液中添加沒食子酸有關。沒食子酸不僅是一種植物型緩蝕劑，同時還可被用于合成潤滑油酯類基礎油，然而沒食子酸是Unclassified_f_Enterobacteriaceae生長起促進作用，造成該菌在QX2、QX3和CJ 3 組樣本中被檢測到[25-26]。JX 樣本的優勢細菌包括水叢毛單胞菌(Comamonas_aquatica)和炭疽芽胞桿菌(Bacillus_anthracis)，兩者總豐度占比達到97.05%。其中，叢毛單胞菌也是金屬加工液中的一種易檢出細菌[15]。該菌適宜在中、堿性環境(pH=7～8)中生存，可利用環境中的有機氮作為營養源發生硝化作用，如金屬加工液中使用的乳化劑三乙醇胺、胺型抗氧劑N,N’-二仲丁基對苯二胺等[27]。與此同時，炭疽芽胞桿菌(Bacillus_anthracis)作為一種由革蘭氏陽性孢子形成的細菌，能夠引發人畜共患急性傳染病炭疽。由于孢子對干燥、消毒劑等常規滅殺手段具有很強的抵抗力，可通過金屬加工液配制水源、空氣等途徑進入到加工體系中。炭疽芽胞桿菌繁殖體對周圍環境抵抗力與一般細菌相似，所以要求JX 金屬加工液樣本在使用過程中必須配套滅菌措施，同時提升操作人員的安全防護等級。相比于其他樣本，WF 優勢細菌組成最為復雜，Unclassified_g_Pseudomonas(59.38%)、馬尿氣球菌(Aerococcus_urinaeequi) (18.98%)、Bioreactor_metagenome_g_Pseudomonas(9.34%)和Unclassified_g_Klebsie lla(8.97%)等4 種細菌相對豐度超過5%。其中相對豐度最高的細菌Unclassified_g_Pseudomonas隸屬于假單胞菌屬，也是一種金屬加工液中易檢出細菌屬[15]。由于該類細菌具有以礦物油中烴類物質作為營養源的能力，所以導致其在有礦物油成分的WF 樣本中具有更強生存能力，從而成為該樣本下主體細菌[28]。然而，假單胞菌會將礦物油降解為其他細菌可利用的脂肪酸等中間體，所以WF 樣本中出現了共存細菌種類多，但豐度占比均不高的情況。

圖3 種水平下金屬加工液細菌群落組成Fig.3 Bacterial composition in metalworking fluid at species level

值得注意的是，在發現的14 種細菌中，除炭疽芽胞桿菌(Bacillus_anthracis)、馬尿氣球菌(Aerococcus_urinaeequi)和貝萊斯芽胞桿菌(Bacillus_velezensis)外(且這3 種細菌豐度占比有限)，其余11 種均為革蘭氏陰性菌，說明金屬加工液中檢出細菌以革蘭氏陰性菌為主。這主要是因為該6 組金屬加工液主要用于鉻、鎳和鐵等材料的加工過程，這些金屬元素對革蘭氏陰性菌的生長有促進作用[15]。

綜上所述，檢測出的14 種細菌均會縮短金屬加工液的使用壽命。Citrobacter_freundii、Unclassified_f_Enterobacteriaceae、Comamonas_aquatica等細菌會分解金屬加工液中油性劑、乳化劑等添加劑，從而破壞金屬加工液的穩定性。與此同時，Unclassified_f_Enter obacteriaceae、Unclassified_g_Pseudomonas會破壞基礎油結構，使其轉化為有機酸等中間體物質并被Aerococcus_urinaeequi、Bacillus_anthracis等細菌作為營養源被進一步降解。

2.4 金屬加工液真菌群落組成

6 組金屬加工液中只有QX2和JX 兩組樣本檢測出真菌，說明細菌比真菌更容易在金屬加工液中被發現。這是因為真菌適宜的pH 為4.5～5.0，而金屬加工液初始環境通常為中、堿性，所以真菌一般只出現在細菌污染嚴重的金屬加工液中，此時由于細菌繁殖過程中產生了各類有機酸，導致金屬加工液pH 明顯下降[29-30]。因此，QX2和JX 兩組樣本具有6 組樣本中最低的pH 值，且這兩組金屬加工液使用周期較長，會存在細菌污染濃度較高的情況，進而出現真菌繁殖現象。

門、綱、目、科4 個水平下的真菌組成如圖4 所示。在門水平下，子囊菌門(Ascomycota)，擔子菌門(Basidiomycota)，羅茲菌門(Rozellomycota) 和一種未知真菌(Unclassified_k_Fungi) 4 種真菌門被發現。隨著種類劃分精細度不斷提高，真菌多樣性逐步凸顯，尤其是QX2樣本，各水平下除未知真菌外其余真菌豐度差異小，種類多。而樣本JX 分別以糞殼菌綱(Sordariomycetes)、肉座菌目(Hypocreales)、赤殼菌科(Nectriaceae)作為綱、目和科3 個水平下的優勢真菌。

圖4 不同水平下金屬加工液真菌群落組成Fig.4 Fungal composition in metalworking fluid at different level

屬水平下金屬加工液真菌組成如圖5 所示，共有15 種真菌屬被檢測出。QX2樣本的優勢真菌屬包括未知真菌屬(Unclassified_k_Fungi)、羅茲菌屬(Unclass ified_p_Rozellomycota)、Saitozyma屬和Cutaneotrichosporon屬，相對豐度均在5%以上。而樣本JX 中只有鐮刀菌屬(Fusarium)和未知真菌屬(Unclassified_k_Fungi)豐度超過5%。

圖5 屬水平下金屬加工液真菌群落組成Fig.5 Fungal composition in metalworking fluid at genus level

種水平下真菌多樣性分析見圖6，兩組金屬加工液共攜帶了17 種真菌。盡管檢出真菌樣本數比檢出細菌樣本數少，但是后者有更多的種類。其中，QX2樣本14 種，特有真菌(其他樣本中未發現只在該樣本中檢測出的真菌種類)10 種；JX 樣本攜帶真菌7 種，特有真菌3 種。除未知真菌外，QX2和JX 樣本共有真菌3 種，分別為Saitozyma_sp，Rozellomycota_sp和Unclassified_g_Talaromyces，這說明真菌的生存并不受限于金屬加工液的原有成分。QX2樣本中除未知真菌外，Saitozyma_sp相對豐度占比最高，接近10%，而樣本JX 明顯以Fusarium_petroliphilum為優勢真菌。其中，Saitozyma_sp是一種酵母菌，Fusarium_petroliphilum是一種鐮刀菌，當金屬加工液濃度達到一定程度時，兩種真菌的菌絲會導致管道、過濾系統堵塞，同時通過空氣傳播，威脅人體健康。

圖6 種水平下金屬加工液真菌群落組成Fig.6 Fungal composition in metalworking fluid at species level

3 結 論

微生物污染會縮短金屬加工液使用壽命，威脅操作人員健康風險，因此，探索金屬加工液中微生物多樣性組成是十分必要的。實驗首先探究了從金屬加工液中分離微生物的可行方法，相較于破乳法和離心法，測菌片法能在提升微生物采集濃度的同時，保障后續DNA 抽提和PCR 擴增順利進行，實現微生物從金屬加工液中完美分離。

微生物多樣性鑒定確定了6 組金屬加工液中微生物的群落組成。細菌在所有樣本中被檢測出，而除QX2和JX 樣本外，剩余樣本未檢測出真菌，證明細菌比真菌更容易污染金屬加工液，真菌只存在于細菌污染嚴重的樣本中。實驗共檢測出細菌2 門、2 綱、5 目、6 科、10 屬 和14 種，而 真 菌 為4 門、8 綱、10 目、14 科、15 屬和17 種，說明真菌具有更豐富的種屬類別。

在種水平上，細菌中弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter_freundii)、Unclassified_g_Citrobacter、Unclassified_f_Enterobacteriaceae、水叢毛單胞菌屬(Comamonas_aquatica)和Unclassified_g_Pseudomonas相對豐度占比較高，作為優勢細菌存在于不同樣本中，且WF 樣本攜帶細菌種類最多，檢測出的細菌以革蘭氏陰性菌為主。金屬加工液有機組分會影響細菌類別，所有細菌通過不同途徑破壞金屬加工液的穩定性，縮短其使用壽命。QX2樣本具有最多的真菌種類，但在種水平，除未知真菌外，其他真菌豐度接近，而JX 樣本以Fusarium_petroliphilum為優勢真菌。