線紋海馬早期性腺發育的組織學形態分析

陳美玲，符宏高，吳銳瓊，張雪萍，楊 瀅，閆亞楠，岑 萬，鄭樂云，黃 鎮

(1.福建師范大學生命科學學院，福建 福州 350117； 2.福建省水產研究所，福建 廈門 361006)

海馬(Hippocampus)隸屬于有頜總綱硬骨魚綱海龍目海龍科[1]．由于獨特的外觀，其具有較高的觀賞價值，一直受到人們的青睞．它也是珍稀的海洋藥源動物，在中醫藥學中占有重要地位[2]．干海馬不僅作為重要的藥源在國內外進行貿易[3]，還是制備功能性食品的原料，具有較高的應用價值[4]．

目前國內最主要的海馬養殖品種有三斑海馬(Hippocampustrimaculatus)、膨腹海馬(Hippocampusabdominalis)和線紋海馬(Hippocampuserectus)等．線紋海馬原產于美洲地區、加勒比海等海域，因其具有生長速度快、繁殖和抗病能力強等特點被引進國內養殖[5]．經過十幾年的摸索，線紋海馬的人工育苗技術已經成熟[6]．但是，線紋海馬的生殖生物學還有諸多問題有待研究．Selman[7]探索了線紋海馬卵巢的基本結構，秦耿[8]在成年線紋海馬的性腺及生長發育方面進行了初步的研究，陳靈珍等[9]將線紋海馬精巢和卵巢皆分為6個時期，而目前線紋海馬的早期性腺發育還未見相關文獻報道．

原始生殖細胞(primordial germ cells，PGCs)是能夠產生雄性或雌性生殖細胞的早期細胞．在胚胎發育早期，其不斷增殖并遷移至生殖嵴，與生殖上皮一起形成原始性腺，之后性別發生分化，形成精巢和卵巢[10-11]．研究表明，魚類的PGCs遷移至生殖嵴有3種方式：鱘魚是由臟壁中胚層遷移至腸系膜，最終到達生殖嵴部位；青鏘通過體節由體壁中胚層不斷遷移至生殖嵴處；部分魚類利用血液循環系統遷移至生殖嵴[12-13]，如真骨魚類肝中和細鱗大馬哈魚胚腎小管中的性原細胞.

近年來，vasa、dazl、boule和dnd等效應基因已被廣泛用作生殖細胞標記物，以進一步研究魚類原始生殖細胞的起源和遷移[14]．其中，vasa標記后生動物生殖細胞的研究最深入．Duangkaew等[15]發現vasa不僅在條紋鰻鯰生殖細胞表達，而且在精子和卵黃素有很強的信號.Wu等[16]證明vasa在美洲鰣生殖細胞中特異性表達且對生殖細胞分裂必不可少．

因此本研究將以VASA抗體定位線紋海馬早期生殖嵴，之后通過組織學切片的技術解析卵巢和精巢開始分化和成熟的時間．本實驗結果不僅為海馬性腺發育生物學和性別決定機制的研究提供理論基礎，還將為線紋海馬的養殖育種提供理論指導．

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用的線紋海馬取自福建省水產研究所．

1.2 性腺組織切片制備與觀察

自線紋海馬出生后，每隔1 d進行取樣，每次取樣5只海馬．量取每只海馬體長后，在體視鏡下解剖，觀察性腺發育情況．隨后，整只海馬置于質量分數4%的多聚甲醛(PFA)溶液中，4 ℃條件下固定24 h．固定完成后，將樣品置于體積分數為30%、50%和70%的酒精中進行梯度脫水，之后實驗樣品可放在體積分數70%的酒精中保存于-20 ℃冰箱．包埋切片實驗開展前，將樣品從體積分數90%和100%的酒精中進行梯度脫水，充分脫水后的組織經二甲苯透明和石蠟包埋，制備成蠟塊，之后進行石蠟切片，切片厚度為8 μm．

1.3 蘇木精-伊紅染色(H.E染色)

將石蠟組織切片進行蘇木精-伊紅染色，中性樹脂封片．在顯微鏡下拍照，并用配套軟件進行圖片處理．

1.4 免疫熒光技術

將石蠟組織切片按文獻的方法[13]進行免疫熒光實驗，所用的抗體為線紋海馬VASA蛋白的抗體(本實驗室自制)，二抗為Alexa Flour 488(Thermo Fisher)．完成后的切片利用激光共聚焦顯微鏡掃描熒光信號．

2 結果

2.1 VASA抗體的熒光染色定位線紋海馬生殖嵴

為了觀察線紋海馬的早期生殖嵴發育，使用VASA抗體對出生后的線紋海馬進行免疫熒光染色．出生后的線紋海馬體長為12 mm，經過橫向切片，在體腔背部觀察到生殖嵴的組織，并且呈現VASA抗體的染色陽性信號(圖1a)．為進一步觀察生殖嵴的形態特征，對切片進行H.E染色(圖1b)，在切片中可見生殖嵴左右成對存在，PGCs被一層體細胞包圍，并且比周圍的體細胞大，細胞呈卵圓形或圓形，胞質較多，細胞核較大，但此時期還沒有出現精巢和卵巢分化．

(a)線紋海馬性腺(熒光圖)；(b)線紋海馬性腺(H.E染色)箭頭所指為原始生殖細胞，方框圈出結構為生殖嵴；PGC：原始生殖細胞；PN：胰臟

2.2 線紋海馬卵巢的發育和分化過程

為了追蹤線紋海馬卵巢的發育，對出生后不同體長的雌性線紋海馬進行橫切，通過H.E染色觀察卵巢的發育．當線紋海馬體長為17 mm時，原始性腺開始分化，由圓形變成梨形，在其內部邊緣處出現卵巢腔(卵巢腔的出現標志著性腺開始向卵巢分化)，同時卵巢腔附近還有成簇的細胞群(圖2a).

當線紋海馬體長為20 mm時，在性腺中觀察到初級卵母細胞(圖2b)．該時期的卵巢為Ⅱ期卵巢，其中有不同時相的卵母細胞，以Ⅰ、Ⅱ時相卵母細胞為主．

當線紋海馬體長為40 mm時，在體視鏡下可以分離出卵巢組織并進行石蠟切片和染色，發現卵巢中存在成熟的卵母細胞，其核仁消失，胞質中的卵黃顆粒逐漸融合(圖2c)．同時在卵巢組織外觀上橙色卵粒清晰可見(圖2d)，標志卵巢已經發育成熟．

(a)卵巢發育初期；(b)Ⅱ期卵巢；(c)Ⅴ期卵巢；(d)成熟卵巢 G：腸；KND：腎； M：肌肉組織； OC：卵巢腔；PO：初級卵母細胞；OV：卵巢；P：腹膜；SO：次級卵母細胞；標尺為50 μm

2.3 線紋海馬精巢發育和分化過程

為了追蹤線紋海馬精巢的發育，對出生后不同體長的雄性線紋海馬進行橫切，通過對切片進行H.E染色觀察精巢的發育．當線紋海馬體長為22 mm時，在切片中可以觀察到精小葉(圖3a)．精小葉的出現標志著在這個時期原始性腺開始向精巢分化，因此該時期為精巢的發育初期．

當線紋海馬體長為25 mm時，發育初期的精巢開始發育成為未成熟的精巢組織．從切片中可以看到，精巢外側的體細胞數量開始增多，精母細胞聚集成團并在精小囊中生長發育(圖3b)．

當線紋海馬體長為45 mm時，雄性海馬的育兒袋已經開始突起，精巢在形態外觀上已經可以識別．通過對精巢的切片和H.E染色，可發現在精巢的白膜內側的空腔中存在許多精子細胞和精子(圖3c)．同時在體視顯微鏡下可觀察到精巢，其形狀呈柱狀，表面覆有一層漿膜，內部則有乳白色物質(圖3d)

(a)精巢發育初期；(b) Ⅲ期精巢；(c)Ⅴ期精巢；(d)成熟精巢 N：脊索；KDN：腎；G：腸；SG：精原細胞；SL：精小葉；SC：謝爾托立氏細胞；PS：初級精母細胞；TA：白膜；SP：精子；ST：精子細胞；T：精巢；標尺為50 μm

通過觀察不同體長雌性和雄性的線紋海馬的性腺發育情況，總結不同體長下線紋海馬的性腺發育特征，如表1所示．

表1 線紋海馬不同體長的性腺發育特征

3 討論

前人對海馬精巢和卵巢的形態特征已有所研究．左鎮生等[18]對日本海馬(Hippocampusmohnikei)的卵巢發育做了初步的探究，并且較詳細地闡述了日本海馬卵巢的形態特征；Selman等[7]對線紋海馬的卵巢進行了探索，描述了線紋海馬卵巢的基本結構，對卵巢進行了初步的發育學分析；秦耿[8]對美國線紋海馬的性腺結構及生殖細胞的形成機制進行了研究； Novelli等[19]研究了吻海馬(Hippocampusreidi)卵巢的形成時期，并且描述了卵巢中不同時相的卵母細胞的形態特征；除此之外，Piras等[20]運用透射電鏡對長吻海馬(Hippocampusguttulatus)的成熟精子進行超微結構觀察．

生殖細胞方面的相關研究發現了許多有關生殖細胞的標記基因，其中包括vasa、dazl、boule和dnd[14]．VASA已被廣泛應用于魚類胚胎發生過程中PGCs遷移的種系標記，其中包括斑馬魚(Daniorerio)[21]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[22]、青鳉(Oryziaslatipes)[23]和美洲鰣(Alosasapidissima)[16]．本研究利用vasa在配子形成過程中僅在生殖細胞中表達的特點[24]，對PGCs進行定位，找到線紋海馬生殖嵴的位置，從而確定其性腺發育的位置．

本研究從組織學上對線紋海馬早期性腺發育規律進行了探索．結果表明，在線紋海馬胚胎發育早期，原始生殖細胞與體細胞分離，隨后遷移至生殖嵴中，形成原始性腺．原始性腺形成后，其周圍的體細胞進入增長期，進行大量的增殖與生長，但沒有明顯的精巢和卵巢的分化特征．經過一段時間的生長發育，原始性腺將在組織解剖學和細胞學上發生變化，出現明顯的精巢或卵巢的分化特征．

魚類性腺發育的相關研究通常把卵巢腔的形成作為魚類卵巢開始發育的標志，而把生精小管或精小葉的形成作為精巢開始發育的標志．本研究發現在線紋海馬體長為17 mm時，原始性腺分化，出現卵巢腔，隨后繼續發育形成成熟的卵巢．但在同一時期的線紋海馬中并沒有發現向著精巢分化的明顯特征．而在體長為22 mm的線紋海馬中發現了精小葉，因此在線紋海馬早期性腺發育的過程中，卵巢的發育早于精巢．據相關研究報道，在雌雄異體的硬骨魚中，多數是雌性的性腺發育早于雄性，例如布氏羅非魚(Tilapiabuttikoferi)、半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevisgunther)等[25-26]．

切片觀察發現在線紋海馬的卵巢中存在不同時相的卵母細胞，可見線紋海馬的卵巢發育屬于不同步成熟型．Novelli等[19]對吻海馬的研究也有相同的發現，這一發現與海馬一年多次產卵的習性相符．在雄性線紋海馬的切片中發現了精小葉，由此可以確定線紋海馬的精巢屬于小葉型．隨著線紋海馬的生長發育，精巢內出現空腔，當精巢處于成熟階段時，精子細胞和精子向空腔中心移動．

本實驗對線紋海馬早期性腺發育進行了初步探究，為線紋海馬性腺發育的后續研究奠定了基礎，并為海馬苗種的繁育提供理論指導．