不同克隆PD-L1抗體在非小細胞肺癌腫瘤組織中的表達差異性分析

李榮，雷先華，廖偉蓮，王冬梅（贛州市腫瘤醫院病理科，江西 贛州 341000）

在非小細胞肺癌（NSCLC）免疫治療中，化療藥物聯合抗PD-1/PD-L1抑制劑單藥的治療方案，其療效較為滿意［1-2］。免疫治療NSCLC方案中PD-L1療效預測標志物應用較廣，因個體差異，為篩選出合適的抗體治療方案，需對腫瘤標本施行PD-L1檢測。而免疫組織化學（IHC）法是利用抗原抗體結合的原理，使被熒光色素標記的抗體與細胞或組織的特異抗原結合顯色，進而確定被檢測細胞或組織的免疫學特性。由于不同克隆PD-L1抗體之間的檢測結果缺乏一致性的觀察數據，導致在實際工作中抗體選擇上的效率不高［3］?；诖?，為規范PD-L1-IHC檢測標準，提高工作效率，我們將2019年全年診治的非小細胞癌的100例組織蠟塊，采用4種克隆抗體進行PD-L1檢測，分析抗體表達的一致性。提高病理診斷的精準性，以期為臨床用藥提供證據。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2019年1月至2020年1月我院收治的非小細胞肺癌的腫瘤組織蠟塊100例，選取符合條件的100例入組，納入條件：（1）切片中有足夠腫瘤細胞數量，不少于100個（2）細胞形態保存完好，壞死少［4］。

1.2 方法及路線抗體克隆號及生產公司：22C3（Dako公司），SP263（Roche公司），ZR3（基因科技（上海）股份有限公司），MXR003（福州邁新生物技術開發有限公司），免疫組化染色比對試驗腫瘤組織蠟塊切片，用免疫組化防脫玻片撈片6張，經防脫烤片、脫蠟水化等前期處理后進入PD-L1免疫組化實驗，克隆號22C3、SP263等商業試劑盒采用推薦的VENTANA檢測平臺和檢測流程，國內公司克隆號為ZR3、MXR003等抗體，在實驗室同一平臺自建檢測方法染色［5］。

1.3 結果判讀、數據分析（1）采取半定量評分方式來計算著色比例。TPS值判斷標準：著色腫瘤細胞/總腫瘤細胞×100%。TPS（ZR3PD-L1≥1%、22C3-PD-L1≥25%、SP263PD-L1≥25%、MXR003≥25%）。（2）公用cut-off值的篩選：選取cut-off值≥25%、≥20%、≥15%、≥10%、≥5%、≥1%為備選值，對比找到SP263、22C3、ZR3、MXR003抗體自身cut-off值；以及抗體間一致率最高的cut-off值。（3）互換（SP263、22C3、ZR3、MXR003）4種抗體的cut-off值抗體，分別分析一致率［6］。

1.4 統計學處理數據采用SPSS 25.0統計學軟件進行處理。分析SP263、22C3、ZR3、MXR003的PDL1-TPS差異度。比較SP263、22C3、ZR3、MXR0034者之間的相關性、一致性，用Kappa值表示；判讀SP263、22C3、ZR3、MXR003的cut-off值，分析4種抗體兩次染色結果。

2 結果

2.1 SP263、22C3、ZR3、MXR003克隆抗體PD-L1表達染色結果分析SP263、22C3、ZR3、MXR003抗體取得了不同強度的染色結果，其中ZR3、MXR003、22C3染色PD-L1陽性結果，均高于SP263染色PDL1陽性的結果。見圖1。

圖1 4種克隆體進行PD-L1染色結果IHC中倍放大；A：22C3腫瘤細胞膜弱陽性；B：SP263腫瘤細胞陰性；C：ZR3腫瘤細胞膜中等強度陽性；D：MXR003腫瘤細胞膜中等強度陽性

2.2 對比分析SP263、22C3、ZR3、MXR003克隆抗體一致性分析四者之間對比結果顯示，ZR3/MXR003與22C3的相似度較高、相關性較好（Kappa=0.732，P＜0.01）；SP263跟ZR3/MXR003（Kappa=0.492，P＜0.01）和22C3（Kappa=0.603，P＜0.01）間相關性差異較大。見圖2。

圖2 抗體的檢測相關性/差異性對比曲線圖

2.3 SP263、ZR3、22C3、MXR003克隆抗體的公共outoff值分析PD-L1染色陽性一致率100%時，SP263、22C3、ZR3、MXR003抗體的cut-off值≥5%。因此，5%可為SP263、22C3、ZR3、MXR003的公用判讀cut-off值。

2.4 互換（SP263、22C3、ZR3、MXR003）out-off值后的一致率分析使用ZR3cut-off值對ZR3（TPS≥和ZR3cut-off值判讀，一致率均為90%；由于研究樣本蠟塊的問題，22C3與SP263（TPS≥25%）互換cut- off值無差異。見表1。

表1 4種抗體互換out-off值后的一致率

3 討論

循證醫學證據說明，不同藥物下NSCLC免疫治療的患者，其腫瘤細胞PD-L1表達也略有差異［7-10］。廠商在研發或生產抗體時，為了滿足免疫精準治療的需求，選擇不同的細胞株的標準可能會考慮抗體的靈敏度、特異性、以及專利差異［11］?？寺】贵w不同，其判讀結果、cut-off值均有所不同，說明不同的抗體在檢測同一樣本時具有不同程度的差異［12］。有學者在研究中，曾分別將Roche-SP263、Dako-22C3進行染色，用50%、1%這兩個cut-off值判讀PD-L1表達，結果得出，判讀結果差異性較大，出現39.43%（28/71）判讀結果具有差異。判讀結果的差異性可能會導致適合免疫療法的一部分患者失去治療機會［13］。本次研究收集100例2019年1月至2020年1日非小細胞肺癌的腫瘤組織蠟塊。檢測4種克隆抗體腫瘤細胞中PD-L1的表達，對比各自的染色結果、互換cut-off值、取公共cut-off值、判讀染色結果、計算TPS，分析其相關性。研究結果顯示，ZR3、22C3、MXR003的陽性結果較SP263要高。ZR3、MXR003、22C3間一致性較高（P＜0.01）；SP263與ZR3（P＜0.01）和22C3/MXR003（P＜0.01）的相關性較低，公共cutoff值為5%。22C3和ZR3、MXR003抗體間PD-L1表達在互換公共值后，其一致率高達96%。

根據本次試驗，當cut-off值≥5%，SP263、22C3、ZR3、MXR003抗體總一致性為96%左右，一致性較高，但仍需更多的樣本研究來支持該結論。為了使判讀結果具有一定的真實性和可靠性，抗體的判讀標準需通過大量的臨床試驗，獲取更多的循證醫學證據支持。為避免影響患者用藥篩查，并不支持臨床實際找那個使用這一數值替代原有的cut-off值［14-15］。

盡管目前已經有標準的免疫組化法在實際中應用，但仍舊在實際操作時，具有一定的局限性，導致PD-L1IHC檢測的實際應用率較低［16］。因此，為增加PD-L1IHC檢測的可行性，增加不同抗體PD-L1表達一致性，可以在不同平臺間確定一個方標準?；诖?，有學者進行一項研究，得出以下結論，對500例標本行SP263、22C3、28-8染色后，觀察三者的染色模式類似；各抗體PD-L1染色一致性較高。通過對比上述不同抗體蠟塊PD-L1的表達結果，研究說明每一種抗體檢測腫瘤細胞的PD-L1都能取得理想的效果。由于樣本量以及組織蠟塊的限制，試驗結果真實性和可靠性還有一定的欠缺，未來仍需更多的數據支持。

綜上所述，科室利用全自動免疫組化染色平臺，各克隆號抗體免疫組化染色結果與免疫抑制劑療效相關性獲得臨床認同。在規范檢測平臺、檢測流程等條件情況下，ZR3與MXR003的PD-L1一抗試劑，在切片上顯色定位準確（在細胞膜上）、信號清晰、對比度良好，與克隆號22C3抗體有較高的一致性，基因公司克隆號ZR3和福州邁新公司克隆號MXR003的PD-L1抗體，其檢測結果在一定程度上與Dako公司22C3的PD-L1抗體可替代互用。