致病性大腸埃希菌耐藥性研究進展

任晨吟 付益修

1.杭州醫學院臨床醫學院，浙江杭州 310053；2.杭州醫學院基礎醫學與法醫學院，浙江杭州 310053

抗生素耐藥性的演變是一個自然過程，是病原微生物與環境相互作用的預期結果。2017 年世界衛生組織公布了首份亟需新型抗生素治療的重點病原體清單，其中大腸埃希菌排名第三位。大腸埃希菌作為臨床分離株中最常見的細菌，可以分為共生菌和致病菌，其中致病菌又可以分為腸道致病大腸埃希菌（entero pathogenicEscherichia coli，DPEC）和腸道外致病大腸埃希菌（extraintestinal pathogenicEscherichia coli，Ex-PEC）[1]。DPEC 大多為機會致病菌，在免疫力低下人群中可引起嚴重后果。另外，近年來ExPEC 感染率呈上升趨勢[2]，在臨床上引起尿路、腹腔、肺部、皮膚和軟組織感染，菌血癥，新生兒腦膜炎等病癥[3]。耐藥性大腸埃希菌在臨床上的普遍性及其引起的嚴重后果應當引起重視。研究發現不同感染性疾病中分離的大腸埃希菌抗生素耐藥性的結果也不同。為此，本文對臨床常見的大腸埃希菌耐藥現狀、耐藥機制及治療方法等幾個方面的研究進行綜述。

1 致病性大腸埃希菌抗生素耐藥現狀

臨床上常見的致病性大腸埃希菌分離株有尿路致病性大腸埃希菌（urinary tract pathogenicEscherichia coli，UPEC）、侵入性大腸埃希菌（invasiveEscherichia coli，EIEC）、產志賀毒素大腸埃希菌（shiga toxin-producingEscherichia coli，STEC）、彌散黏附性大腸埃希菌（diffuse adhesiveEscherichia coli，DAEC）、腸集聚性大腸埃希菌[1]。UPEC 作為臨床上常見的ExPEC，可從正常腸道菌群轉移至泌尿道并持續表達各種毒力因子，因而引起泌尿系統疾病。近年來，UPEC 抗生素耐藥現狀嚴峻，特別是第三代頭孢菌素和氟喹諾酮類抗生素耐藥性顯著增加[4]。2018 年，Raeispour等[5]發現從伊朗德黑蘭尿路感染患者中分離出的多數大腸埃希菌對頭孢菌素類抗生素產生耐藥，其中對頭孢吡肟耐藥率已經高達100%。巴斯德研究所Shahbazi等[6]分離的UPEC 對氨芐西林耐藥率達78.3%。2020 年，Sun等[7]發現UPEC 對氨芐西林耐藥率高達100%，四環素耐藥率達96.4%，頭孢唑啉、頭孢噻肟等抗生素耐藥率大于92.0%，上述研究表明，UPEC 的耐藥率呈逐年上升趨勢，耐藥抗生素種類不斷增加。此外，EIEC感染性強，可通過血腦屏障侵入腦脊液，從而產生嚴重后果，臨床多見膿毒菌血癥和新生兒腦膜炎等疾病。Begier等[8]分析了美國2009—2016 年入院就診患者分離出的EIEC 數據，表明人群對EIEC 的感染率不斷上升，并發現EIEC 對超廣譜頭孢菌素的耐藥性呈增加趨勢。STEC 是一種腸道病原體，可導致人患多種胃腸道疾病。Rubab等[9]對取自人類的40 株菌株進行了圓盤擴散法檢測，結果顯示74.5%的大腸埃希菌分離株對50%的測試抗生素具有耐藥性。所有菌株都對甲氧西林、青霉素、紅霉素、萬古霉素耐藥，其中98%的菌株對慶大霉素耐藥。在發展中國家，腹瀉是尤為嚴重的胃腸道健康問題。研究表明，DAEC 的感染是導致腹瀉的重要原因。Javadi等[10]調查伊朗南部某醫院DAEC 的流行率和抗生素耐藥性，在66.9%的糞便樣本中檢測出大腸埃希菌，并對腹瀉性DAEC 分離株進行了11 種抗生素的藥敏試驗，其中所測DAEC 對氨芐青霉素全部耐藥，92.8%的DAEC 株對亞胺培南敏感?？股氐牟灰幏妒褂?，不僅使同一種致病性大腸埃希菌對多種抗生素耐藥，又使耐藥的致病性大腸埃希菌種類增加。致病性大腸埃希菌的耐藥形勢嚴重。

2 致病性大腸埃希菌的耐藥機制

2.1 移動遺傳元件

移動遺傳元件包括質粒、整合子和轉座子。多重耐藥性大腸埃希菌菌株的流行率不斷增長，移動遺傳元件（mobile genetic element，MGE）中的抗生素抗性基因（antibiotic resistance gene，ARG）的出現是重要原因之一[11]。質粒介導的抗生素抗性基因的持續進化和替代導致了新酶的出現和耐藥性的水平傳播[12]。目前，大腸埃希菌中發現最多的是超廣譜β-內酰胺酶（extended spectrum β-Lactamase，ESBLs）。Asadi Karam等[13]對β-內酰胺類抗生素耐藥的尿路致病性大腸埃希菌基因序列進行分析，發現其耐藥的主要機制是bla-TEM、bla-SHV 和bla-CTX-M 基因編碼β-內酰胺酶，其中TEM-1、TEM-2、SHV-1 基因占主導作用；另外，由質粒編碼的五肽重復序列蛋白Qnr 可保護DNA 旋轉酶和拓撲異構酶免受喹諾酮類藥物破壞的耐藥機制也已引起重視。整合子由整合酶基因（intl）、相關重組位點（atll）、基因盒（GCs）和啟動子（Pc）組成[12]。整合子多功能結構使其可以捕獲，整合，轉錄外源基因，最終導致水平基因的轉移，從而介導細菌耐藥性的形成[11]。根據整合酶基因進行分類，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類整合子與細菌耐藥性有關，其中Ⅰ類整合子可捕獲大量來自抗生素抗性基因庫的基因盒，成為臨床最常見的整合子，Ⅰ類整合子在UPEC 分離株中流行率達47%[14]。另外，轉座子可借助細菌染色體、噬菌體或質粒復制插入或轉移ARG[15]。

2.2 靶點突變及修飾

細菌表面有各種抗菌藥物的結合位點，當這些結合位點的靶蛋白發生突變或經一些酶修飾后使抗菌藥物無法識別而失活，從而產生耐藥性。青霉素結合蛋白（Penicillin binding protein，PBPs）結構改變或合成量增多都可以導致細菌對β 內酰胺類抗生素產生耐藥性[16]；DNA 促旋酶GyrA 基因突變導致Ser83 位點的氨基酸改變，酶和藥物的親和力下降，從而導致細菌對喹諾酮類抗生素產生耐藥性；16sRNA 甲基化酶修飾30S 核糖體亞基導致氨基苷類抗生素無法與核糖體結合抑制蛋白質的合成達到殺菌效果從而使細菌產生耐藥性[7]。由此可見，抗生素靶點的結構及數量變化都可以引起抗生素耐藥性。

2.3 滅活酶

目前研究較多的抗生素滅活酶主要包括β-內酰胺酶和氨基苷類的鈍化酶。β-內酰胺酶是耐β-內酰胺類抗生素細菌產生的能使藥物結構中的β-內酰胺環水解從而失去活性的一類酶。從1940 年發現至今已達200 多種，根據BJM 分類法以酶作用底物是否相同、是否被酶抑制劑抑制分為4 大類11 小類。目前ESBLs 備受關注，這類酶能夠水解頭孢菌素如頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢噻肟[17]。Asadi Karam等[13]發現產ESBLs 尿路致病性大腸埃希菌分離株對β-內酰胺類、氨基苷類和喹諾酮類的耐藥率都很高。另外，細菌產生的鈍化酶可以滅活氨基苷類抗生素，鈍化酶包括氨基糖苷類乙酰轉移酶、氨基糖苷類核苷轉移酶和氨基糖苷類磷酸轉移酶，它們分別將乙?；?、腺苷、磷酸連接到氨基苷類抗生素的氨基或羥基上，使藥物不能與核糖體結合而失效[7]。

致病大腸埃希菌的耐藥機制復雜，除上述抗性基因的出現、抗生素靶點的變化及滅活酶等機制以外，外排泵系統、細胞膜通透性的改變及生物膜都可使大腸埃希菌產生耐藥性。AcrAB-TolC RND 外排泵介導大腸埃希菌對β-內酰胺類、四環素類、大環內酯類以及氟喹諾酮類抗生素的天然耐藥性[18]。生物膜（biofilm，BF）是細菌附著在機體體腔或生物材料表面并分泌多糖蛋白復合物將自身包裹的黏液層[15,19]。生物膜既可以形成物理屏障產生抗生素耐藥，又通過協同作用誘導基因產生特異的表型影響抗生素活性。研究表明，產生生物膜的大腸埃希菌的抗生素耐藥性明顯高于不產生生物膜的大腸埃希菌[20]。

3 致病性大腸埃希菌耐藥菌株治療方法

致病性大腸埃希菌耐藥菌株的出現給感染性疾病的預防治療提出挑戰。為緩解致病性大腸埃希菌的耐藥現狀，應遵循抗菌藥物臨床應用指導原則[21]，此外，也應拓展新的非抗生素治療方式。

3.1 CRISPR-Cas9 系統

CRISPR-Cas9 系統利用噬菌體有效遞送編碼sgRNA 和Cas9 的基因，其中sgRNA 與靶基因序列互補，可選擇性地定位于靶基因上，結合Cas9 蛋白的核酸內切酶活性，當靶基因位于耐藥質粒上，Cas9 蛋白的切割會導致質粒丟失，使耐藥菌再敏化；當靶基因位于細菌基因組上時，Cas9 蛋白的切割會導致雙鏈斷裂，直接使耐藥菌死亡[22]。目前，CRISPR-Cas9 系統已在細菌耐藥領域取得較大進展。Kim等[23]應用CRISPR-Cas9 系統殺死產ESBLs 大腸埃希菌。Hao等[24]基于CRISPR-Cas9 系統，靶向耐碳青霉烯酶大腸埃希菌中耐藥基因或質粒，使其恢復對碳青霉烯類抗生素的敏感性。

3.2 中藥

研究表明，中藥可以產生抗菌作用且不易產生耐藥性或降低已有的耐藥性[25]。李海華等[26]對45 味中藥進行了多重耐藥大腸埃希菌的抑菌效果檢測，發現大腸埃希菌對博落回、黃連、五味子等十味中藥高度敏感。在某單味中藥存有抗菌作用的基礎上，與其他中藥制備成方劑效果更佳，寧官保等[27]發現黃連若與其他中藥制備成三黃湯和黃連解毒湯，對大腸埃希菌耐藥性消除率高于單味中藥，并可以抑制ESBLs 的活性，從而降低致病性大腸埃希菌的耐藥性[28]。此外，中藥復方清熱顆?？稍黾涌椎鞍譕mpF 改變細胞膜通透性[29]，川貝母可抑制多重耐藥大腸埃希菌生成生物膜[30]，兩者在聯合抗生素使用的情況下，可使抗生素充分發揮效能，降低致病性大腸埃希菌的耐藥性。

除上述CRISPR-Cas 系統、中藥等新的非抗生素療法以外，噬菌體-抗生素的聯合療法、光動力療法也都具有良好的應用前景[31]。Moradpour等[32]對耐藥大腸埃希菌0157 采用了噬菌體-抗生素聯合療法，兩者協同抑制大腸埃希菌耐藥性的產生。另外，有研究表明，光動力療法通過破壞抗生素滅活酶、外排泵系統或者改變抗生素靶點、ARG，還原大腸埃希菌對抗生素的敏感性[33]。Feng等[34]首次證明，使用抗菌光動力療法可以防止碳青霉烯類抗生素被碳青霉烯酶降解，從而實現產生碳青霉烯酶的耐藥菌對碳青霉烯類抗生素再敏感化。

4 討論

致病性大腸埃希菌作為臨床上常見的致病菌，可引起多種組織器官的感染。致病性大腸埃希菌抗生素耐藥狀況日益嚴重，耐藥致病性大腸埃希菌種類增加，并出現一種致病性大腸埃希菌對多種抗生素耐藥的現狀。致病性大腸埃希菌耐藥機制復雜，移動遺傳元件、滅活酶、藥物靶點的突變或修飾均可介導致病性大腸埃希菌耐藥的發生，但耐藥機制的新研究也為新藥研發提供了方向。在后抗生素時代，新型抗生素的研發速度緩慢，耐藥致病性大腸埃希菌的出現給臨床治療提供了新的挑戰，隨著中藥學、分子生物學的發展及多學科交叉融合，研究人員提出了許多新型的抗菌方法，CRISPR-Cas 系統為耐藥致病性大腸埃希菌抗生素再敏感化提供了新機會，中藥在耐藥致病性大腸埃希菌的治療中表現出良好的作用，這些新方法新技術為治療耐藥致病性大腸埃希菌感染性疾病指明新方向，但將這些新方法運用到臨床，還需要更多的研究及努力。