lncRNA-UCA1靶向miR-204調控PI3K/Akt信號通路抑制癲癇模型海馬神經元凋亡的作用機制

呂關健 潘俊超 崔靈運 代英杰

癲癇病是一種因突發性大腦功能異常導致的神經內科疾病，俗稱“羊癲風”、“羊角風”，該病發病率較高，頻繁發作會導致腦損傷甚至神經精神障礙[1,2]。目前臨床上多采用藥物治療控制癲癇病的發作，但對于癲癇持續狀態所致的海馬神經元凋亡尚無有效治療方法。有研究表明，長鏈非編碼RNA(lncRNA)-尿路上皮癌胚抗原1(UCA1)調控多種疾病的發生和發展，微小核糖核酸-204(miR-204)參與了疾病的發展進程。沉默lncRNA UCA1調控膠質瘤細胞放射敏感性[3]。lncRNA-UCA1在慢性乙型病毒性肝炎患者、肺癌患者血清中表達量與疾病狀態關系密切[4]。miR-204影響癲癇神經元中腦源性神經營養因子(BDNF)/活酪氨酸激酶受體B(TrkB)信號通路[5]。miR-204-5p通過靶基因小窩蛋白1(Cav-1)調節大鼠血管平滑肌細胞增殖[6]。但lncRNA UCA1在癲癇病海馬神經元凋亡中的作用，以及lncRNA UCA1對miR-204-5p的表達是否有影響尚不清楚。本實驗主要研究lncRNA-UCA1通過靶向miR-204調控PI3K/Akt信號通路抑制癲癇模型海馬神經元凋亡的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑和儀器

小鼠正常海馬神經元細胞和小鼠癲癇模型海馬神經元細胞均購自中科院上海細胞庫(編號CBP90867、CPB60992)；Dulbecco改良Eagle培養基(DMEM)購自美國Hyclone公司(10-014-CV)；胎牛血清購自美國Invitrogen公司(A15-101)；qRT-PCR試劑盒購自大連寶生物科技有限公司(E0107S)；Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)試劑盒購自上海煊翎生物科技有限公司(CA1020)；二辛可寧酸(BCA)試劑購自中國碧云天生物技術研究所(PD-BCA-500)；兔抗鼠B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關X(Bax)、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶(p-Akt)一抗、山羊抗兔Bcl-2、Bax、p-PI3K、p-Akt二抗均購自美國BD公司(191001、191214、190507、200322、200217、191104、200603、201102)。5031型酶標儀購自南京華東有限公司，FACSAria Ⅱ型流式細胞儀購自美國BD公司，7300型PCR儀購自美國ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和分組： 將癲癇模型海馬神經元細胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養基于37℃、含5% CO2培養箱內培養，待細胞生長至80%-90%融合度時，用胰蛋白酶消化進行傳代。待細胞生長至對數生長期后，更換為不含胎牛血清的DMEM培養基，將細胞分為si-NC組(轉染si-NC)、si-UCA1組(轉染si-UCA1)、miR-NC組(轉染miR-NC)、miR-204組(轉染miR-204 mimics)、si-UCA1+anti-miR-NC組(si-UCA1和anti-miR-NC共轉染)、si-UCA1+anti-miR-204組(si-UCA1和anti-miR-204共轉染)，轉染過程按照Lipofectamine 2000說明書進行操作。另取未轉染小鼠癲癇模型海馬神經元細胞、小鼠正常海馬神經元細胞分別記為癲癇模型組和正常對照組。將上述細胞在37℃、含5% CO2培養箱內培養48 h后進行后續實驗。

1.2.2 qRT-PCR 檢測細胞中UCA1和miR-204表達：分別取各組海馬神經元細胞，通過TRIzol法提取細胞總RNA，利用逆轉率試劑盒將RNA逆轉錄合成cDNA。嚴格按照RT-qPCR試劑盒說明書的操作步驟進行擴增。以β-actin為內參基因，按照2-ΔΔCt法計算目標基因相對表達量。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡情況： 取1×106個細胞/孔接種到96孔板內，培養48h。加入1ml結合緩沖液于流式管內重懸細胞，分別加入5μl的Annexin V-FITC溶液和PI溶液，避光條件下孵育15min后，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.4 雙熒光素酶報告實驗驗證UCA1和miR-204的靶向關系： 通過LncBase Predicted v.2數據庫預測UCA1和miR-204的靶向關系。將雙熒光素酶報告載體WT-UCA1、MUT-UCA1分別與miR-NC、miR-204共轉染至癲癇模型海馬神經元細胞，常規培養48h后，檢測細胞的熒光素酶活性。

1.2.5 Western Blotting檢測細胞相關蛋白表達：分別取各組海馬神經元細胞，提取細胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。將蛋白樣液以20μg/孔上樣于凝膠中進行電泳分離，轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜后，室溫封閉1h，加入一抗(稀釋比1∶1 000)4℃孵育過夜，加入二抗(稀釋比1∶2 000)室溫孵育2h，以β-actin為內參蛋白，以目標蛋白與內參蛋白條帶灰度值的比值作為目標蛋白的相對表達量。

1.2.6 酶標儀法檢測Caspase3活性： 收集各組海馬神經元細胞后用0.25%胰蛋白酶消化，4℃條件下3 000r/min轉速離心5min，預冷PBS洗滌后加入含蛋白酶抑制的放射免疫沉淀法(RIPA)裂解緩沖液，于冰上裂解30min，BCA法進行蛋白定量，取200μg蛋白加入反應緩沖液與底物混勻后室溫避光孵育1h，于405nm波長處檢測吸光度值。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 UCA1和miR-204在癲癇模型海馬神經元細胞中的表達

與正常對照組比較，癲癇模型組重海馬神經元細胞UCA1表達量顯著升高，miR-204表達量顯著降低(P<0.01)。見表1。

表1 UCA1和miR-204在癲癇模型海馬神經元細胞中的表達

2.2 抑制UCA1表達對癲癇模型海馬神經元細胞凋亡的影響

各組海馬神經元細胞凋亡率及凋亡相關蛋白表達差異均有統計學意義(P<0.01)。與正常對照組比較，si-NC組海馬神經元細胞凋亡率和Bax蛋白、Caspase3活性升高，Bcl-2蛋白表達降低；與si-NC組比較，si-UCA1組海馬神經元細胞凋亡率和Bax蛋白、Caspase3活性顯著升高，Bcl-2蛋白表達顯著降低(P<0.01)。見圖1、圖2和表2。

圖1 各組海馬神經元細胞凋亡(流式細胞術)

2.3 UCA1和miR-204的靶向關系驗證

LncBase Predicted v.2數據庫預測顯示，UCA1與miR-204存在結合位點，見圖3。實驗結果顯示，在轉染WT-UCA1細胞中，miR-204組細胞熒光素酶活性顯著低于miR-NC組細胞(P<0.01)，在轉染MUT-UCA1細胞中，miR-204組和miR-NC組熒光素酶活性無顯著變化(P>0.05)。見表3。

表2 抑制UCA1表達對癲癇模型海馬神經元細胞凋亡的影響

圖2 各組海馬神經元細胞凋亡相關蛋白表達(Western Blotting)

圖3 UCA1和miR-204的靶向結合關系

表3 雙熒光素酶實驗

2.4 干擾miR-204可逆轉抑制UCA1對癲癇模型海馬神經元細胞凋亡的影響

各組細胞凋亡率及凋亡相關蛋白表達水平差異均有統計學意義(P<0.01)。與正常對照組比較，si-UCA1+anti-miR-NC組細胞凋亡率及Bax蛋白、Caspase3活性均升高，Bcl-2蛋白表達降低；與si-UCA1+anti-miR-NC組比較，si-UCA1+anti-miR-204組細胞凋亡率及Bax蛋白、Caspase3活性顯著降低，Bcl-2蛋白表達顯著升高，差異均有統計學意義(P<0.01)。見圖4、圖5和表4。

圖4 各組海馬神經元細胞凋亡 (流式細胞術)

表4 干擾miR-204可逆轉抑制UCA1對癲癇模型海馬神經元細胞凋亡的影響

圖5 各組海馬神經元細胞凋亡相關蛋白表達(Western Blotting)

2.5 信號通路相關蛋白表達

各組p-PI3K蛋白、p-Akt蛋白表達水平差異均有統計學意義(P<0.01)。與si-NC組比較，si-UCA1組細胞p-PI3K、p-Akt蛋白表達顯著降低(t=20.871、20.871，P<0.01)。與si-UCA1+anti-miR-NC組比較，si-UCA1+anti-miR-204組細胞p-PI3K、p-Akt蛋白表達顯著升高(t=18.341、18.276，P<0.01)。見圖6、表5。

圖6 PI3K/Akt信號通路相關蛋白表達(Western Blotting)

表5 PI3K/Akt信號通路相關蛋白表達

3 討 論

癲癇臨床表現為全身強直-陣攣發作，如四肢抽搐，口吐涎沫，意識喪失，大小便失禁等，部分患者出現突然的、短暫的意識障礙，稱小發作[7,8]。目前關于癲癇發病機制尚不清楚，尋找其發生機制是當前醫學界研究的熱點。

lncRNA是長鏈非編碼RNA，與中樞神經系統疾病密切相關，包括癲癇[9]。有研究顯示，在小兒癲癇患者中有大量lncRNA被相繼報道，如lncRNA H19、lncRNA Peg13等[10]。lncRNA TUG1在小兒癲癇患者血清中高表達，可通過調控miR-199a-3p增強癲癇發作[11]。小兒癲癇患者血清中lncRNA ZFAS1表達水平增加，沉默lncRNA ZFAS1可抑制脂多糖誘導的神經元細胞凋亡和炎癥反應[12]。lncRNA-UCA1是應用較為廣泛的一種lncRNA，可在胚胎發育早期表達，有研究發現，lncRNA-UCA1在癲癇患兒血清中水平高于正常對照者[13]，lncRNA-UCA1通過調節轉化生長因子-β1(TGF-β1)保護對海人酸誘導小鼠癲癇[14]。本實驗發現，在小鼠癲癇模型海馬神經元細胞組中UCA1表達量顯著升高，抑制UCA1表達可增高細胞凋亡率、Bax蛋白表達，降低Bcl-2蛋白水平，這與相關研究結果[14]相似，表明lncRNA-UCA1有望成小兒癲癇的標記物。

通過LncBase Predicted v.2預測發現，UCA1與miR-204相互結合，雙熒光素酶報告實驗顯示，過表達miR-204可降低WT-UCA1熒光素酶活性，對MUT-UCA1熒光素酶活性無影響，表明UCA1可靶向調控miR-204。miR-204在癌癥、疾病中差異表達[15，16]，有研究顯示miR-204可通過調控尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(Nox4)參與阿爾茨海默病小鼠模型的發現和發展[17]。還有研究結果顯示，加味柴胡疏肝湯可通過調控miR-204/AKT/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/70 kDa核糖體蛋白S6激酶(P70S6K)通路發揮保護癲癇小鼠海馬神經元的作用[18]。本實驗研究表明，在癲癇模型海馬神經元細胞組中miR-204表達量降低，干擾miR-204表達可減弱UCA1表達對癲癇模型海馬神經元細胞凋亡的作用。PI3K/Akt信號通路是細胞內重要信號轉導通路，PI3K/Akt通路被激活后可介導調控癲癇發展[19]。本實驗研究顯示，抑制UCA1表達可降低p-PI3K、p-Akt蛋白表達，干擾miR-204表達可減弱UCA1表達對p-PI3K、p-Akt蛋白表達的抑制作用，表明lncRNA-UCA1可通過調控miR-204/PI3K/Akt信號通路影響癲癇發展。

綜上所述，UCA1通過靶向上調miR-204，并抑制PI3K/Akt信號通路降低癲癇模型海馬神經元凋亡。關于PI3K/Akt信號通路對癲癇模型海馬神經元影響的具體作用機制，仍需后續進行進一步的探究。

?

本文第一作者簡介：

呂關健(1983-)，男，漢族，主治醫師，研究方向：腦血管病、癲癇、認知功能障礙、帕金森病及睡眠障礙等