面向骨科植入物的仿生多孔結構設計與制造方法

焦 晨 晁 龍 朱 磊 沈理達 梁繪昕 戴 寧 王長江 孫 駿

1.南京航空航天大學機電學院，南京，210016

2.南京大學醫學院附屬鼓樓醫院，南京，210008

3.薩塞克斯大學，布萊頓，英國，BN1 9RH

4.江蘇省藥品不良反應監測中心，南京，210002

0 引言

目前，骨缺損、粉碎性骨折等骨科疾病是骨科領域治療研究的一個重點與難點，而采用外部植入體代替宿主骨是應對大面積骨缺損的有效途徑。以往的致密植入體由于彈性模量過高而存在“應力屏蔽”問題[1-2]，即應力不能從植入體充分轉移到骨，使植入體周圍骨細胞難以得到足夠的應力刺激而死亡。為解決傳統致密植入體彈性模量過大帶來的問題，人們將多孔結構引入到植入體[3-4]，通過調整孔隙率等參數，將支架彈性模量降低至人體骨骼水平，實現植入體與人體骨的匹配。使用多孔結構骨支架時，支架與人體骨組織的接觸面積更大，能更好地引導骨細胞長入，在生物層面上實現固定結合[5]。目前，具有多孔結構的植入體可采用增材制造技術生產，其中，激光選區熔化[6-7](selective laser melting，SLM)和光固化成形[8-9](stereo lithography apparatus，SLA)是組織工程領域最常見的方法。采用增材制造技術制備的多孔支架具有強度高、質量小、耐腐蝕性好、彈性模量適中、生物相容性好等優點，在組織工程領域具有良好的應用前景[10-14]。

仿天然骨結構的設計方法正逐漸成為研究熱點，研究者從形態、特征參數、力學性能和生物性能等多個方面綜合評估骨支架的設計方案。目前，仿人體骨骼的設計主要通過基于圖像的反求建模方法、數學建模方法等[15-19]?；赩oronoi細分的數學建模方法在構造多孔過程中表現出良好的性能，可構造出天然不規則多孔材料的近似模型，如膠原蛋白網絡[20]和生物細胞結構[21-22]，因此受到了廣泛關注。FANTINI等[23]提出了基于Voronoi方法的類骨小梁結構全互連多孔支架設計方法，GOMEZ等[24]結合顯微CT對Voronoi骨小梁結構進行更精確的匹配。遺憾的是，以往對不規則多孔結構的多數研究忽略了不規則度及其演化的影響，造成結構力學性能的不穩定。

筆者使用一種正向設計方法，基于泰森多邊形原理構建可控多孔支架，并將其與規則排列多孔結構進行比對。為評估多孔支架形態等設計參數的影響，采用激光選區熔化工藝與數字光處理(digital light processing，DLP)技術制備了金屬與陶瓷樣品，從仿生性能、壓縮性能等多個維度進行評價，為設計、制造與潛在應用提供數據支撐。

1 試驗方法

1.1 多孔結構的設計方法

基于泰森多邊形的不規則多孔結構設計方法是通過概率球控制點陣的不規則多孔結構設計方法，其基本設計思路是：在空間規則排列的球形區域內隨機生成種子點，利用泰森多邊形原理對隨機種子點陣進行聯結并生成Voronoi元胞，基于所生成元胞進行優化并形成多孔支架。本文采用犀牛grasshopper進行模型構建，通過賦予元胞各棱的直徑來改變孔隙率。試驗中，設置3個水平的孔隙率、3個水平的不規則度，通過試驗獲取各參數支架的彈性模量、壓縮強度等參數，從而篩選具有最優綜合性能的設計參數。本文不規則結構的設計方法如圖1所示。

隨機多孔結構與規則多孔結構的打印尺寸均為16 mm×16 mm×12 mm，規則結構的內部由4 mm×4 mm×4 mm的單元體進行結構填充，單元體結構分別為金剛石結構、菱形十二面體結構、面心結構、體心結構，如圖1所示。

圖1 多孔結構的構建方法

1.2 多孔結構的制備

多孔結構成形原理及樣件如圖2所示。使用SLM設備(EOSINT M290；EOS GmbH，德國)和優化的工藝參數制造試樣，所使用材料為Ti-6Al-4V粉末，具體工藝參數為：功率180 W，掃描速度1 m/s，掃描間距0.06 mm，層厚30 μm。第1組試樣的不規則度(隨機點生成區域直徑與原始點間距的比值)ε為0.10、0.25、0.50，設計孔隙率Φ為(60±1)%，控制點數為2000；第2組試樣的ε為0.5，Φ分別為(50±1)%、(60±1)%、(70±1)%，控制點數為1000，所成形樣件如圖2b所示。

使用自研DLP設備成形陶瓷多孔結構，所用材料為ZrO2/HA復合陶瓷粉末，具體的參數如下：氧化鋯的質量分數為75%，分散劑的質量分數為2%，曝光層厚20 μm，曝光時長10 s，曝光功率20 mW/cm2，以“先真空、后空氣”的脫脂氛圍對坯體進行脫脂[25]。采用無壓方式燒結圖2d所示樣件，燒結后的樣件會收縮變致密。

(a)SLM成形原理 (b)金屬支架樣件

1.3 設計模型的有限元分析

使用商業軟件ABAQUS 2016對理想的設計多孔結構進行了有限元分析，確定結構參數對力學性能的影響，仿真的材料為鈦合金，其彈性模量為105 GPa，泊松比為0.3，屈服強度為830 MPa。假設有限元模型是線性、彈性和均勻的，在底部邊界固定的情況下，對支架的頂部施加100 MPa的壓力。通過參數設置、模型網格劃分和求解，研究壓力作用下多孔支架的應力分布。

1.4 生物相容性檢測

使用小鼠胚胎成骨前體細胞MC3T3-E1進行體外細胞培養，將分散在60 μL懸浮液中約20 000個細胞滴種在支架表面，隨后在37 ℃下靜態培養4 h以促進細胞附著。以添加10%(體積分數)胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的細胞培養基DMEM(Dulbecco’s modified eagle medium)為培養基。將細胞種植的支架轉移到24孔板上，4 h后添加培養基進行后續培養，隨后每2天更新一次培養基。

使用熒光染色法檢測細胞活力，培養1天后，支架吸收細胞并用磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffersaline，PBS)洗滌，然后用5 mol/L鈣黃綠素和4 mol/L同二聚體乙醚處理細胞20 min，清洗后將其安裝在載玻片上進行熒光顯微鏡觀察。

采用掃描電鏡觀察細胞在支架上的附著情況，在細胞接種支架培養3天后，用PBS沖洗，用體積分數2.5%的戊二醛溶液浸泡2 h以固定細胞，在梯度乙醇/蒸餾水混合物中脫水10 min并在六甲基二硅氮烷中干燥，最后在掃描電鏡下觀察支架上附著的細胞。

采用CCK-8法檢測細胞增殖，在培養1、3和5 天時，在24孔板各孔位滴入10 μL CCK-8，隨后在37 ℃繼續培養2 h，最后通過范式檢測平臺在450 nm處測量吸光度(重復實驗次數n=3)。

2 性能評價

2.1 隨機多孔結構參數的影響

圖3所示為不同金屬支架的靜態壓縮試驗結果。將彈性模量和極限強度作為評價多孔生物材料力學性能的關鍵表征參數。如圖3c所示，設計孔隙率為(60±1)%時，樣品的彈性模量為3.16～3.80 GPa，且隨著不規則度的增大，彈性模量逐漸減??；樣品的極限強度為106～158 MPa，且隨不規則度增大呈現先降后升的趨勢。如圖3d所示，不規則度為0.5時，不同孔隙率樣品的彈性模量為1.84～5.11 GPa，極限強度為44.0～234.5 MPa。壓縮測試結果表明孔隙率較大的多孔結構具有較小的彈性模量和極限強度，測試范圍內的彈性模量、極限強度均與孔隙率成線性關系。該現象在關于晶格結構的相關研究中已得到證實[26]，因此在一定范圍內通過微調孔隙率使多孔結構達到所需的壓縮強度。由圖3e可以看到，多孔結構在壓縮時有明顯的彈性壓縮階段，此階段對應的壓縮應力為該支架的可承受載荷。載荷繼續增大，結構逐漸潰縮，局部應力超過極限載荷，部分梁結構斷裂，造成結構失效。

(a)不同不規則度支架壓縮曲線 (b)不同孔隙率支架壓縮曲線

為驗證不規則度對壓縮性能的影響，通過仿真軟件對金屬支架進行模擬，仿真結果與上述實驗結果變化趨勢相同。圖4所示為不同不規則度的結構承受相同載荷時的應力分布，高應力區集中在不規則梁的交界處，不規則度為0.25的多孔樣件具有最高的局部應力2146 MPa，因此可以推測具有較差的抗壓性能。不規則度增大時，多孔結構的部分單位晶胞逐漸從規則結構畸變為不規則結構，導致不規則梁的尺寸發生急劇變化，力學性能下降；不規則度達到較高水平時，不規則多孔結構在高應力區形成更為平滑的過渡來改善壓縮性能。

(a)ε=0.1 (b)ε=0.25 (c)ε=0.5

2.2 結構、材料與壓縮性能

圖3驗證了基于泰森多邊形的隨機多孔結構具有類似的壓縮曲線?？紫堵?、不規則度對極限壓縮強度等力學性能具有決定性的影響，本部分將ε=0.5、Φ=60%的隨機多孔結構與圖1所示的4類規則多孔結構進行比對。為研究不同材料的同類型結構壓縮性能的差別，筆者采用DLP工藝制備了與金屬支架結構相同的陶瓷支架?？紤]到陶瓷結構在燒結后收縮，因此以燒結后的陶瓷結構尺寸作為設計參數制備SLM成形金屬結構。

5類金屬結構與5類陶瓷結構的壓縮應力-應變曲線如圖5所示，從總體上看，不規則多孔結構、菱形十二面體結構、金剛石結構具有相近的壓縮性能，其原因在于這3種結構具有不同方向的承載梁，壓應力在整個結構內部的分布較為均勻。與菱形十二面體、金剛石結構相比，不規則多孔結構還有可調參數——不規則度，因此在調控力學性能方面具有顯著優勢。同時，隨機多孔結構內部梁的分布更隨機，各項力學性能與受力方向關聯性低，因而不會因為特定方向承受載荷而潰縮。體心結構與面心結構僅在特定方向具有優良的力學性能，承受不沿特定方向施加的載荷時容易出現結構滑移，從而失效，其承載能力僅為不規則、菱形十二面體及金剛石結構的20%，因此在設計過程中，盡量排除體心結構與面心結構。

(b)陶瓷材料

陶瓷結構與金屬結構在承受載荷方面存在顯著差別。由圖5b可知，陶瓷結構承受一定載荷后，出現了一段緩慢上升的準平臺期，其原因在于氧化鋯在受力時從四方相轉變為單斜相，通過相變吸收部分載荷的能量[27-28]，使結構不潰縮。載荷超過一定值后，由于陶瓷材料自身的脆性，結構產生局部脆性斷裂，從而失效，在圖形上顯示出更大的波動。由5b所示的測試結果可知，不規則多孔結構、體心結構、菱形十二面體結構可承受的極限壓力為7～15 MPa，而人體松質骨的抗壓強度為2～20 MPa[29]，因此植入時，陶瓷材料可作為松質骨的替換材料，而金屬結構具有更好的力學性能，可用于替換皮質骨[30]。將本文所成形支架與類似研究中支架的彈性模量、極限強度等進行比對，結果如圖6所示，彈性模量與極限強度成準線性關系，并且不同材料對應的坐標區域有顯著差異。

圖6 支架力學性能比對

2.3 支架生物相容性

使用光學顯微鏡觀測一定時間培養后的細胞。如圖7a所示，長條狀的是正常生長的細胞，白點亮點是死亡細胞或細胞代謝物，觀測范圍內的細胞增殖分化狀態良好。在支架上接種細胞，培養3天后的結果如圖7b所示，細胞已在圖中以黃色虛線進行了標記，可見，培養3天后的細胞能附著在支架表面，且細胞相互聚集，成片分布于測試件表面凸起或凹陷處，細胞足端有明顯的偽足伸出并與測試件表面聯結，說明多孔支架能為細胞提供良好的生長環境，為后期細胞增殖、分化等提供有利條件。

(a)培養基內 (b)支架上

將變不規則度的金屬支架與陶瓷材料支架進行比對，采用CCK-8法測定經一定時間培養后細胞的有效增殖。定量測試結果如圖8a所示，細胞數量隨培養天數增加而不斷增長，進一步表明各類支架均具有良好的生物相容性。不規則度較小時，支架內較為單一的孔隙組合以及較小的附著面積導致培養后的細胞增殖數小于對照組；不規則度升大時，不規則多孔結構內形狀多樣的大小孔形成了良好組合，為細胞附著與增殖提供了有利條件，因而在光密度(optical density，OD)上大于對照組。圖8b所示的染色結果表明，不規則度增大時，細胞增殖更為明顯，偽足清晰可見(表明細胞有效附著在支架上)。與金屬支架相比，陶瓷支架的羥基磷灰石使其在細胞增殖方面具有更優良的性能。

(a)CCK8測定結果

2.4 應用展望

基于Voronoi細分的方法可以有效模擬健康海綿骨的結構，并具有較高的精度。大多數情況下，通過調整種子點分布和縮放系數，可制備孔隙率在50%～80%的多孔結構，成形的結構與自然小梁骨如圖9所示[31]。隨機的種子提供了幾何上的異質性，產生了真正的仿生形狀，根據力學性能與生物相容性的比對結果可知，不規則度為0.5的結構是最優的類小梁結構，在此基礎上改變控制點密度可以制備具有梯度孔隙率的仿生結構來匹配具有不同孔隙率的小梁結構。

(a)健康海綿狀骨 (b)均質仿生多孔結構

將此方法推廣，通過對部分結構進行多孔化及布爾運算，設計具有部分疏松多孔的復雜結構植入假體。圖10展示了髖臼杯多孔結構的設計流程，該結構的內表面保持相對光滑，從而減少關節運動帶來的磨損，外表面的疏松多孔結構可以誘導骨細胞長入與分化，獲得優良的生物固定性能。

圖10 髖臼杯多孔表層結構設計

3 結論

本文基于泰森多邊形原理構建了4類具有規則多孔特征的支架，從材料及結構方面比對SLM制備的金屬支架與DLP制備的陶瓷支架的靜態力學性能和生物相容性。研究結果表明，隨機多孔結構的不規則度與孔隙率均對壓縮性能有影響，可以通過調節二者來調控力學性能；孔隙率近似的情況下，不規則多孔支架與菱形十二面體及金剛石結構具有相似的力學性能，金屬支架適合皮質骨的替換而陶瓷支架適合松質骨的替換。同時，隨機多孔支架的大小孔隙組合能促進細胞的附著與分化。綜上，采用Voronoi原理設計的仿生結構具有良好的力學性能及細胞相容性，可匹配人體不同部位的骨骼，是一種潛在的植入結構。