細胞治療在腎臟移植中的應用前景*

李楊 戎瑞明

器官移植是終末期器官衰竭的重要治療方法之一，但移植術后的器官結構功能損傷和免疫排斥反應影響患者生存時長和質量。同時，部分受者在移植后會患有代謝性疾?。ㄌ悄虿?、高血壓、高血脂）影響預后[1]。免疫抑制劑的應用雖可改善腎移植患者1年生存期，但移植物的長期存活率并沒有得到提高[2]。全身應用免疫抑制劑會顯著降低受者自身免疫功能并破壞腫瘤免疫監視機制，增加致命感染風險，誘發心血管疾病和惡性腫瘤[3]。近年來，細胞治療方興未艾，細胞治療在移植免疫中的研究及潛在價值日益受到重視。

細胞治療是指利用功能性細胞的特性，采用體內外獲取/擴增、特殊培養等處理后，使這些細胞具有增強免疫、靶向殺死病原體和有害細胞、促進組織器官再生和機體康復等治療效果。細胞治療本質上是給患者輸注血液有效成分，是輸血醫學的潛在拓展方向。從血液/骨髓中分離提取具有特定生物學特點的細胞，如間充質（mesenchymal stem cells，MSCs）/造血干細胞（hematopoietic stem cells，HSCs）、髓系來源的抑制性細胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）、調節性T細胞（regulatory T cells，Tregs）等[4-7]，可以用于實體器官移植患者的治療，促進輸血和器官移植學科的融合發展。美國血液與生物治療協會（AABB）已將傳統輸血、細胞治療、患者血液管理三大部分置于并重的狀態，因此在輸血醫學領域加強細胞治療研究是其發展趨勢，值得國內輸血同行借鑒。目前國內臨床上血液成分單采治療技術[8]、富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）治療[9]等開展已為輸血科介入細胞治療領域開辟了道路。

目前細胞治療臨床應用研究更多集中在腫瘤患者治療中，如造血干細胞移植（hematopoietic

stem cell transplantation，HSCT）、嵌合抗原受體T細胞免疫療法（chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T）治療血液系統疾病和實體腫瘤等[10-11]。隨著研究的深入，越來越多非腫瘤性疾?。ㄆ鞴僖浦瞇12]、自身免疫性疾病[13]等）成為細胞治療的適應證。

本文將以腎臟移植為例，探討細胞治療在器官移植中的應用前景，細胞治療有望實現腎移植受者的移植物長期存活和更低感染概率，使受者免疫抑制劑使用量減到最低甚至脫離使用，從而實現針對移植物的特異性免疫耐受。

1 抑制炎癥反應，減輕急性腎損傷 急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）常見病因包括缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injrty，IRI）[14]、藥物（順鉑、甲氨蝶呤、萬古霉素）毒性[15]、膿毒癥[16]、梗阻性腎病[17]等。AKI是腎移植失敗的危險因素，在移植早后期均可出現，造成移植物功能延遲（delayed graft function，DGF）或急性惡化，且DGF風險率受AKI分期影響。與器官移植相關的最重要的AKI是由IRI導致，腎小管上皮細胞（tubular epithelial cells，TECs）損傷和炎癥反應是IRI的核心環節。

MSCs是一類多能性干細胞，可分泌多種細胞因子：包括趨化因子、抑炎因子和生長因子，具有免疫調節的功能。當MSCs遷移到損傷部位，可以與炎性微環境相互作用，微環境中的炎癥因子可以影響MSCs的旁分泌效果，如蛋白、核酸和脂質等，MSCs也可借助自身分泌釋放胞外囊泡或細胞因子調控炎癥反應的發生發展。我們的研究發現MSCs可以減輕腎IRI[18]。劉必成等[19]報道人MSCs分泌出富含miR-125b-5p囊泡可優先靶向受損的TECs并抑制P53蛋白表達，從而緩解細胞周期阻滯和凋亡。另外，可向腎譜系分化并形成體外三維腎小管結構的胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）和誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）、成人腎干細胞也可作為理想的治療候選細胞[20-22]。

AKI期間釋放的損傷相關分子模式和病原體相關分子可以激活免疫系統，傳導下游效應，如產生促炎/趨化因子，NK細胞/巨噬細胞等活化，遞呈抗原引發排斥反應。因此，靶向免疫分子及細胞也是減輕AKI的策略之一。研究表明免疫負性調節細胞（MDSCs和Tregs）也參與調節AKI。YAN等[23]研究發現G-CSF通過誘導MDSCs減輕腎缺血再灌注損傷。Foxp3+Tregs細胞參與缺血性急性腎損傷的修復[24]。此外，MSCs與免疫細胞的交互作用在抑炎和保護AKI中起到重要作用。單核細胞樣髓系來源的抑制性細胞（monocyte like myeloid-derived suppressor cells,M-MDSCs）來源的IL-15可以抑制TGF-β1誘導的MSCs向肌成纖維細胞分化，這種作用是通過Ras-ERK1/2-Smad2/3信號通路介導的[25]。SONG等[26]報道MSCs經過IL-1β預處理，通過調節miR-146a誘導巨噬細胞向M2表型（M2表型為選擇性活化的巨噬細胞，具有抗炎作用）分化，強化了免疫調節功能，更好地對急性腎損傷起保護作用。我們發現MSCs通過分泌SOS蛋白（一種鳥苷酸交換因子）可以促進Tregs分化、趨化和免疫抑制功能增強—賦能調控免疫微環境（未發表）。TAN等報道自體MSCs通過抑制T細胞增殖和單核細胞分化，并調節NK細胞和B細胞功能發揮免疫抑制的作用，應用于活體供腎移植，與抗IL-2受體抗體誘導相比，可降低急性排斥反應的發生率，同時降低機會性感染的風險[27]。

由此可見，干細胞（MSCs、ESCs、iPSCs）及其衍生物、MDSCs、Tregs在抑制炎癥反應，減輕急性腎損傷中都發揮了重要作用。不同類型細胞的交互影響（協同或拮抗）也為細胞治療在腎移植中的臨床應用提供了新的可能。

2 抗排斥反應，誘導免疫耐受 同種異體免疫排斥是腎移植后的一個重要并發癥，可由T細胞或抗體介導。細胞免疫排斥反應以T細胞和巨噬細胞浸潤為主，體液免疫排斥反應涉及MHC分子識別和補體系統激活。通過輸注免疫細胞調節患者體內免疫微環境，控制和降低移植器官損傷引發的固有免疫反應和供受體刺激誘導的適應性免疫應答，可以提高移植器官的存活率。目前已證實Tregs、MDSCs和HSCs在抗腎移植排斥反應、誘導免疫耐受中發揮了一定的作用。

Tregs被認為是免疫耐受的核心，也是器官移植免疫耐受形成的原因和標志。CD4+CD25+Foxp3+Tregs是Tregs中最重要功能性亞群，Foxp3表達和功能穩定可幫助Tregs產生抗炎性細胞因子、調節抗原提呈細胞（antigen presenting cells，APCs）功能、消耗生長因子、破壞代謝途徑和誘導免疫細胞凋亡[28-29]。供者抗原或者受者APCs可驅動預存體內的Tregs擴增，但數量較少，不足以抗衡誘導移植排斥反應的免疫細胞[30]，因此需要輸注外源性Tregs或移植前輸注同種抗原，以擴增或誘導特異性Tregs，將受體的免疫系統轉向接受同種異體移植。一項天然調節性Tregs細胞（nTregs）應用于腎移植受者的Ⅰ/Ⅱa期臨床試驗顯示，治療組的患者中有8例（8/11，73%）T細胞活化被抑制，實現了穩定的單藥免疫抑制治療，而對照組仍接受標準的雙聯或三聯免疫抑制藥物[31]。另一項研究顯示，給腎移植小鼠輸注人工誘導的CD4+CD25+Tregs細胞（iTregs）降低了循環供體特異性抗體的水平和移植物內抗體沉積，減少了CD4+T細胞、CD8+IFN-γ+細胞、NK細胞、B細胞和M1表型巨噬細胞（經典活化的巨噬細胞，具有促炎作用）在炎性部位的浸潤[32]。

Tregs的體外編輯與回輸是誘導腎移植免疫耐受很具有吸引力的新研究方向。仿照CAR-T細胞治療思路，擴增經過基因工程改造以表達識別標靶抗原的合成受體（CAR）的多克隆Tregs，如HLA-A2 CAR，已被應用于臨床試驗[33]。HLA-A2是大多數種族尤其是亞洲人共有的主要組織相容性抗原，A2-CARTregs能特異性抑制HLA-A2抗原激活，而不會引發相關細胞因子激活，對異種皮膚移植的效果明顯好于多克隆Tregs[33]。另外，通過A2-CAR激活修飾nTregs導致其信號傳導、增殖和免疫抑制功能增強，但細胞表型和表觀遺傳學的穩定性不受影響[34]。CAR-Tregs提高了誘導免疫耐受的特異性，避免受者免疫抑制過低和易患腫瘤風險，已成為治療腎臟移植排斥反應和誘導免疫耐受的新策略。

MDSCs是具有抗炎和免疫抑制功能的未成熟的髓樣細胞群。MDSCs在建立腎移植免疫耐受過程中的作用日漸被認識。MDSCs免疫抑制機制多樣[35-37]：可抑制T細胞、B細胞增殖，促進T細胞凋亡；通過TGF-β和IFN-γ使NK細胞數量減少，功能失活；上調血紅素氧合酶1的表達，抑制樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）成熟，促進IL-10生成并具有細胞保護作用；通過細胞間作用（CD40/CD40L）和細胞因子（IL-10，TGF-β及IFN-γ）調節CD4+T細胞，誘導Tregs生成。有文獻報道，相比單次大量回輸MDSCs，少量多次輸注更利于免疫抑制作用的發揮[38]。在腎臟移植模型中，MDSCs抑制效應T細胞的增殖，并以接觸依賴的方式誘導細胞凋亡，不影響Treg功能[39]。而在臨床研究方面，LUAN等[40]研究發現腎移植受者體內CD11b+CD33+HLA-DR-MDSCs增多，并且MDSCs累積與Tregs的增加呈線性相關。

循環單核細胞HLA-DR密度被用作腎移植過繼細胞療法（adoptive cell therapy，ACT）試驗中的安全標志物，接受潑尼松龍治療的腎移植受者HLA-DR密度降低，與單核細胞源性MDSCs的積聚有關，依據隨訪結果，受者HLA-DR密度過低，患惡性腫瘤幾率高[41]。另外，腎移植受者患皮膚鱗狀細胞癌的風險上升也與MDSCs數量增加有關[42]。說明MDSCs不僅與移植耐受有關，而且與腫瘤免疫監測有關。未來需要更多研究來評估腎移植受者MDSCs水平升高的預后價值和臨床意義。

HSCs是誘導腎臟移植免疫耐受較早得到臨床驗證的細胞之一。我們早在2009年就開展了供者HSCs輸注聯合腎移植的國際注冊臨床研究（注冊號：ChiCTR-TNC-09000399），發現患者術后Tregs比例增加，出現一過性嵌合體并減少了免疫抑制劑的用量，表明成功誘導了部分免疫耐受。目前已發現HSCs可通過供者反應性克隆清除、共刺激信號阻斷、誘導嵌合體[43]、促進調節細胞分化[44]等機制誘導供者特異性免疫耐受。西北大學LEVENTHAL團隊對8名HLA不相合腎病患者進行腎移植聯合HSCs輸注，移植術前注射氟達拉濱（days-4，-3，和-2）和200-cGy全身照射（days-1）以清除受體免疫系統，術后第一天輸注CD34+供者HSCs，同時輸注輔助細胞取得了更好的誘導免疫耐受效果，5名受試者體內產生了長期的嵌合體并完全撤除了免疫抑制劑[45]。由此可見，在移植受者體內建立持久的高濃度供體嵌合體對HSCs發揮功能性的免疫抑制作用有重要意義。

3 減輕纖維化 腎移植引發的氧化炎性損傷和細胞/抗體介導免疫排斥反應，最終導致腎間質纖維化和腎小管萎縮。腎纖維化是所有慢性腎?。╟hronic kidney disease，CKD）包括移植腎失功的共同結局。研究表明MSCs與腎纖維化關系密切。不同來源的MSCs（脂肪來源MSCS、骨髓來源MSCs、胚胎干細胞）對腎纖維化都有一定的修復作用[46-49]。MSCs的治療劑型和是否與其他藥物聯合使用影響腎纖維化的治療效果。與未治療組和靜脈注射MSCs組相比，細胞片劑的MSCs存活率更高，分泌HGF和VEGF更持久，顯著抑制腎功能障礙、微血管損傷和纖維化[50]。骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs）聯合低劑量FK506可以改善免疫抑制功能,有效減少移植腎的慢性退行性改變和鈣調神經磷酸酶抑制劑對移植腎結構的毒性作用[51]。此外，腎損傷后炎癥微環境的MSCs（內源性MSCs）發生活化，通過旁分泌和賦能方式，并根據組織炎癥強度直接調節免疫反應。本課題組在IRI誘導的腎纖維化組織中發現，腎組織駐留MSCs向肌成纖維細胞分化的現象，這種現象可被M-MDSCs通過Ras-Erk1/2-Smad2/3信號通路抑制[25]?；谕庠葱訫SCs來源廣、獲取方便、免疫原性低、不良反應低等優點而受到重視，外源性MSCs的輸注或靶向遞送基因或分子可達到修復損傷組織的目的。而如何調控炎癥微環境的MSCs，避免過度纖維化是修復腎組織結構的關鍵。

最近，免疫細胞在腎纖維化中的治療效果也得到了證實。QIU等在單側輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）誘導的小鼠腎纖維化模型中發現過繼轉移MDSCs或GM-CSF預處理可有效改善細胞外基質（extracellular matrix，ECM）沉積,有效延緩腎小管間質纖維化，促進腎臟Tregs浸潤，同時下調Th1細胞（一種輔助性T淋巴細胞）[52]。從腎損傷、再生到纖維化，免疫反應變化錯綜復雜，不同免疫細胞在腎損傷后的急慢性發病機制中發揮著不同作用。早期Tregs擴增不僅保護腎臟免受初始損傷，還可防止晚期腎纖維化的發展。同時，Tregs細胞可以調節巨噬細胞表型和功能，以控制炎癥和促進修復。不同MDSCs亞型的免疫抑制調控機制有所差異。MDSCs，尤其是粒細胞樣髓系來源的抑制性細胞（granulocyte like myeloid-derived suppressor cells,G-MDSCs），在慢性腎臟炎癥和纖維化期間積聚在腎臟中，通過控制效應T細胞、DC和巨噬細胞的過度擴增，抑制腎臟炎癥和纖維化?；诖?，確定腎損傷后急慢性階段的Tregs和MDSCs異質性，利于提供有針對性的腎纖維化細胞治療策略。

4 展望 現階段，細胞治療在腎移植中的應用場景主要集中在以下3個方面：（1）抑制炎癥反應，減輕急性腎損傷；（2）抗排斥反應，誘導免疫耐受；（3）減輕纖維化。細胞治療的臨床療效存在較大的個體化差異，原因可能與多種因素有關，包括患者臨床狀況及細胞治療時間點、治療細胞的來源和劑量、擴增和改造，細胞產品半衰期和體內動力學等?？紤]到當前細胞治療在器官移植臨床應用過程中的切實問題和移植免疫學的發展，我們展望未來細胞治療在器官移植中的應用將在以下幾個方面有所偏重與突破：（1）進一步深入研究并明確不同細胞治療調節器官移植免疫平衡的機制；（2）明確器官移植前后細胞治療時機、給藥方式；（3）提供穩定、安全和有效的細胞產品，降低移植受者感染和患癌風險；（4）建立統一嚴苛的質量標準以實現產品品質的一致性，包括規范生產工藝、提高技術/研究人員操作熟練程度、加強微生物檢測。同時，個體化治療是細胞療法取得更好治療效果的必由之路。

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