臭氧漂洗及冷凍貯藏對鰱魚糜蛋白氧化和風味的影響

鄭文棟，樓倚洋，安玥琦，2，尤娟，2，尹濤，2，劉茹，2，熊善柏，2

1.華中農業大學食品科學技術學院/國家大宗淡水魚加工技術研發分中心（武漢），武漢 430070；2.長江經濟帶大宗水生生物產業綠色發展教育部工程研究中心，武漢 430070

魚糜是我國傳統水產制品，具有高蛋白、低脂肪、營養價值高、安全健康等優點，深受消費者歡迎，2021年我國魚糜制品產量達到134.98萬t，相較2020年增加6.47%［1］。我國淡水漁業資源豐富，鰱常被用作生產魚糜的原料魚，但是利用鰱生產的魚糜存在腥味重、白度低等問題。

漂洗是制作魚糜的一道關鍵工序，漂洗可以富集肌原纖維蛋白，提高其濃度，增強魚糜凝膠形成能力，去除魚肉腥味，改善魚糜品質，同時也會降低一些呈味核苷酸類物質和水溶性游離氨基酸的含量，進而影響魚糜產品的風味特性［2］。臭氧處理是有效去除異味、抑菌的安全方法，目前已被逐漸應用于魚糜加工中。筆者所在實驗室前期在不影響其凝膠品質的前提下已開發出臭氧水漂洗方法［3］，然而臭氧的強氧化性，會引起魚糜脂肪、蛋白質等組分的變化，并且其自身的氣味會對魚糜氣味和滋味物質有較大影響［4］。魚糜生產后常以冷凍方式貯藏，冷凍魚糜可以有效延長魚糜的保質期，但是魚糜在冷凍過程中會發生蛋白變性，影響魚糜風味品質［5］。目前關于臭氧漂洗及冷凍貯藏對鰱魚糜蛋白氧化和風味影響的報道比較少。

本研究以鰱為原料，采用臭氧漂洗制備新鮮和冷凍的魚糜，通過測定鹽溶性蛋白、水溶性蛋白、活性巰基含量、游離氨基酸組成以及電子鼻、電子舌和GC-IMS檢測揮發性風味成分等方法研究臭氧漂洗及冷凍貯藏對魚糜蛋白氧化和風味影響，分析蛋白氧化與風味物質變化的內在聯系，研究臭氧漂洗工藝對新鮮魚糜及冷凍魚糜風味的影響，旨在為臭氧在魚糜及魚糜制品等水產加工業中的應用提供理論基礎，為優質魚糜的生產和品質調控提供方法和依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮鰱（2.0～3.0 kg/尾），購于華中農業大學校內農貿市場，活魚運輸到實驗室。

GCQJ-1-3電解式高濃度臭氧氣機，武漢威蒙環?？萍加邢薰?；ASTREE II電子舌，Alpha M.O.S公司；L-8900全自動氨基酸分析儀，日本日立公司；FOX-4000型電子鼻，Alpha M.O.S公司；7890A氣相色譜儀，美國安捷倫公司；FlavourSpec?氣相離子遷移譜聯用儀，德國G.A.S.公司。

1.2 樣品處理方法

新鮮鰱清洗，去頭、去尾去內臟后用采肉機采肉，均分為2組，第1組用清水（自來水）漂洗2次；第2組用清水漂洗1次，8 mg/L臭氧水漂洗1次，漂洗完魚肉用三足式離心機離心脫水，再使用水分分析儀測定并調節水分含量至76%，得到清水漂洗新鮮魚糜（QSYM）和臭氧漂洗新鮮魚糜（O3YM）。在上述2種魚糜中加入抗凍劑（4%蔗糖、4%山梨糖醇、0.1%焦磷酸鈉、0.1%三聚磷酸鈉），使用食品調理機斬拌均勻，放置于-18 ℃冷凍貯藏45 d，得到清水漂洗冷凍魚糜（QSLD）和臭氧漂洗冷凍魚糜（O3LD）。

1.3 魚糜理化指標的測定方法

1）水溶性及鹽溶性蛋白的測定。參考Xiong等［6］的方法提取出蛋白后用福林酚法測定蛋白含量。

2）羰基含量的測定。參考Mesquita等［7］的方法進行前處理，以22 308 L/（mol·cm）消光系數計算蛋白質的羰基衍生物含量，單位為nmol/mg。

3）活性巰基含量的測定。參考Zhang等［8］的方法，鹽溶性蛋白用高鹽緩沖液稀釋至1 mg/mL后取1 mL，加200 μL Ellman試劑和3 mL Tris-甘氨酸緩沖液（0.086 mol/L Tris，0.09 mol/L甘氨酸，0.004 mol/L EDTA，8 mol/L尿素）混合，于室溫下反應1 h后，412 nm處測量吸光值，計算活性巰基含量。

4）游離氨基酸含量測定。參考GB 5009.124-2016《食品中氨基酸的測定》方法。

1.4 魚糜的電子舌分析方法

參照Luo等［9］的方法對魚糜樣品進行電子舌分析。

1.5 魚糜的電子鼻評價方法

參照陳冬清［10］的方法進行電子鼻分析并根據付湘晉等［11］建立的模型，電子鼻中的18種探頭用來檢測魚肉的氣味。

1.6 GC-IMS風味分析方法

取2 g樣品置于20 mL頂空瓶中，60 ℃孵育20 min后進樣，進樣針溫度65 ℃，進樣500 μL，設置分析條件：MXT-5色譜柱（15 m×0.53 mm，1 μm），柱溫60 ℃，使用N2作為載氣和漂移氣，漂移氣流速為150 mL/min，載氣流速在0～2 min為2 mL/min，2～20 min內為100 mL/min，每個樣品重復測定3次。采用系統自帶的VOCal、Reporter插件、GalleryPlot插件和DynamicPCA插件進行譜圖和數據的定性定量以及二維俯視圖、三維譜圖和差異譜圖、指紋圖譜的分析。

1.7 數據統計與分析

所有試驗重復3次，每組試驗做3個平行。采用SAS 8.0（SAS8.0，Institute Inc.，Cary，NC，USA）進行相關性分析和方差分析。采用Origin 9.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 臭氧漂洗后新鮮和冷凍的鰱魚糜蛋白含量的變化

由圖1可見，相較清水漂洗新鮮魚糜，臭氧漂洗新鮮魚糜水溶性蛋白含量下降，鹽溶性蛋白含量上升，表明臭氧漂洗會促進魚糜中水溶性蛋白的溶出，從而使鹽溶性蛋白相對含量增加。相較新鮮魚糜，冷凍魚糜水溶性蛋白，鹽溶性蛋白均有顯著下降（P<0.05）。其中清水漂洗魚糜貯藏后水溶性蛋白下降34.42%，而臭氧水漂洗魚糜貯藏后水溶性蛋白下降24.80%；而對鹽溶性蛋白，清水漂洗魚糜經貯藏后下降17.31%，臭氧漂洗魚糜下降18.35%。

圖1 不同處理鰱魚糜的水溶性蛋白與鹽溶性蛋白含量Fig.1 The contents of water-soluble protein and salt-soluble protein in surimi of silver carp under different treatments

2.2 臭氧漂洗后新鮮和冷凍的鰱魚糜羰基及活性巰基含量的變化

由圖2可見，臭氧漂洗魚糜的羰基含量相較清水漂洗魚糜顯著上升，表明臭氧氧化對魚糜蛋白具有氧化作用，而冷凍貯藏后，羰基含量相較新鮮魚糜大幅上升，表明冷凍貯藏相較臭氧氧化對魚糜影響更加顯著。臭氧漂洗魚糜活性巰基含量較清水漂洗魚糜下降16.92%，而冷凍貯藏45 d后，臭氧冷凍魚糜活性巰基含量較清水冷凍魚糜下降16.57%，表明臭氧漂洗使魚糜中活性巰基含量顯著下降，而魚糜在冷凍貯藏過程中，臭氧漂洗對魚糜活性巰基含量下降的影響相對較小。

圖2 不同處理鰱魚糜的羰基（A）及活性巰基含量（B）Fig. 2 The contents of carbonyl（A） and active sulfhy?dryl content（B） in surimi of silver carp under different treatments

2.3 臭氧漂洗后新鮮和冷凍的鰱魚糜游離氨基酸組成及其滋味活度值（TAV）評估

滋味活度值（taste activity value，TAV）為樣品中滋味物質濃度與其閾值的比值，當TAV≥1時，表明該滋味物質對樣品滋味貢獻較大。由表1可見，樣品中單個氨基酸TAV值均小于1，表明影響魚糜滋味特征的可能并不是單一氨基酸，而是多種氨基酸共同作用導致。魚糜中呈鮮味的谷氨酸（Glu）、甜味的丙氨酸（Ala）、甜/苦味的纈氨酸（Val）、賴氨酸（Lys）和苦味的亮氨酸（Leu）含量較高。臭氧漂洗后，這些呈味游離氨基酸含量顯著下降，其中甜味氨基酸含量由71.14 mg/100 g下降到43.60 mg/100 g，下降38.71%；苦味氨基酸含量由108.29 mg/100 g下降到79.38 mg/100 g，下降26.70%；鮮味氨基酸含量由179.43 mg/100 g下 降 到122.98 mg/100 g，下 降31.34%；表明臭氧漂洗對新鮮魚糜滋味影響明顯。魚糜凍藏后，大部分游離的呈味氨基酸含量進一步下降，下降幅度也遠大于臭氧漂洗，表明凍藏是魚糜滋味變化的主要因素之一。臭氧漂洗魚糜凍藏后與清水漂洗魚糜凍藏后呈味氨基酸含量相差不大，表明臭氧漂洗對魚糜凍藏過程中氨基酸損失影響不大。

2.4 電子舌測定臭氧漂洗及凍藏對鰱魚糜滋味的影響

對電子舌采集到的各組數據進行主成分分析，并做主成分分析（PCA）圖和滋味雷達圖。由圖3A可知，PC1和PC2貢獻率之和為100%，說明涵蓋了原始數據的絕大部分信息。新鮮魚糜主要分布在第一、四象限，冷凍魚糜主要分布在第二、三象限，說明新鮮魚糜和冷凍魚糜的滋味特征值能有效區分，滋味輪廓相差較大。而臭氧漂洗和清水漂洗置信區間均有重疊，說明臭氧漂洗和清水漂洗滋味輪廓相差較小，PCA圖無法有效區分。4種魚糜電子舌雷達圖如圖3B所示，由電子舌傳感器響應值可知，新鮮魚糜和冷凍魚糜風味存在顯著不同，但是臭氧漂洗與清水漂洗響應值差別不大，這與PCA結果相一致。冷凍魚糜的酸味、苦味、甜味、鮮味、咸味相較新鮮魚糜均顯著下降。

圖3 不同處理鰱魚糜基于電子舌滋味特征的PCA分析（A）和雷達圖（B）Fig.3 PCA analysis （A） and radar chart （B） of electronic tongue taste characteristics of silver carp surimi under different treatments

2.5 電子鼻測定臭氧漂洗及凍藏對鰱魚糜氣味的影響

由圖4A可見，主成分1（PC1）貢獻率達78.2%，主成分2（PC2）貢獻率為13.1%，總貢獻率為91.3%，大于90%，可以代表樣品的整體氣味信息。從魚糜電子鼻傳感器響應值在PCA圖中的分布可以看出，新鮮魚糜和冷凍魚糜的氣味特征值能有效區分，其中新鮮魚糜主要分布在第二、三象限，冷凍魚糜主要分布在第一、四象限，但臭氧漂洗和清水漂洗魚糜置信區間均有重疊，說明新鮮魚糜和冷凍魚糜氣味輪廓相差較大，但是臭氧漂洗和清水漂洗魚糜氣味輪廓相差較小，PCA圖無法有效區分。表明凍藏過程對魚糜氣味特征影響較大，而電子鼻主成分分析不能很好地區分開臭氧處理對魚糜風味特征的影響。

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由4種魚糜的電子鼻響應值的雷達圖（圖4B）可知，T30/1、T40/2和T70/2探頭能表明哈喇味，臭氧漂洗新鮮魚糜較清水漂洗魚糜，3個探頭響應值略有下降，但是經過凍藏后，臭氧漂洗魚糜響應值高于清水漂洗魚糜，表明臭氧漂洗一定程度上可以降低新鮮魚糜的哈喇味，但是凍藏之后，臭氧對魚糜氣味可能有負影響，即哈喇味增加；分析探頭PA/2 （酮類、醇類、氨水、胺類化合物、含硫化合物）、 P30/1（氨類、醇類）、P30/2（醇類、醛類、硫化氫）響應值的變化可知，臭氧漂洗魚糜凍藏后醇類、醛類、酮類物質含量略有上升。T40/1探頭表明土霉味，LY2/g CTl、LY2/GH是對魚腥味特異響應的傳感器（圖4C）?？梢姵粞跗葱迈r魚糜魚腥味和土霉味較清水漂洗新鮮魚糜均有明顯降低，且清水漂洗的冷凍魚糜哈喇味、魚腥味和土霉味均高于臭氧漂洗的冷凍魚糜，表明臭氧漂洗能夠有效減少冷凍貯藏對魚糜風味的不良影響，這一結果也與游離氨基酸含量變化相印證。

圖4 鰱魚糜基于電子鼻氣味特征的PCA分析（A）、雷達圖（B）和腥味評價（C）Fig.4 PCA analysis （A）， radar chart （B） and odor evaluation （C） of silver carp surimi based on odor characteristics of electronic nose

2.6 GC-IMS風味成分分析

從GC-IMS三維俯視圖（圖5A）可以直觀看出不同樣品中的揮發性有機物差異，反應離子峰（RIP）右側的每個點代表1種揮發性有機物。以清水新鮮魚糜（QSYM）的譜圖作為參比，剩余3個樣品的譜圖扣減參比，扣除后原始背景褪色為白色，如圖5B所示，魚糜樣品揮發性風味物質的種類和濃度明顯不同。

GC-IMS從樣品中共鑒定出揮發性風味物質59種，其中醛類17種、醇類13種、酮類7種、酯類1種、其他化合物21種，其中有2-戊基呋喃等重要風味化合物。清水漂洗新鮮魚糜壬醛、辛醛、6-甲基-5-庚-2-酮、1-戊醇、醋酸、異丙醇等物質的含量較高，臭氧漂洗后的新鮮魚糜3-辛醇、庚醛、1-戊醇、戊醛、3-甲基丁醛、異丙醇、β-羅勒烯、庚醇等物質的含量較高，清水漂洗冷凍魚糜3-辛酮、1-辛烯-3-醇、3-呋喃甲醇、環己酮、（E）-2-戊烯醛、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、3-戊酮、1-丁醇、乙酸乙酯、丁醛、丙醇、2-丁酮、糠醛、異丁醇等物質的含量較高，其中醇類、烯醛類香氣物質的含量較高，大多是魚腥味的重要特征物質。臭氧漂洗后的冷凍魚糜中（E）-2-己烯醛、乙偶姻、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、1-丁醇、丙醇、2-丁酮等物質的含量較高。

由圖5C可知，冷凍前后魚糜的風味發生了較大的變化，冷凍前，QSYM與O3YM中癸醛、壬醛、辛醛、庚醛、己醛、3-辛醇、1-戊醇、（E）-2-庚烯醛、6-甲基-5-庚烯-2-酮、乙偶姻、乙酸、2-丙醇、戊醛、3-甲基丁醛、1-庚醇、β-羅勒烯等物質的含量較高，而冷凍后魚糜中1-辛烯-3-醇、3-呋喃甲醇、苯甲醛、3-辛酮、2-己酮、環己酮、2-庚酮、（E）-2-辛烯醛、（E）-2-己烯醛、（E）-2-戊烯醛、2-甲基丁醇、3-甲基丁醇、1-丁醇、異丁醇、3-戊酮、2-丁酮、乙酸乙酯、丁醛、丙醇、2-甲基丁醛、2-戊基呋喃、α-蒎烯、甲苯、3-甲硫基丙醛、糠醛、2-乙基-3，5-二甲基吡嗪、芳樟醇、檸檬烯、2，4-庚二烯醛等物質的含量較高。

圖5 魚糜揮發性組分的GC-IMS譜圖俯視圖（A）、差異圖（B）和指紋圖譜（C）Fig.5 GC-IMS spectrum top view （A）， two-dimensional differential map （B） and fingerprint map （C）of the volatile components of surimi of silver carp

3 討論

3.1 臭氧漂洗和冷凍貯藏對魚糜蛋白氧化的影響

魚肉主要成分一般由水溶性的肌漿蛋白、鹽溶性的肌原纖維蛋白和不溶性的基質蛋白組成，已有研究表明臭氧漂洗會一定程度改變這些魚肉蛋白結構，進而導致蛋白溶解度發生一定程度的改變，適度的臭氧氧化導致魚肉蛋白結構發生輕微改變，增強了蛋白的溶解性，使其在漂洗過程中溶出增多［12-13］。而魚糜是一種富含蛋白質的魚肉加工品，臭氧具有強氧化性，因此，在漂洗過程中會對魚糜蛋白產生一定的氧化作用，已有研究表明氨基酸側鏈基團容易被氧化成羰基衍生物［14］，而含有巰基基團的半胱氨酸、蛋氨酸對氧化環境敏感［15］，巰基易被氧化生成二硫鍵［16］，因此羰基和活性巰基含量變化常被用作蛋白質氧化的重要指示［17］。李文協等［17］研究發現臭氧水漂洗后鲅魚糜羰基含量顯著上升，活性巰基含量顯著下降。Zhang等［18］用7.6 mg/L臭氧水漂洗鳙魚糜20 min 后，肌原纖維蛋白總巰基含量和活性巰基顯著減少（P<0.05）。本研究中臭氧漂洗使魚糜中水溶性蛋白含量減少，鹽溶性蛋白含量增加，羰基含量上升，活性巰基含量下降，與前人的研究結果相一致。魚糜在凍藏過程中，肌原纖維蛋白分子間由于氫鍵、疏水鍵、二硫鍵、鹽鍵的形成而聚集變性，從而使其鹽溶性下降［19］。Xiong等［20］研究發現草魚魚糜在-18 ℃條件下貯藏30 d后，鹽溶性蛋白下降到新鮮魚糜的40.1%。有研究表明巰基在魚糜冷凍或冷藏過程中容易被氧化成二硫鍵，導致巰基含量下降［21］。Zhou等［22］研究發現羅非魚魚糜在-18 ℃貯藏24周后，總巰基含量降低了14.4%。同樣，本研究中冷凍魚糜相較新鮮魚糜，水溶性及鹽溶性蛋白含量顯著下降，羰基含量大幅上升，活性巰基含量下降。并且臭氧漂洗魚糜較清水漂洗魚糜在冷凍貯藏過程中水溶性/鹽溶性蛋白變化幅度不明顯，表明冷凍貯藏對魚糜品質影響更大。

3.2 臭氧漂洗和冷凍貯藏對魚糜風味的影響

魚肉中豐富的游離氨基酸是其滋味特性的主要來源之一?，F有的研究表明，鰱魚肉特有的風味游離氨基酸主要是組氨酸、賴氨酸、丙氨酸、蘇氨酸等，而鰱魚糜中苦味的亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸，以及具有鮮味的谷氨酸的含量相對較高，且谷氨酸對生魚糜滋味貢獻較大［23-24］。本研究也得出相似的結論。臭氧漂洗后魚糜中游離氨基酸的含量稍有減少，可能是由于臭氧的氧化作用，含量較高的游離氨基酸被氧化而減少，從而導致臭氧漂洗后魚糜風味與新鮮魚糜有所差異。而冷凍貯藏后，魚糜中游離氨基酸大幅減少，且減少幅度顯著大于臭氧漂洗魚糜。有研究表明一些水溶性游離氨基酸含量可能會因凍藏過程中細胞結構破壞導致解凍過程中汁液流失而減少［25］。另外，Yin等［26］研究發現，凍藏過程中游離氨基酸也可能與其他化合物發生反應導致其含量下降。魚糜的風味評價包括滋味評價和氣味評價。目前已有研究表明魚肉的主要氣味物質是己醛、壬醛、辛醛、1-辛烯-3-醇、1-戊烯-3-醇等。而生產魚糜時的漂洗工藝將顯著降低魚糜中的揮發性成分庚醛、壬醛含量，冷凍貯藏也將影響魚糜的氣味物質［27］。在本研究的GC-IMS分析中，臭氧漂洗的魚糜檢測出的不飽和醇類都明顯低于清水漂洗魚糜，且庚醛、戊醛、己醛等醛類物質含量增加，可能是由于臭氧的氧化作用使得脂質氧化或者將醇類物質氧化為醛類或酮類物質，從而造成了清水漂洗魚糜和臭氧漂洗魚糜電子鼻分析結果的差異。安玥琦［24］在冷凍鰱魚糜中共鑒定出80種氣味物質，包括31種醛類物質、13種醇類物質及11種酮類物質，而本研究中僅鑒定出59種氣味物質，這可能是由于采用的鑒定方法有差別，但整體趨勢一致，醛類物質偏多，其次是醇類物質，再次是酮類物質。與新鮮魚糜相比，魚糜在冷凍后醇類物質減少，醛類物質顯著增加，從而顯著改變魚糜的氣味，臭氧漂洗后再冷凍貯藏的魚糜中醛類物質的增加更為顯著，與電子鼻分析的結果相一致。

綜上，臭氧漂洗及冷凍貯藏對魚糜品質及風味均有影響，其中冷凍貯藏影響更大。一定濃度臭氧水漂洗使魚糜中鹽溶性蛋白含量增加，羰基含量上升，活性巰基含量下降，呈味氨基酸含量略有下降，魚糜魚腥味、土霉味減弱。而冷凍魚糜相較新鮮魚糜，鹽溶性蛋白含量顯著下降，羰基含量大幅上升，活性巰基含量下降，呈味游離氨基酸含量大幅度下降，風味差異顯著。臭氧漂洗魚糜冷凍貯藏后相關指標變化趨勢與清水漂洗魚糜冷凍貯藏后變化趨勢接近。臭氧漂洗主要對新鮮魚糜影響較大，在后續冷凍貯藏過程中影響較小。因此，臭氧漂洗可以初步運用到魚糜及魚糜制品等水產加工業中。