解淀粉芽胞桿菌分離鑒定及培養優化的研究進展

王世偉, 王卿惠

(1．齊齊哈爾大學生命與農林學院 抗性基因工程與寒地生物多樣性保護重點實驗室,黑龍江 齊齊哈爾 161005; 2．東北農業大學 生命科學院,黑龍江 哈爾濱 150030)

解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)屬于芽胞桿菌屬(Bacillus),能抗植物病原菌,促進植物生長,在種植業、養殖業、果蔬采后病害防治方面應用前景廣泛[1-6]。解淀粉芽胞桿菌可用于生產生物農藥,具有取代傳統化學農藥的趨勢,同時還具有綠色、安全、高效等優勢[7-8]。該菌在自身生長過程中,能產生抗菌物質,包括抗菌蛋白、脂肽類和聚酮化合物等,其中抗菌脂肽在植物病害防控上發揮了重要作用[9-10]?？咕鞍资且活悓χ参锊≡哂幸种谱饔玫幕钚缘鞍?不易產生抗性,對人體與環境不會造成危害[11]。盡管目前解淀粉芽胞桿菌抗菌和促生機理已有大量研究報道,但對該菌的生境多樣性、分子鑒定以及其培養基和培養條件優化的基礎工作仍不能忽視,本文對目前相關研究成果進行歸納分析,以期為解淀粉芽胞桿菌菌株的應用提供參考。

1 解淀粉芽胞桿菌的特點

1.1 解淀粉芽胞桿菌的描述

解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)為芽胞桿菌屬細菌,與枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis) 具有很高的親緣性,二者的革蘭染色均呈陽性,在形態、培養特征及生理生化特性等方面十分相似;解淀粉芽胞菌屬兼性厭氧菌,分布廣,在LB培養基上菌落呈淡黃色、不透明,不產色素,有隆起,表面粗糙,邊緣不規則,在液體靜止培養時能形成菌膜;菌體細胞呈桿狀,具兩端鈍圓的橢圓形內生芽胞,芽胞囊不膨大,中生到次端生,有運動性。

解淀粉芽胞桿菌許多生理生化試驗,例如甲基紅(MR)試驗、硝酸鹽還原試驗、吲哚試驗、乙酰甲基甲醇(V-P)試驗、苯丙氨酸脫氨酶試驗、硫化氫試驗均為陰性,特別是該菌能水解淀粉和明膠[12-13]。

解淀粉芽胞桿菌能承受極端條件,因此其在不同領域包括食品(酶合成、益生元和益生菌以及功能和生物活性食品)、醫藥(抗微生物、抗癌和抗糖尿病)、農業(植物和動物疾病的抑制)、環境(廢物處理和生物燃料)以及其他加工領域具有重要作用;解淀粉芽胞桿菌能水解不同動物和植物產品,合成不同酶、蛋白和碳水化合物,發揮益生元和益生菌的作用,并能產生酶、抗菌劑、殺蟲劑、生化物質、胞外多糖(EPS)、維生素、嘌呤核苷和聚-γ-谷氨酸,其中EPS具有許多功能應用包括抗病毒、抗腫瘤、抗癌、免疫調節和抗氧化活性,其中脂肽(serrawettin、surfactin和viscosin)具有抗微生物、抗病毒、抗炎和抗粘性作用[14]。

1.2 解淀粉芽胞桿菌分離純化、生境多樣性及鑒定策略

解淀粉芽胞桿菌具有豐富的生境多樣性,其分離和鑒定已有許多報道,分離方法包括初篩和復篩,可以利用平板對峙法進行菌體初篩,利用雙層平板法進行復篩;其鑒定采用形態和分子生物學方法,例如16S rDNA序列分子等。

如表1所示,有些菌株能產生廣譜抗菌物質,對細菌、霉菌和酵母菌均具抑制作用,但對不同病原真菌、細菌的抑菌作用強弱不同。已報道從各種環境中,均能分離出解淀粉芽胞桿菌,包括土壤(包括根際土壤)[15-16]、植物(棉籽殼)[17]、動物體(鯽魚腸道)[18]、海水[19]等。筆者[20]曾報道,北大倉白酒大曲具有豐富的細菌多樣性,也存在解淀粉芽胞桿菌。司世飛等[15]從土樣中分離了82種細菌,具體方法為稱取10 g土樣于裝有90 mL無菌水錐形瓶中,搖床震蕩20 min后,采用稀釋涂布平板法將稀釋至10-6和10-7的菌液涂布NA平板,35 ℃恒溫培養箱倒置培養36 h后挑選不同形態的細菌進行純培養并保存于NA斜面,然后再經初篩和復篩獲得具有不同功能的解淀粉芽胞桿菌。努爾孜亞等[17]將1 g棉籽殼加入100 mL蒸餾水中,制備懸濁液,稀釋至10-6、10-7、10-8(W/V) 的樣品溶液,分別取0.1 mL 涂布于固體初篩培養基平板上,30 ℃培養24 h;然后以對峙平板法復篩,從初篩平板上挑取形態不同的菌落在木霉病菌瓊脂塊的一側劃線,以不劃線的作為對照組,培養4 d,測其抑菌率,獲得細菌的純化培養物。朱芝秀等[18]取鄱陽湖野外生長健康鯽魚腸道，60 ℃水浴加熱15 min后，取腸道黏膜劃線接種普通瓊脂平板37 ℃培養24 h，觀察菌落特征，挑取典型菌落，進行革蘭染色、鏡檢，觀察菌體顯微形態特征。挑取經革蘭染色后的單個菌落，劃線接種于普通瓊脂平板進行純培養；將分離菌按常規細菌生化試驗方法接種各種微量生化發酵管，37 ℃生化培養箱培養24～48 h后，觀察記錄生化特性；將分離菌接種普通肉湯培養液，37 ℃生化培養箱培養24 h后，按瓊脂擴散法做藥敏試驗，測量抑菌圈大??；將牛津杯輕放于脫脂奶蔗糖胰蛋白胨瓊脂培養基上，其內加入分離菌肉湯培養物，37 ℃培養24 h 后，觀察溶蛋白現象，同時以培養時間為橫坐標，溶蛋白透明圈直徑為縱坐標，繪制分離菌產蛋白酶曲線圖。筆者從北大倉白酒大曲中分離的解淀粉芽胞桿菌M1-1菌株的純培養物的獲得方法與上述方法類似(研究成果待發表)?？梢娊獾矸垩堪麠U菌在食品、植物、動物、土壤及其他環境中無處不在，具有豐富的生境多樣性，其純化方法大同小異，一般采用稀釋平板法結合平板對峙可以進行有效的分離純化。

表1 解淀粉芽胞桿菌抗真菌活性物質的分離、純化和功能研究

通?？梢砸佬螒B、生理生化特征及分子手段對菌株進行鑒定,但采用16S rDNA分子標記鑒定菌株方法較為多見。實際上除了采用16S rDNA分子標記外,還可結合菌株特異性酶基因擴增進行菌種鑒定,例如Khan等[21]使用16S rRNA基因序列分析并結合物種特異性的限制性核酸內切酶(BamH I)基因和核糖核酸酶基因擴增準確鑒定了解淀粉芽胞桿菌COFCAU_P1。Camacho等[22]從San Pablo河淡水沉積物中分離出一株芽胞桿菌,經16S rRNA基因分析確定該分離株A3屬于解淀粉芽胞桿菌操作群,通過gyrA基因序列系統發育分析鑒定該菌屬于解淀粉芽胞桿菌亞種植物叢。通常使用核糖體RNA小亞基部分(16S)高通量DNA測序鑒定解淀粉芽胞桿菌[23],但有時無法鑒定到亞種水平,而管家基因鑒定解淀粉芽胞桿菌是可行的,如rpoB基因、gyrA基因和gyrB基因等是評估微生物多樣性的潛在候選基因,比用16S rRNA基因分析方法有更高系統發育分析的分辨率;通常每個基因組只有1個或2個管家基因拷貝,與高拷貝數基因相比,使用低拷貝數基因可以避免因不同基因拷貝中的SNPs而高估多樣性,從而實現更準確的鑒定結果[24];事實上,一些研究已經測試rpoB基因和gyrB基因作為分子標記,通過擴增子測序來分析細菌群落的多樣性,在某些條件下持家基因測序比16S rRNA測序能更準確[25-26]。Liu等[27]發現持家基因gyrA也可以作為確定芽胞桿菌物種多樣性的分子標記的潛力,通過引物設計能顯著提高芽胞桿菌物種多樣性的擴增效率;通過新引物對gyrA3的設計,經92種芽胞桿菌和相關物種的檢測,發現gyrA基因高變異性允許在亞種水平上對解淀粉芽胞桿菌、短小芽胞桿菌和巨大芽胞桿菌進行更詳細聚類,而16S rRNA基因無法實現這一點,說明gyrA可以提供比16S rRNA基因更好的系統發育分辨率?？傊?解淀粉芽胞桿菌的生境能使我們深入了解解淀粉芽胞桿菌的生態。了解如何對解淀粉芽胞桿菌進行準確鑒定是一個關鍵的問題,在形態、生態和生理生化的基礎上,采用16S rRNA基因分析和管家基因分析的結合,可提高對解淀粉芽胞桿菌鑒定的可靠性和準確性。

2 解淀粉芽胞桿菌培養條件優化

2.1 解淀粉芽胞桿菌培養基優化

培養基優化是提高解淀粉芽胞桿菌發酵的重要手段。培養基碳源、氮源的篩選,緩沖液甄別、金屬離子和生長因子的選用,是培養基優化應該考慮的重要參數?？梢圆捎脝我蛩?、雙向單因素、正交試驗、Plackett-Burman設計、響應面法等方法優化培養基。騰軍偉等[28]從甜酒曲中篩選到產凝乳酶的解淀粉芽胞桿菌GSBa-1,并采用單因素實驗和響應面法進行培養條件優化,凝乳酶活力比優化前提高1.88倍。

如表2所示,培養基優化可提高解淀粉芽胞桿菌產孢率、抗菌活性和抗菌物合成能力,要根據不同目的優化選擇不同培養基成分。呂釗等[29]采用Box-Behnken試驗及響應面法對解淀粉芽胞桿菌產抗菌素發酵培養基進行了優化,使用遲效碳源淀粉作為碳源,顯著提高了該菌的抗菌活性。梁昌聰等[30]利用Plackett-Burman優化C101菌株培養基,篩選出MnSO4、KHPO3和(NH)2SO4為影響產孢的3個主要因素,再運用最陡爬坡路徑法逼近最大響應值區域,最后利用響應面分析法確定主要因子之間的交互作用及最佳條件,發現尿素是添加的必須物質。楊勝遠等[31]使用蘭迪培養基優化K6菌株培養基發現,KH2PO4、MgSO4和MnSO4能顯著影響抗菌活性物質合成,而KCl不利于抗菌活性物質合成;FeSO4和CuSO4幾乎對抗菌活性物質合成沒有影響。楊代凱等[32]優化了ZM9液體發酵產伊枯草菌素A培養基,采用液化玉米淀粉、豆粕為碳源和氮源,顯著提高了伊枯草菌素A產量。解淀粉芽胞桿菌W36還可以對考馬斯亮藍、剛果紅和Sarranine等染料進行需氧脫色,利用最優化的培養基培養該菌能發揮最好的脫色效果[33]。

表2 解淀粉芽胞桿菌培養基優化

聚乳酸(PLA)是可生物降解塑料,可替代一次性包裝材料和地膜。盡管PLA在浸沒或堆肥條件下的生物降解速度加快,但在土壤埋置條件下提高PLA生物降解能力仍然是一個挑戰。實驗證實在解淀粉芽胞桿菌中,使用大豆蛋白作為氮源可提高其對PLA膜的生物降解能力;控制氮源可能是增加聚乳酸生物降解的新途徑[35]?？梢娪袝r僅僅優化培養基中一種物質,例如氮源,就能使該細菌某種生物功能得到顯著改善。

通過解淀粉芽胞桿菌C10培養基的優化,芽胞產率提高188%。最近有報道顯示,在芽胞桿菌中,孢子形成過程與次級代謝產物的合成和釋放有關,例如次級代謝產物桿菌霉素D(BD)就與解淀粉芽胞桿菌fmbJ的孢子形成相關,研究發現,BD和Mn2+通過刺激kinB、kinD的轉錄以及增加spo0F-spo0A磷酸化傳遞的影響,促進了fmbJ的孢子形成[36]。

優化培養基是提高解淀粉芽胞桿菌產酶活性的最重要策略之一。Zhao等[37]采用平板透明圈法從動物糞便中篩選出蛋白酶產量高的解淀粉芽胞桿菌FMME ZK003。為了實現蛋白酶的高效生產,經過菌種改良再進行培養基優化,蛋白酶活性提高到(456.9±0.23)U/mL,5 L發酵罐發酵解淀粉芽胞桿菌蛋白酶活性達到823 U/mL。甲喹酮-7能預防心血管疾病和骨質疏松癥。Li等[38]通過改良解淀粉芽胞桿菌和培養基優化組合策略提高甲喹酮-7(MK-7)產量。首次通過常壓和室溫等離子體誘變和原生質體融合,改變生物合成途徑,構建MK-7高產菌株Ba-4。隨后,使用單因素優化和響應面法(RSM)優化培養基組分,提高了菌株Ba-4的MK-7產量;響應面法結果表明,甘油、大豆蛋白胨和吐溫-80對MK-7的產生有顯著影響,MK-7產量比初始培養基顯著提高。

可見,解淀粉芽胞桿菌是一種益生菌,它有許多特性可供人們利用。因此,在優化培養基的實驗中,為了達到不同目的必須選擇合適碳源和氮源,去除對發酵不利的或無用的培養基成分,增添對發酵有利的成分,使菌株獲得最佳營養,從而達到不同的優化目的和最佳效果。

2.2 解淀粉芽胞桿菌培養條件優化

培養條件優化一般包括溫度、接種量、轉速、培養時間、初始和裝液量,優化的目的多種多樣,比如增加菌株脂肽、抗性蛋白和抗菌物質等。解淀粉芽胞桿菌脂肽在植物對真菌、細菌和病毒的保護中發揮著重要作用,表現出殺菌、抗菌、抗病毒和殺蟲能力,以及植物免疫調節活性[39]。

如表3所示,王勇等[40]對解淀粉芽胞桿菌GZ-5進行了研究,在發酵條件優化的基礎上,發現用10倍稀釋液、菌懸液原液對番茄的促生效果最佳。解淀粉芽胞桿菌具有廣泛的抑菌活性,其菌體能產生多種抑菌蛋白[41]。秦楠等[42]對菌株HRH317抑菌蛋白生產條件進行了優化,發現37 ℃適合抑菌蛋白表達,發酵時間控制在對數期比較合適,轉速略高較好。裘紀瑩等[43]對解淀粉芽胞桿菌NCPSJ7菌株發酵生產胞外抗菌物質進行了研究,以該菌株發酵液對西瓜枯萎病菌產生的抑菌圈直徑為指標,經單因素試驗、Plackett-Burman設計及Box-Behnken響應面法優化,確定了其最佳發酵條件,優化后顯著提高了發酵液抑菌活性。牛奶凝固酶(MCE)是奶酪生產中的關鍵成分,由于傳統凝固酶的局限性,尋找可行的替代品是一個緊迫的問題[44]。解淀粉芽胞桿菌D4凝固酶的培養時間和搖床轉速是優化培養的關鍵[45]。從上面的研究可以看出,抑菌蛋白和其他抗菌物質生產時,所需溫度應更符合細菌正常生長溫度,而其他抑菌物生產要求較低溫度;同樣,抑菌蛋白形成在對數早期,而其他抗菌物質多在發酵穩定期和后期,這可能是其他抗菌物多為細菌次生代謝產物,因而多在細菌生長的穩定期或衰亡期,即發酵后期產生?？梢?不同解淀粉芽胞桿菌對培養基成分及培養條件要求不同,但是總體來說維持在一定的范圍內,不同的培養基,其培養溫度一般為25～37 ℃,pH為偏中性,搖床轉速140～241 r/min;培養時間24～60 h為宜。蛋白酶作為一種重要的工業酶,一般從微生物中獲得的蛋白酶活性并不高,難以滿足工業化生產。Zhao等[46]采用平板透明圈法從動物糞便中篩選出蛋白酶產量高的解淀粉芽胞桿菌,通過常壓室溫等離子體(ARTP)、60Co-γ輻射進行聯合誘變,菌株FMME ZK003蛋白酶活性大幅度提高,優化發酵條件后,蛋白酶活性顯著提高;最后,5 L發酵罐發酵使蛋白酶活性達到823 U/mL?？梢?了解優化數據,可能找出一定的規律,按相關的實驗方法進行優化,可能達到最佳的效果。

表3 解淀粉芽胞桿菌培養條件的優化

2.3 解淀粉芽胞桿菌培養基和培養條件的同時優化

對培養基和培養條件同時優化的目的是為了提高解淀粉芽胞桿菌活菌數,增強抑制病原菌活性,提高次生代謝產物產量,提高菌種產酶活性,增加胞外多糖產量以及凈化水質等,可采用單因素和正交試驗進行優化。

如表4所示,在優化解淀粉芽胞桿菌T1發酵條件之前,從五種培養基中選出最有利于其生長的發酵培養基,加入復合氨基酸營養液和蜜糖作為培養基的必要成分[47],不同菌株最佳發酵參數不同。FS6菌株能抑制人參立枯絲核菌,需添加酵母浸膏和甘油作為最優培養基的必要成分,培養12 h,相對培養時間較短[48]。12-7菌株對棉花黃萎病菌大麗輪枝菌具有明顯拮抗作用,經優化其抗菌蛋白抑菌活性明顯提高[49]。GZUB-7菌株可產中性蛋白酶,優化后中性蛋白酶活力明顯提升[50]?？梢?對不同菌株培養基的優化的目的不同,如為了提高菌體數、提升抑菌活性、提高產蛋白酶的能力等。芽胞桿菌能分泌高分子量和結構多樣的胞外多糖(EPS)以抵抗環境壓力,EPS由于其高水溶性和截留率,在食品工業中被廣泛用作增稠劑和乳化劑,其具有降低膽固醇、抗腫瘤和調節免疫能力的作用[51]。解淀粉芽胞桿菌DMBA-K4可生產胞外多糖,添加蔗糖可優化發酵培養基,使胞外多糖產量達 171.31 mg/L,較原始條件提高155.7%;抗氧化實驗結果表明,DMBA-K4 所產胞外多糖具有較強的抗氧化活性,當EPS質量濃度為5 mg/mL時,其 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 自由基清除率達78.6%,對·OH 的清除率為75.47%,該研究為微生物胞外多糖的工業生產提供理論支持,豐富了新型微生物多糖的應用前景[52]。HN菌株培養基及培養條件優化后,采用100 L發酵罐對優化發酵參數進行了驗證,在9 h后進入對數生長期,24 h后達到穩定期,菌液濃度達35.6×108cfu/mL,最高芽胞濃度達到30.4×108cfu/mL;100 L發酵罐驗證試驗表明,37 ℃發酵26 h活菌濃度可達 37.0×108cfu/mL,芽胞濃度為33×108cfu/mL[53]。

解淀粉芽胞桿菌能產生多種多樣的生物酶,Shang等[55]從健康藏豬的糞便中分離一株能產纖維素酶的解淀粉芽胞桿菌TL106,經基因組測序分析發現,其包括β-葡萄糖苷酶、內切葡聚糖酶、β-葡聚糖酶和木聚糖酶基因,并探索了其纖維素降解能力,發現其發酵上清液含淀粉酶、纖維素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶,這些酶對小麥和青稞粗纖維、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、淀粉、阿拉伯木聚糖和β-葡聚糖均具有較好的降解效果。解淀粉芽胞桿菌L-S60有較寬酸堿耐受性,能產多種酶,包括蛋白酶、纖維素酶和淀粉酶,對多種病原真菌有抑制作用,王卉等[56]優化了L-S60固態發酵工藝,其最佳固體培養基組成的質量分數比為花生餅粉∶麥麩∶棉粕為53∶35∶12;最佳固體發酵條件為溫度35 ℃、接種量30%(體積分數)、料水質量比1∶0.45、裝瓶量40%,發酵時間42 h;L-S60菌落數達2.42×1010cfu/g。顯然,研究解淀粉芽胞菌酶的合成的優化對應用是十分有意義的。

從上述報道可以總結出下列規律：發酵中添加可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖為碳源,添加胰蛋白胨、花生餅粉、尿素、豆粕、牛肉膏、酵母膏作為氮源能得到良好的發酵效果;磷酸鹽可作為最佳緩沖溶液,加入適當Mn2+和 Ca2+有助于芽胞形成。對于培養條件而言,發酵溫度一般控制在28～40 ℃之間,30 ℃左右比較普遍;初始pH在6.0～7.3之間,一般控制在7.0左右比較適宜;轉速在150～180 r/min之間;接種量一般在3%～6%(體積分數)范圍內;裝液量(50～100) mL/250 mL比較合適;發酵時間跨度較大在12～60 h之間,但25～30 h內比較普遍。了解上述規律,可在優化發酵培養條件時作為必要參考。

3 解淀粉芽胞桿菌其他優化方法

近年來,隨著對解淀粉芽胞桿菌研究的不斷深入,出現了培養基、培養條件優化的新方法,包括多參數優化、結合BP神經網絡優化、自適應神經網絡訓練優化等。

3.1 解淀粉芽胞桿菌多參數優化

王濤等[57]以平板菌落直徑、培養后活菌濃度為指標,對解淀粉芽胞桿菌841種子保存、活化方式和發酵培養基中酵母粉和大豆蛋白粉用量,以及發酵后期調控進行篩選和優化。研究發現,841菌株最佳保存條件為甘油30%,溫度-64 ℃,先采用PDA活化,并經過一次48 h活化和24 h二次活化效果最佳;種子培養后17～18 h進行轉菌為最佳時間,酵母粉和大豆蛋白粉最佳濃度分別為20、40 g/L;通過補料和流加氨水將pH控制在7.0～7.2作為發酵后期調控方法;發酵時間可延長至72 h;在100 L發酵罐上進行高密度發酵,濃度可達常規發酵的100倍。多參數優化需要進行幾次,最終才能達到很好的效果。

3.2 解淀粉芽胞桿菌BP神經網絡優化

BP神經網絡由Rumelhart和McClelland提出,是一種按照誤差逆向傳播算法訓練的多層前饋神經網絡。周廣麒[58]為了提高解淀粉芽胞桿菌抑菌活性,運用響應面法優化了Q-426發酵培養基組分,并利用BP神經網絡對抑菌活性進行了研究,優化后培養基最佳配方(g/L)：葡萄糖3.92、牛肉膏5.00、NH4Cl 0.19、MgCl23.83,并以此作為輸入數據,將抑菌活性作為輸出數據,建立BP神經網絡預測模型。結果表明,優化后抑菌圈直徑由24 mm增加到29 mm,并計算訓練BP神經網絡抑菌圈直徑擬合值與實際值之間相對誤差、相對誤差絕對值的平均值,同時,計算測試BP神經網絡抑菌圈直徑預測值與實際值相對誤差、相對誤差絕對值的平均值,最后證實建立基于培養基成份的抑菌圈直徑BP神經網絡預測模型是可行的?？梢?利用BP神經網絡優化方法能更準確、更方便地找到最佳培養基優化方案。

3.3 解淀粉芽胞桿菌BP神經網絡與適應神經網絡訓練比較

劉爽等[59]運用響應面法優化共培養的解淀粉芽胞桿菌Q426和Q-12培養基,確定優化培養基組成(g/L)：MgSO4·7H2O 0.91、檸檬酸鈉3.31、酵母粉16.10、NH4Cl 2.0、K2HPO41.5及KH2PO40.6,優化后抑菌圈直徑由27 mm增加到31 mm;再以培養基組成作為輸入數據,將抑菌圈直徑作為輸出數據,建立了基于BP神經網絡和自適應神經網絡的訓練模型,通過比較訓練結果均方誤差和平均相對誤差,證明了自適應神經網絡訓練效果優于BP神經網絡的訓練效果?？梢?隨著計算機網絡模型的應用,勢必會簡化優化程序,獲得簡單易行的優化手段。

4 解淀粉芽胞桿菌重要的工業和商業化產品的應用

微生物殺菌劑就是利用微生物及其代謝產物開發的一類殺菌劑。解淀粉芽胞桿菌可以定植在植物根際,繁殖迅速,對多種植物病原菌具有良好的抑制效果。如表5所示,解淀粉芽胞桿菌作為殺蟲劑在國內應用較少,國外特別是德國的巴斯夫(BASF)和 美國Certis應用較早、較成熟,產品較多。國內幾乎沒有種衣劑的登記,國外已開始將微生物作為種子處理的一種新手段,就解淀粉芽胞桿菌而言,美國和德國已經取得若干種子處理劑的登記。隨著對解淀粉芽胞桿菌及其產生的有效抗菌物質的深入研究,其生防優勢越來越明顯,并展現出廣闊的應用前景。但是,與國際前沿相比,我國在對解淀粉芽胞桿菌的研究還有待進一步深入,產業開發也有待進一步加強。

表5 解淀粉芽胞桿菌重要的工業和商業化產品的應用[60-61]

5 展 望

解淀粉芽胞桿菌是FDA認定的安全級(GRAS)菌株,在綠色生物農藥、工業酶制劑、大宗化學品等生產上具有突出優勢。解淀粉芽胞桿菌培養成本低、發酵產物穩定等特點使其具有成為生防菌劑的優勢,其能促進農作物生長,防治作物病害,改善土壤環境;應用于農業能消除化學農藥帶來的土壤營養失衡、農產品質量下降等弊端,符合現代農業的發展要求。解淀粉芽胞桿菌也是一類能夠合成多種生物活性化合物如抗菌蛋白、酶、脂肽、氨基酸、核苷酸和胞外多糖等重要的平臺化微生物,在工業、食品、醫療和日化等領域具有重要應用價值。

截至目前,國內關于解淀粉芽胞桿菌的抗菌物質研究主要集中在目標菌株的篩選,以及抗菌成分的分離、純化、鑒定、培養基和培養條件優化以及抗菌物質的表征和作用機理上。芽胞桿菌產生的抗菌物質雖然很多,但單一抗菌成分的收率低,純化工藝復雜,難以滿足農業、工業、食品等行業對抗菌物質日益增長的需求。因此,尋找合適的方法同時提高抗菌物質的產量和使用效率是未來研究和開發的重要方向。

針對解淀粉芽胞桿菌開展更多產物的人工合成通路設計和代謝網絡重構、底盤的適配性組裝與優化等,將進一步豐富該底盤菌株在生物工程領域中的運用;隨著分子生物學等高新技術的發展,解淀粉芽胞桿菌的鑒定必將更加科學、快捷和準確,解淀粉芽胞桿菌發酵培養工藝也必然日臻完善;隨著更先進的基因工程、蛋白質工程及發酵工程等手段用于解淀粉芽胞桿菌的細胞改造和發酵優化,解淀粉芽胞桿菌的應用必將有更好的前景。