LncRNA H19調控腎小球足細胞焦亡中作用

汪樂新 劉超 馬天龍 楊安寧，3 熊建團，3 吳凱，3焦運 白志剛，3 姜怡鄧，3 馬勝超，3 張旭 盧冠軍，

寧夏醫科大學1臨床醫學院，2基礎醫學院（銀川 750004）；3國家衛生健康委員會代謝性心血管疾病研究重點實驗室（銀川 750004）；4寧夏醫科大學總醫院泌尿外科（銀川 750004）；5中國人民解放軍總醫院泌尿外科（北京 100000）

糖尿病腎病是一種嚴重的微血管病變，早期癥狀不明顯，隱匿性發展，中晚期發病率占糖尿病整體的20%～40%，具有較高致死率及致殘率，也是全世界范圍內導致終末期腎病、腎功能衰竭的主要病因之一［1］。目前治療糖尿病腎病的手段較依賴血液透析、腹膜透析、腎臟代替治療（腎移植）等，對于糖尿病腎病的治療還沒有特效的方法，且個體差異度大。因此需要深入對糖尿病腎病的發病機制進行深入探究，以便尋找更優化的治療手段［2］。長非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）是一類具有多種層面調控基因表達且不具備蛋白編碼功能的RNA，在真核細胞中lncRNA 調控基因表達方式多種多樣，如轉錄調控因子上調或下調基因表達、通過調控DNA 甲基化或組蛋白修飾、染色質重構致基因表達或沉默，進而調控細胞增殖、焦亡及細胞周期變化，其異常轉錄可引起下游通路和蛋白異常表［3-4］；lncRNA H19是長非編碼RNA 中的一種，據有關文獻研究表明，lncRNA H19 參與多種疾病的進展，例如糖尿病和心肌心力衰竭等方面的相關疾?。?-4］。已有研究證明［5-6］，lncRNA H19 可通過PI3K/AKT 通路抑制HIBD 新生大鼠心肌細胞凋亡；沉默lncRNA H19 通過靶向上調調控miR-214 的表達，抑制Caspase-1表達，達到抑制心肌細胞凋亡和炎癥反應，減輕心力衰竭癥狀。喬家明等［7］研究發現，LncRNA H19通過Wnt/β-catenin/OSX 軸調節動脈鈣化。徐靜琳等［8］研究發現，過表達LncRNA H19 能夠靶向調控細胞凋亡相關蛋白及細胞自噬相關蛋白表達，從而對糖尿病腎病足細胞起到保護作用。鑒于越來越多學者關注到lncRNA H19 異常表達是影響腎足細胞活性關鍵因素之一，而lncRNA H19 異常表達引起腎足細胞焦亡損傷罕見報道［9-10］。本研究以在高糖因素影響下的lncRNA H19 誘導腎足細胞焦亡為主軸，闡明lncRNA H19 具有調控腎足細胞焦亡表達，為深入研究糖尿病腎病的發生發展提供一定實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 小鼠腎臟足細胞株（MPC-5）（中國深圳華拓生物有限公司）；DMEM 培養基、胎牛血清（美國Gibco 公司）；葡萄糖粉末（中國天津大茂化學試劑廠），蛋白提取試劑盒（中國上海凱基生物技術有限公司）；NLRP3、Caspase-1、IL-1β 和β-actin 抗體（英國Abcam 公司）；總RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、熒光PCR 試劑盒（中國北京天根公司），LncRNA 上下游引物（中國上海生物生工程公司）合成；蛋白上樣緩沖液（上海碧云天有限公司）；化學發光顯色劑（中國新賽美公司）；細胞計數儀（德國Eppendorf 公司）；便攜迷你離心機購買于Eppendorf 公司；純水儀（美國Millipore 公司）；共聚焦細胞培養皿（德國賽默飛公司）；激光共聚焦顯微鏡（德國ZEISS 公司）；電泳儀、電轉儀、Model680 全自動酶標儀（美國BioRad 公司）；超凈工作臺（中國蘇州安泰有限公司）；CO2培養箱和5415D 型微量臺式離心機（美國Eppendorf 公司）；制冰機（美國AF10 SCOTSMAN 公司）。

1.2 細胞模型建立與分組 用含有10%體積的胎牛血清的DMEM 培養液培養腎足細胞（MPC5），置于37 ℃、5%CO2濃度培養箱中，2 d 傳代1 次，取對數增長期，第3 ～ 4 代用于實驗，取生長狀態良好，密度適中的MPC5 分別在30 mmol/L HG 干預足細胞48 h 因此當細胞密度達到70%干預細胞，以終濃度為0 mmol/L 為Control 組，以終濃度為30 mmol/L為HG 組，分別干預48 h 后收集細胞以便后續相關實驗。

1.3 細胞轉染與分組 根據LipofectamineTM2000說明書將Ad-lncRNA H19 及si-lncRNA H19 轉染腎足細胞中。轉染Ad-lncRNA H19 后Western blot 分組為對照組（不做處理）、高糖組、lncRNA H19 過表達對照+高糖組、lncRNA H19 過表達+高糖組，轉染si-lncRNA H19 后Western blot 分組為對照組（不做處理）、高糖組、lncRNA H19 干擾對照+高糖組、lncRNA H19 干擾+高糖組；轉染Ad lncRNA H19 及si lncRNA H19 后qRT-PCR 分組為對照組（不做處理）、lncRNA H19 過表達陰性對照組、lncRNA H19 過表達組；對照組（不做處理）、lncRNA H19 干擾對照組和lncRNA H19 干擾組（si-lncRNA H19-1、si-lncRNA H19-2、si-lncRNA H19-3），轉染前1 d，在250 μL 的DMEM 培養基中接種2 × 105個細胞。A 液：250 μL DMEM 純培養基與Ad-lncRNA H19、si-lncRNA H19 5 μL 混合，吹打2～3 次混勻。B 液：250 μL DMEM純培養基與6 μL LipofectamineTM2000 混合，吹打2～3 次混勻，靜置5 min。A 液加B液混勻吹打2～3次，于室溫下靜置20 min。加入3.5 mL 純培養基混勻。將培養瓶置于37 ℃，5%CO2培養箱中培養，8 h 后更換培養液，HG 干預48 h 后收細胞，以便進行后續其他實驗。

1.4 用qRT-PCR 方法檢測lncRNA H19的mRNA的表達 根據總RNA 試劑盒說明書提取各組腎足細胞的總RNA，通過NCBI 查詢lncRNA H19 的ID 序列號，經Gene Bank 查詢上下游引物序列，委托上海生物生工公司合成lncRNA H19 上游引物：5'-GAACAGAAGCATTCTAGGCTGG-3'下游引物5'-TTCTAAGTGAATTACGGTGGGTG-3'逆轉錄反應體系：Prime SCript Buffer For Real Time 2 μL、Oligo Diprimer 1 μL、Random 1 μL、Prime Script RT En-Lyme MlxI 1 μL、H2O 與RNA 總體積13 μL、PCR反應體系：TB Green 10 μL、上下游引物各0.8 μL、H2O 6.4 μL、逆轉錄產物2 μL 熒光定量PCR 擴增：95 ℃30 s、95 ℃5 s、60 ℃34 s，共45 個循環，以小鼠GADPH 內參為對照，目的基因擴增后，通過目的基因相對量公式分析2-△△Ct，△△Ct =［Ct 目的基因（待測樣本）-Ct GAPDH（待測樣本）］-［Ct 目的基因（校正樣本）-Ct GAPDH（校正樣本）］。

1.5 用Western blot 檢測NLRP3、Caspase-1、IL-1β、Nephrin、Podocin 蛋白表達 收刮足細胞，5 000 r/min 離心5 min，棄上清，根據凱基蛋白提取試劑盒說明書提取總蛋白，用BCA 法測定濃度定量，加50 mL 蛋白上樣緩沖液，金屬浴99 ℃煮沸5 min 變性，經SDS-PAGE 凝膠電泳90 V 20 min，120 V 30 min 濕轉2 h 轉移至PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，用稀釋比1∶1 000 的兔抗NLRP3、兔抗Caspase-1、兔抗IL-1β、兔抗Nephrin 及兔抗Podocin抗體4 ℃孵育過夜，PBST 液洗膜3 次，每次10 min，用稀釋比1∶1 000 的兔二抗孵育2 h，PBST 液洗膜3 次，每次10 min，通過Image Lab 圖像分析進行掃描采取圖像，以β-action 為內參，計算NLRP3、Caspase-1、IL-1β、Nephrin、Podocin 與β-action 內參灰度值的比值做定量分析。

1.6 免疫熒光檢測NLRP3、Caspase-1、IL-1β 蛋白表達 細胞傳代時把生長狀態良好的細胞，鋪到共聚焦小皿中，密度適中，干預48 h 后收取共聚焦小皿，PBS 液清洗小皿，3 次5 min，4%的多聚甲醛固定細胞30 min，PBS 清洗3 次5 min，0.2%TritonX-100 溶液通透20 min，PBS 3 次5 min，山羊血清封閉30 min，1∶100 配置NLRP3、Caspase-1 及IL-1β 抗體，4 ℃過夜孵育，隔天取出小皿，PBS 3 次5 min，加熒光488 標記綠光二抗，37 ℃1 h 避光孵育二抗，PBS 3 次5 min 后，加入DAPI 液避光孵育5 min ，PBS 清洗3 次5 min 清，封片淬滅劑封片后用激光共聚焦采取圖像。

1.7 過表達及干擾lncRNA H19 對高糖誘導足細胞焦亡的影響 為進一步探討lncRNA H19 對高糖誘導足細胞焦亡是否有調控作用，轉染Ad lncRNA H19 及si lncRNA H19 后qRT-PCR 分 組：（1）對照組（不做處理）、lncRNA H19 過表達陰性對照組、lncRNA H19 過表達組；（2）對照組（不做處理）、lncRNA H19 干擾陰性對照組和lncRNA H19 干擾組（si-lncRNA H19-1、si-lncRNA H19-2、si-lncRNA H19-3）采用qRT-PCR 檢測lncRNA H19的mRNA表達水平；轉染Ad-lncRNA H19后Western blot 分組；（3）對照組（不做處理）、高糖組、lncRNA H19 過表達對照+高糖組、lncRNA H19 過表達+高糖組；轉染si-lncRNA H19 后Western blot 分組；（4）對照組（不做處理）、高糖組、lncRNA H19 干擾對照+高糖組及lncRNA H19 干擾+高糖組，采用Western blot 方法檢測NLRP3、Caspase-1、及IL-1β蛋白表達水平。

1.8 統計學方法 使用Graphpad Prism 8.0 軟件進行統計，實驗數據均為計量資料，用均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多樣本比較采用單因素方差分析，P<0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HG 誘導足細胞損傷與LncRNA H19 表達情況 為了探討lncRNA H19 在高糖中表達情況，采用qRT-PCR 方法檢測lncRNA 的mRNA 表達水平，結果發現，與對照組相比lncRNA H19 表達降低，兩組間比較差異均有統計學意義（P< 0.05），結合相關實驗分析，在高糖誘導足細胞損傷時lncRNA H19 表達水平降低，見圖1。

圖1 lncRNA H19 在高糖干預足細胞中低表達Fig.1 LncRNA H19 is low-expressed in high-glycemic intervention podium

2.2 HG誘導腎足細胞中NLRP3、Caspase-1及IL-1β 蛋白表達情況 為了探討高糖致足細胞焦亡影響，采用Western blot 方法檢測焦亡相關蛋白NLRP3、Caspase-1 及IL-1β 表達水平。結果顯示，與對照組相比高糖組中NLRP3、Caspase-1 及IL-1β蛋白水平明顯增加，兩組間比較差異均有統計學意義（P< 0.05），提示高糖可誘導足細胞發生細胞焦亡，見圖2。

圖2 HG 引起焦亡相關蛋白Caspase-1、NLRP3、IL-1β 表達水平增加（40×）Fig.2 HG causes increased expression levels of Caspase-1，NLRP3 and IL-1β related proteins（40×）

2.3 HG 誘導腎足細胞中Nephrin、Podocin 蛋白情況 為了探討高糖干預刺激下損傷腎足細胞，采用Western blot 方法檢測腎足細胞中結構性相關蛋白Nephrin、Podocin 表達水平，結果發現，與對照組相比，高糖組中Nephrin、Podocin 蛋白表達水平降低，兩組間比較差異均有統計學意義（P<0.05），提示高糖可誘導足細胞發生損傷。見圖3。

圖3 HG 引起腎足細胞結構性相關蛋白Nephrin 及Podocin 表達降低Fig.3 HG causes decreased expression of Nephrin and Podocin proteins related to nephrocytes

2.4 過表達及干擾lncRNA H19 對高糖誘導足細胞焦亡的影響 結果提示，轉染Ad-lncRNA H19后，與lncRNA H19 過表達陰性對照組相比lncRNA H19 mRNA 表達上調（P< 0.05），與lncRNA H19 過表達對照+高糖組相比，焦亡相關蛋白NLRP3、Caspase-1、IL-1β 表達水平降低（P<0.05）；轉染silncRNA H19 后，與lncRNA H19 干擾陰性對照組相比，lncRNA H19 mRNA 表達下調（P< 0.05），且silncRNA H19-2 干擾效果最佳，與lncRNA H19 干擾對照+高糖組，焦亡相關蛋白NLRP3、Caspase-1、IL-1β 表達水平增高（P< 0.05），提示lncRNA H19具有調控焦亡相關蛋白表達作用，過表達lncRNA H19 后降低焦亡相關蛋白水平表達保護腎足細胞，而干擾lncRNA H19 后細胞焦亡相關蛋白水平表達增高，損傷腎足細胞，見圖4。

圖4 LncRNA H19 調控焦亡相關蛋白NLRP3、Caspase-1、IL-1β 表達水平Fig.4 LncRNA H19 regulates the expression levels of coke-dead-related proteins NLRP3，Caspase-1，and IL-1β

3 討論

隨著糖尿病的發病率、致死率逐年增加，而糖尿病腎病是以長期高血糖，慢性腎功能損傷為特征的嚴重微血管病變，作為糖尿病患者致殘、致死中重要因素之一，其探究糖尿病腎病的致病機制成為目前研究的熱點［11］。而糖尿病腎病的發病機制尚不清楚，且其無特效的治療手段，為了尋找更好的治療手段，需更加深入探究糖尿病腎病的發病機制［12］。

近年來有關學者認為，細胞焦亡作為一種新型的程序性死亡方式，常伴隨慢性炎癥的發生，細胞焦亡的炎性因子過度激活可能是糖尿病腎病重要的發病機制［13］。據有關文獻報道提示［11］：糖尿病腎病發展過程中伴隨大量炎性因子的釋放，當抑制RHoA/ROCK1/NF-κB 信號通路，有效降低下游炎性因子表達，而益腎化濕顆粒能夠有效的抑制RHoA/ROCK1/NF-κB 信號通路的過度激活，拮抗糖尿病腎病炎癥損傷，從而改善腎功能，減緩糖尿病腎病進程。丁寶珠等［12］研究發現，NLRP3-Caspase-1-GSDMD 是細胞焦亡經典通路，在高糖誘導損傷過程中導致胞內細胞活性氧（reactive oxygen species，ROS）異常增加，增加傳遞信號的模式識別受體，如NOD 樣受體蛋白3（NOD-like erceptor protein 3，NLRP3）炎癥小體激活，引起下游凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）表達增加并活化半胱氨酸蛋白酶-1（caspase-1），切割焦亡效應物Gasdermin D（GSDMD）穿透細胞膜形成孔道，內容物釋放導致IL-1β 炎癥因子損傷腎足細胞［12-13］，而SJTR（腎消解毒通絡方）可有效阻斷NLRP3-Caspase-1-GSDMD經典途徑激活，抑制細胞焦亡發生。毛彥穩等［13］發現，NEDD4L（泛素連接酶）與Caspase-11 蛋白結合，在泛素化降解Caspase-11 蛋白表達活性減輕細胞焦亡損傷的同時，又能夠抑制EMT（上皮間質轉化）以及ECM（細胞外基質）沉積，緩解由細胞焦亡損傷引起的糖尿病腎病進展。左熠等［14］報道指出，高糖作為一種危險因素，其可誘導腎足細胞焦亡、自噬、凋亡、氧化應激發在，且可能與MALAT1/NRF2/miR-200c 信號通路有關，而恰巧的是，阿托伐他汀作為一種能有效抑制細胞焦亡，拮抗炎性的藥物通過MALAT1/NRF2/miR-200c 信號通路抑制下游焦亡炎性因子釋放，而本文研究發現，在高糖模型中腎結構蛋白Nephrin、Podocin 低表達，而焦亡相關指標NLRP3、Caspase-1 及IL-1β 表達水平增加，表明焦亡炎癥因子的過度激活是損傷腎足細胞正常生理功能導致糖尿病腎病的原因之一［15-23］。近年來，越來越多的學者認為，在糖尿病腎病中細胞焦亡是一個誘導疾病加重的因素，是研究緩解細胞焦亡是緩解腎功能損傷的重要環節，而藥物可明顯緩解糖尿病腎病的進展，如阿托伐他汀、腎消解毒通絡方、益腎化濕顆粒等，為進一步研究糖尿病腎病的相關發病機制及臨床診斷、治療提供方向及基礎［23-26］。張靜等［15］在基因層次研究發現，高糖可誘導足細胞焦亡、足細胞自噬及足細胞凋亡發生，而miR-29a 可以直接靶向下調調控足細胞凋亡、焦亡并且上調足細胞自噬，足細胞自噬表達過度激活拮抗足細胞焦亡、凋亡的炎性損傷，從而保護腎臟。但是鮮有報道lncRNA H19 在糖尿病腎病中是否具有調控細胞焦亡炎性表達作用，緩解糖尿病腎病的進展。故推測lncRNA H19 在基因層面上可能具有一定調控細胞焦亡的功能，這值得進一步深入探討。

據有關文獻報道，lncRNA 是一類長度大于200 個核苷酸的非編碼RNA，廣泛參與人體生理調節，參與細胞增殖、分化、焦亡、凋亡等生物學過程，在調控疾病發生發展均發揮著重要作用［26］。有關文獻報道，lncRNA H19 在許多疾病均有調控功能，且在疾病中扮演的重要角色及其發病機制，例如GUO 等［27］發現，在脊髓缺血在灌注損傷中，lncRNA H19 通過海綿吸附作用鉚釘miR-181a-5p并增加下游靶基因HMGB1（高遷移率族蛋白1）表達，促進細胞核轉錄翻譯，加速分泌炎癥因子，促進神經元細胞焦亡發生發展，過表達lncRNA H19后有效抑制HMGB1 蛋白分泌，緩解神經元細胞焦亡。QU 等［28］發現，視網膜缺血在灌注時lncRNA H19 是I/R 誘導小膠質細胞焦亡炎的關鍵，且lncRNA H19 在視網膜缺血在灌注中呈低表達，炎性因子NLRP3 呈高表達，提示在視網膜缺血在灌注損傷中lncRNA H19 與炎癥因子NLRP3 存在負相關性，共同加速疾病進展發生［29］。張學麗等［29］報道，心肌梗死是威脅中老年人健康主要疾病之一，而lncRNA H19 在MI（急性心肌梗死）中異常表達，而lncRNA H19 與NGF（分泌神經生長因子）表達具有一定關聯性，lncRNA H19 在MI 中呈高表達，沉默H19 降低NGF 可明顯抑制MI 后的心律失常。不僅如此，在大部分腫瘤進展過程中lncRNA H19促進癌癥增殖、遷移，例如MA 等［30］發現，lncRNA H19 在卵巢癌表達增加，增加卵巢癌的增殖。張學麗等［31］研究發現，LncRNA H19 可促進肺癌增殖、遷移和上皮-間質轉化。截至目前報道當中，在其他疾病報道較多，如心血管疾病等，但在糖尿病腎病進展過程中lncRNA H19 調控細胞焦亡研究報道較少［31-32］。目前研究發現，lncRNA H19 充當明星標記，在眾多疾病具有表達調控作用，故猜測lncRNA H19 在腎臟中也有一定調控作用［32-35］。實驗研究結果顯示，lncRNA H19 的表達水平可作為誘導或緩解腎足細胞細胞焦亡的一種調控標志，在高糖細胞模型中，lncRNA H19 在高血糖損傷腎足細胞時表達降低，與腎足細胞結構蛋白Nephrin、Podocin 表達呈正相關性，且又對細胞焦亡相關蛋白NLRP3、Caspase-1 及IL-1β 蛋白水平表達呈負相關性，提示：lncRNA H19 在糖尿病腎病疾病中存在差異表達，而lncRNA H19 的低表達可能通過促進細胞焦亡方式損傷腎足細胞，進而加重糖尿病腎病發生發展［36-39］。利用AdRNA 上調lncRNA H19 表達后，抑制炎性釋放，NOD 樣受體蛋白3 炎癥小體（NLRP3）激活減少，下游凋亡相關斑點樣蛋白激活減少，導致活化半胱氨酸蛋白酶-1（caspase-1）活性降低，引起IL-1β炎癥因子釋放減少，焦亡相關蛋白NLRP3、Caspase-1、IL-1β 蛋白水平表達下降保護腎足細胞，利用siRNA 下調足細胞系中lncRNA H19 后，促進炎性釋放，NOD 樣受體蛋白3 炎癥小體大量激活，激活活化半胱氨酸蛋白酶-1（caspase-1）活性大量增多，炎癥因子大量釋放導致細胞焦亡相關蛋白NLRP3、Caspase-1及IL-1β 表達水平增高，正常細胞生理功能受到損害，加速糖尿病腎病發生發展［40-42］。實驗結論也證實了腎足細胞損傷是發生糖尿病腎病的基礎，而lncRNA H19 作為一種具有調控腎足細胞焦亡的長非編碼RNA，以NLRP3-Caspase-1-IL-1β 焦亡通路為主軸參與調控，增加lncRNA H19 表達有效降低細胞焦亡炎性因子釋放，降低lncRNA H19 則促進細胞焦亡炎性因子的釋放，lncRNA H19 可調控細胞焦亡表達，同時作為一種新型預測糖尿病腎病手段，又為臨床治療糖尿病腎病提供一種潛在的新方法。

綜上所述，lncRNA H19 與糖尿病腎病中生物學行為調節存在密切相關性［42-43］。且本文首次通過探究lncRNA H19 可調控細胞焦亡相關蛋白NLRP3、Caspase-1 及IL-1β 表達水平，緩解糖尿病腎病進展，為本研究中最大創新點，首次揭示lncRNA H19 可作為糖尿病腎病新型標志物，但是考慮本研究條件有限，有一定局限性，無動物模型驗證lncRNA H19 調控腎足細胞焦亡，且lncRNA H19是否還存在海綿吸附調控下游miRNA 介導加重糖尿病腎病病情發展，lncRNA H19 的異常表達是否還會引起腎足細胞鐵死亡、胞葬等加重疾病進展，這仍需進一步通過動物實驗進行補充論證深入探討，同時這也為深入研究lncRNA H19 引起腎足細胞焦亡提供新的實驗依據［44-46］。