應激誘導磷蛋白1可能通過調節Cx43表達影響低溫缺血再灌注后心室肌電傳導

安麗 高鴻 劉艷秋 鐘毅 曹瑩 易菁 劉旸佟睿 潘志軍 王圣釗 吳昊 劉美言

1貴州醫科大學麻醉學院（貴陽 550004）；2貴州醫科大學附屬醫院麻醉科（貴陽 550004）；3貴州醫科大學轉化醫學研究中心（貴陽 550025）；4貴陽市第四人民醫院麻醉科（貴陽 550007）

再灌注心律失常（reperfusion arrhythmia，RA）是心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）后較為常見的并發癥之一［1］。我們前期研究發現［2］，低溫缺血再灌注后，RA 的發生與心肌細胞間縫隙連接通道的連接蛋白43（connexin 43，Cx43）表達減少有關，但Cx43 下調的機制尚不明確。文獻報道大部分在內質網合成的初生肽蛋白，需借助分子伴侶完成折疊與組裝，初生肽蛋白最初與分子伴侶熱休克蛋白40（heat shock protein 40，HSP40）和熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）形成復合物，通過應激誘導磷蛋白1（stress induced phosphoprotein 1，STIP1）與熱休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）結合后完成折疊組裝［3］，HSP90 可與Cx43 結合，發揮心臟保護作用［4］，而未折疊或錯誤折疊的Cx43 易被泛素化降解［5］。另有研究［6］表明STIP1 在缺氧處理的心肌細胞中低表達，而STIP1 基因敲除的小鼠可致胚胎死亡［7］，這表明該分子是必不可少的輔助伴侶。然而，RA 的發生及心肌細胞Cx43 蛋白的下調是否與STIP1 有關，目前未見相關報道。本研究通過建立大鼠Langendroff 離體心臟灌注模型，采用Mapping Lab 矩陣式電生理標測系統及Western blot 和免疫組化檢測STIP1、Cx43 蛋白表達和分布，探究STIP1 通過調節Cx43 表達影響低溫缺血再灌注后心室肌電傳導的機制，為尋求防治RA 的新靶點提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及模型制備 本研究已獲貴州醫科大學動物倫理委員會的批準（審核批號：NO.2200996）。選擇體質量250 ～ 350 g，健康清潔級2～3月齡雄性SD 大鼠16 只，腹腔注射3%肝素3 125 U/kg 進行抗凝10 min 處理后，再腹腔注射1%的戊巴比妥鈉0.4 mL/100 g 完成麻醉，待麻醉生效之后，開胸迅速取出心臟，并置于4 ℃的K-H 液（mmol/L：NaCl 118、CaCl21.26、KCl 4.5、MgSO4·7H2O 1.22、KH2PO41.18、C6H12O611.1、NaHCO324.99、pH 值7.4）中，沖洗主動脈內的殘留血液，顯露并修剪主動脈后，固定主動脈于IH-SR，844 型Langendorff 灌注裝置（德國HUGO SACHS ELEKTRONIK-HARVARD APPA RATUS GmbH D-79232 March-Hugstetten）上，主動脈插管深度距主動脈瓣距離>2 mm，用95%O2-5%CO2預充K-H 液，設置灌流恒溫（36.5～37.5 ℃）、恒壓（8.65 kPa）后進行逆行非循環式灌注。Langendroff 離體心臟灌注模型制備成功標準為：在平衡灌注上述K-H 液10 min 內離體心臟恢復正常節律跳動且心率（heart rate，HR）>180 次/min。

1.2 實驗分組 將建立成功的離體心臟模型16個，通過數字表法隨機分成兩組，每組8 個。對照組（C 組）：持續灌注37 ℃K-H 液120 min；低溫缺血再灌注組（IR組）：持續灌注37 ℃K-H液30 min后，經主動脈根部注射4 ℃20 mL/kg Thomas 停跳液（mmol/L：NaCl 110、KCl 16.1、CaCl21.26、NaHCO39.99、MgCl 15.96、pH 值7.8）使心臟停搏后停灌K-H液60 min，心臟在停跳期間，被置于4 ℃K-H 液中，在心臟停灌的30 min 時，被追加半量4 ℃10 mL/kg Thomas 液經主動脈根部注射，停跳60 min 結束后經主動脈根部再灌注37 ℃K-H 液30 min。

1.3 微電極陣列測定心室肌前壁電傳導 持續灌注15 min 后，于左心室前壁放置64 矩陣式電極固定，放置參考電極于主動脈根部，隨后將電極導線與Mapping Lab 矩陣式電生理標測系統的信號輸入線連接，根據采集的局部場電位調整矩陣式電極與心臟貼合情況，記錄左心室局部的電傳導情況。分別采集持續灌注15 min（T0）、持續灌注30 min（T1）、再灌注15 min 即C 組持續灌注105 min（T2）、再灌注30 min 即C 組持續灌注120 min（T3）各時點的HR、傳導速度（conduction velocity，CV）和電傳導圖。分別記錄并觀察心臟復跳的時間和再灌注30 min 內心律失常發生的類型及其持續時間，參照文獻［8］行心律失常評分。再灌注結束立刻取左心室心肌組織置于液氮凍存，待心肌組織冰凍后轉至-80 ℃冰箱保存，另取心肌組織用多聚甲醛溶液（10 g/L）固定后放置于-4 ℃冰箱保存待后續檢測。

1.4 Western blot 法檢測STIP1 和Cx43 的表達取出-80 ℃冰箱中的心室肌組織，冰上研磨后加入裂解液（RIPA）提取各組心肌組織的總蛋白，通過BCA 試劑盒來檢測各組的總蛋白濃度后定量。在12%的SDS-PAGE 分離膠進行電泳后轉膜，洗膜后用5%脫脂牛奶封閉2 h，徹底清洗后分別用抗Cx43兔抗大鼠一抗（1∶1 000，Affinity 公司，美國），抗STIP1 兔抗大鼠一抗（1∶1 000，Affinity 公司，美國）4 ℃孵育過夜。第2 天加入標記為HRP 的二抗（1∶1 000，北京博奧森生物技術有限公司，中國）后，置于室溫振蕩器中孵育1 h，隨后ECL 顯影并應用全自動化學放光成像系統（Tanon-5200 上海天能科技有限公司，中國）曝光。通過Image J 圖像軟件分析各組條帶的灰度值，以GAPDH（1∶1 000，Bioword公司，美國）為內參并計算其相對的蛋白表達量。

1.5 免疫組化檢測Cx43 蛋白分布 取出-4 ℃冰箱中多聚甲醛溶液固定的心室肌組織，用EDTA 脫鈣液脫鈣，乙醇脫水并石蠟包埋后切片，用滅活內源性酶將切片放置在體積分數為20%H2O2的蒸餾水中5～10 min，隨后在枸櫞酸鹽緩沖液中浸泡，并用高壓鍋將其加熱沸騰修復抗原后，滴加5%牛血清白蛋白（BSA）的封閉液置于37 ℃的溫箱15 min，之后滴加稀釋的抗Cx43 的一抗（1∶100，Affinity 公司，美國），抗STIP1 的一抗（1∶100，Affinity 公司，美國）置于4 ℃溫箱過夜，次日滴加辣根過氧化物酶的二抗IgG1（1∶1 000，北京博奧森生物技術有限公司）置于37 ℃的溫箱中20 min 后，滴加免疫組化試劑SABC 染色，隨后用DAB 顯色劑顯色和蘇木精復染、然后將其脫水后透明并封片。置于全玻片的光學顯微鏡下（OLYMPUS SLIDEVIEW VS200，儀景通光學科技上海有限公司）觀察，其中陽性為棕黃色染色，陰性為不著色。用Image J 圖像分析軟件分析各著色蛋白的平均光密度值。

1.6 統計學方法 應用SPSS 19.0 軟件進行統計學分析，正態分布計量資料用（）表示，組間比較采用單因素方差分析，各時點組間比較用重復測量方差分析，P<0.05 差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組心律失常的發生情況 C 組：持續灌注期間無心律失常發生；IR 組：再灌注時8 例在30 s內均恢復心跳，發生心律失常有7 例，心律失常的發生類型、持續時間及心律失常的評分見表1。

表1 兩組大鼠心律失常及評分比較Tab.1 Comparison of arrhythmias and scores between two groups of rats ±s

表1 兩組大鼠心律失常及評分比較Tab.1 Comparison of arrhythmias and scores between two groups of rats ±s

注：IR 組心律失常發生率為87.5%

組別C 組IR 組例數8 8復跳時間（s）0 26.00±6.14室早（例）0 4室顫（例）0 3心律失常持續時間（min）0 8.74±8.63心律失常評分（分）0 3.13±2.64

2.2 兩組不同時點HR 及CV 的比較 C 組：各時點的HR 及CV 未見明顯的差異（P> 0.05），IR 組：T2與T3時點與T0與T1時點比較，其HR 及CV 出現明顯減慢（P<0.05），見表2、3。

表2 兩組大鼠不同時點HR 的比較Tab.2 Comparison of HR between two groupst rats at different times ±s，次/min

表2 兩組大鼠不同時點HR 的比較Tab.2 Comparison of HR between two groupst rats at different times ±s，次/min

注：與C 組比較，IR 組，T2、T3與T0、T1比較，*P<0.05

組別C 組IR 組P 值例數8 8 T0 290.4±7.7 302.6±10.9 0.269 T1 302.5±7.9 307.1±9.5 0.193 T2 307.8±7.9 237.0±23.5*0.003 T3 313.4±6.4 278.0±13.9*0.006

表3 兩組大鼠不同時點CV 的比較Tab.3 Comparison of CV between two groups rats at different times ±s，mm/ms

表3 兩組大鼠不同時點CV 的比較Tab.3 Comparison of CV between two groups rats at different times ±s，mm/ms

注：與C 組比較，IR 組，T2、T3與T0、T1比較，*P<0.05

組別C 組IR 組P 值例數8 8 T0 2.2±0.3 2.5±0.4 0.118 T1 2.4±0.2 2.5±0.1 0.281 T2 2.3±0.1 1.7±0.1*0.001 T3 2.9±0.1 1.9±0.1*0.001

2.3 不同時點左心室肌前壁傳導方向 Mapping Lab 64 矩陣式電生理指標測示可見，C 組：與T0時點相比，T1、T2、T3時點傳導方向未見改變。IR 組：與T0時點相比，T1時點傳導方向未見明顯改變，T2、T3時點傳導方向呈發散改變，見圖1。

圖1 兩組離體心臟不同時點傳導方向Fig.1 The conduction direction of two groups of isolated hearts at different time points

2.4 Western blot 檢測STIP1、Cx43 蛋白表達 與C 組比較，IR 組STIP1、Cx43 蛋白表達均明顯降低（P<0.05），見圖2。

圖2 兩組大鼠心室肌Cx43、STIP1 蛋白表達Fig.2 Expression of Cx43 and STIP1 proteins in ventricular muscle of two groups rats

2.5 左心室肌免疫組化檢測STIP1、Cx43 蛋白分布 免疫化學分析兩組間心肌組織內STIP1 和Cx43 陽性著色細胞的平均光密度。呈棕黃色顆粒狀為陽性著色，藍色表示心肌細胞的細胞核。與C 組比較，IR 組STIP1、Cx43 蛋白的陽性分布減少（P<0.05），另Cx43 蛋白的陽性分布有從端端轉為側側的鏈接情況，并呈凌亂排列，黑色箭頭為閏盤處的Cx43，紅色箭頭為Cx43 的側偏化。見圖3。

圖3 兩組大鼠心室肌免疫組化染色結果（×200）Fig.3 Results of immunohistochemical staining in ventricular muscle of two groups rats（×200）

3 討論

在體外循環下實施心內直視手術過程中，雖對心肌進行了低溫高鉀停跳液等保護措施處理，但心臟復跳時RA 仍是較常見的并發癥，使此類手術的成敗和患者預后常受到影響［9］。如何改善RA 的發生，是目前一直研究的熱點。筆者前期研究發現［2］：低溫缺血再灌注后，RA 的發生與Cx43表達減少有關，但對其機制不清，是否通過改善心肌缺血再灌注后Cx43 下調，從而減少RA 的發生，是本實驗預探究的問題。

位于心肌細胞閏盤（intercalated disc，ID）的Cx43 是哺乳動物心室肌細胞膜上表達最豐富一種特殊的通道連接蛋白［10-11］，大量文獻證實在RA 的發生發展中，Cx43 發揮著重要作用［12］。MAHONEY

等［13］研究報道，小鼠心肌細胞中心室CV 下降與Cx43 的表達下降有關。JUNG 等［14］研究認為，大鼠心臟的Cx43 基因被敲除后，可致心肌細胞間的電傳導出現障礙，引起惡性心律失常。李偉超等［15］研究認為七氟醚可穩定心肌細胞間Cx43 的分布與表達，減輕RA 的發生。另有研究［16］表明，初生肽蛋白最初由HSP40 和HSP70 形成的復合物募集，然后在STIP1 的幫助下轉移到HSP90 上完成折疊與組裝，而未折疊或錯誤折疊的蛋白易被泛素化降解［17］。在真核生物中，HSP90 作為伴侶蛋白與HSP70 一起控制蛋白質穩態［18］。WEI 等［19］研究發現異丙腎上腺素可通過抑HSP70/HSP40 的表達來促進Cx43 的表達，從而改善心肌肥厚。RODRIGUEZ-SINOVAS 等［20］發現HSP90 與Cx43 結合，通過TOM20 途徑促進Cx43 線粒體易位，發揮其心臟保護功能。Cx43 的折疊與組裝也依賴于HSP90［21-22］。STIP1（也稱為HSP70-HSP90 組織蛋白或HOP）作為熱休克蛋白HSP70 和HSP90 之間相互作用的介質，參與客戶蛋白形成成熟的結構蛋白［23］，另一項研究［24］表明，STIP1 可防止缺血介導的細胞凋亡，具有神經保護作用，XIN 等［6］發現大鼠心肌H9c2 細胞進行缺氧復氧處理后，STIP1的表達明顯降低。故本研究通過建立大鼠心臟Langendroff 離體灌注模型，采用Mapping Lab 矩陣式電生理標測系統檢測了心室肌表面傳導方向及速度，并應用Western blot 和免疫組化檢測STIP1及Cx43 蛋白的表達和分布情況，以探討低溫缺血再灌注心律失常的發生及Cx43 表達下調是否與STIP1 有關。

本研究結果表明，C 組8 只大鼠持續灌注期間均未發生心律失常，而IR 組，再灌注期間心律失常發生率較高，室早和室顫均有發生，該結果進一步證實再灌注心律失常是缺血再灌注較為常見的并發癥，與BERNIKOVA 等［25］研究發現一致。另IR 組在T2、T3的HR 和心室壁CV 均顯著減慢，并伴隨傳導方向的改變，該結果電傳導的改變可能因缺血再灌注后心肌損傷引起心肌細胞間縫隙連接通道的Cx43 減少使縫隙連接電阻增加所致。通過Western blot 和免疫組化進一步驗證，IR 組相比C 組，STIP1 及Cx43 蛋白水平的表達均明顯下調，另C 組中，可見Cx43 陽性著色的棕黃色顆粒在心肌閏盤處呈規律分布并表達量較多，而IR 組Cx43蛋白的分布出現從心肌細胞間的端端轉向側側連接的偏側化現象，說明低溫缺血再灌注后STIP1低表達可能影響了Cx43 的表達和分布，從而影響心肌細胞間離子通道功能，引起心室肌電傳導的改變。根據上述結果推測低溫全心缺血再灌注后，心室肌電傳導減慢、傳導方向改變，這可能與低溫缺血再灌注后心室肌STIP1 表達下調致Cx43表達減少有關。本研究結果為RA 中Cx43 的低表達提供了一個可能的解釋，其機制仍需進一步研究。

綜上所述，低溫缺血再灌注心律失常大鼠心室肌Cx43 下調可能與STIP1 的下調有關，STIP1 可能通過調節Cx43 表達影響低溫缺血再灌注后心室肌電傳導，STIP1 可能是探究再灌注心律失常的新靶點。